蛋白-蛋白互作研究方法-于凯_精品文档.pptx

1、蛋白蛋白-蛋白互作研究蛋白互作研究酵母双杂交技术酵母双杂交技术 酵母双杂交系统主要用于考察两种蛋白是否有相互作用，其原理是典型的真核生物转录因子，酵母双杂交系统主要用于考察两种蛋白是否有相互作用，其原理是典型的真核生物转录因子，如如GAL4GAL4、GCN4GCN4等都含有二个不同的结构域，即等都含有二个不同的结构域，即ADAD和和BDBD。这些转录因子只有同时具有这两个结。这些转录因子只有同时具有这两个结构域时才能起始转录。由此，设计不同的两个载体，一个含有构域时才能起始转录。由此，设计不同的两个载体，一个含有ADAD基因（假设为基因（假设为A A载体），另一个载体），另一个含有含有BDBD

2、基因（假设为基因（假设为B B载体）。载体）。一般将一个已知蛋白的基因连在一般将一个已知蛋白的基因连在B B载体上，作为诱饵载体上，作为诱饵(Bait)(Bait)，将未知蛋白的基因连在，将未知蛋白的基因连在A A载体上，载体上，将这两个载体都转到特定的酵母细胞内，看未知蛋白与已知蛋白是否有相互作用。如果两者有相将这两个载体都转到特定的酵母细胞内，看未知蛋白与已知蛋白是否有相互作用。如果两者有相互作用，那么就可以启动报告基因的转录，从而使这个酵母细胞能在选择培养基上显现出来或者互作用，那么就可以启动报告基因的转录，从而使这个酵母细胞能在选择培养基上显现出来或者生存下来；如果两者无相互作用，那么

3、报告基因就无法表达，那么这个酵母细胞就无法在择培养生存下来；如果两者无相互作用，那么报告基因就无法表达，那么这个酵母细胞就无法在择培养基上显现出来或者生存下来，如下图所示：基上显现出来或者生存下来，如下图所示：泛素酵母双杂交系统泛素酵母双杂交系统 由于由于酵母双杂交系统不能鉴定膜蛋白间的相互作用，因此又发展出了分离泛素酵母双杂交系统。该系统酵母双杂交系统不能鉴定膜蛋白间的相互作用，因此又发展出了分离泛素酵母双杂交系统。该系统的原理如下图所示：的原理如下图所示：将将泛素蛋白拆分为两个片段，即泛素蛋白拆分为两个片段，即C C端段端段(Cub)(Cub)和和N N端段端段(NubG)(NubG)，并

4、在，并在C C端段的端段的N N端接上一个端接上一个LexA-VP16LexA-VP16转录转录因子，此时它并不能激活基因转录（因为它被限制在了因子，此时它并不能激活基因转录（因为它被限制在了C C端段上，不能进入细胞核发挥作用）端段上，不能进入细胞核发挥作用）。将。将该该C C端段连端段连到一个膜蛋白上，将到一个膜蛋白上，将N N端段连接到另一个膜蛋白上。若两个膜蛋白有相互作用，那么两个膜蛋白在相互靠近端段连接到另一个膜蛋白上。若两个膜蛋白有相互作用，那么两个膜蛋白在相互靠近时会使泛素蛋白的时会使泛素蛋白的N N端段和端段和C C端段靠近结合，形成一个完整的泛素蛋白。此时泛素蛋白酶体会将这一

5、段被泛素端段靠近结合，形成一个完整的泛素蛋白。此时泛素蛋白酶体会将这一段被泛素标记的片段降解，那么连接标记的片段降解，那么连接C C端段的端段的LexA-VP16LexA-VP16转录因子掉落，即可进入细胞核启动标记基因的表达。转录因子掉落，即可进入细胞核启动标记基因的表达。酵母三杂交系统酵母三杂交系统 酵母酵母三杂交的原理与双杂交一样，只是三杂交的原理与双杂交一样，只是它研究的是两个蛋白和第三个成分间的相互它研究的是两个蛋白和第三个成分间的相互作用，通过第三个成分使两个蛋白相互靠近。作用，通过第三个成分使两个蛋白相互靠近。第三个成分可以是：蛋白、第三个成分可以是：蛋白、RNARNA或小分子，

6、或小分子，如下图所示：如下图所示：如如上上图图所所示示，在在加加入入第第三三种种成成分分前前，蛋蛋白白X X与与蛋蛋白白Y Y之之间间并并无无直直接接相相互互作作用用，因因此此无无法法使使BDBD和和ADAD靠靠近近，报报告告基基因因不不能能表表达达；当当加加入入第第三三种种成成分分后后，蛋蛋白白X X与与蛋蛋白白Y Y的的距距离离被被拉拉近近，BDBD和和ADAD靠靠近近，报报告告基基因因表表达达，从而可以被检测到。从而可以被检测到。噬菌体展示技术噬菌体展示技术 噬菌体噬菌体展示技术是将多肽或蛋白质的展示技术是将多肽或蛋白质的编码基因或目的基因片段克隆入噬菌体外编码基因或目的基因片段克隆入噬

7、菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，在阅读框正壳蛋白结构基因的适当位置，在阅读框正确且不影响其他外壳蛋白正常功能的情况确且不影响其他外壳蛋白正常功能的情况下，使外源多肽或蛋白与外壳蛋白融合表下，使外源多肽或蛋白与外壳蛋白融合表达，融合蛋白随子代噬菌体的重新组装而达，融合蛋白随子代噬菌体的重新组装而展示在噬菌体表面。被展示的多肽或蛋白展示在噬菌体表面。被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性，可以保持相对独立的空间结构和生物活性，以利于靶分子的识别和结合。肽库与固相以利于靶分子的识别和结合。肽库与固相上的靶蛋白分子经过一定时间孵育后，洗上的靶蛋白分子经过一定时间孵育后，洗去未结合的游离

8、噬菌体，然后以竞争受体去未结合的游离噬菌体，然后以竞争受体或酸洗脱下与靶分子结合吸附的噬菌体，或酸洗脱下与靶分子结合吸附的噬菌体，洗脱的噬菌体感染宿主细胞后经繁殖扩增，洗脱的噬菌体感染宿主细胞后经繁殖扩增，进行下一轮洗脱，经过进行下一轮洗脱，经过3 3轮轮5 5轮的轮的“吸附吸附-洗脱洗脱-扩增扩增”后，与靶分子特异结合的噬菌后，与靶分子特异结合的噬菌体得到高度体得到高度富集。富集。所得的噬菌体制剂可用所得的噬菌体制剂可用来做进一步富集有期望结合特性的目标噬来做进一步富集有期望结合特性的目标噬菌体。菌体。荧光共振能量转移技术荧光共振能量转移技术 FRET FRET，Fluorescence r

9、esonance energy transferFluorescence resonance energy transfer，即荧光共振能量转移技术。该技术的原理是用一种波长的光，即荧光共振能量转移技术。该技术的原理是用一种波长的光激发某种荧光蛋白后，它释放的荧光刚好又能激发另一种荧光蛋白，使其释放另一波长的荧光，如下图所激发某种荧光蛋白后，它释放的荧光刚好又能激发另一种荧光蛋白，使其释放另一波长的荧光，如下图所示：示：以以下下图图为为例例，若若要要利利用用FRETFRET检检测测两两种种蛋蛋白白是是否否有有相相互互作作用用，需需将将两两种种蛋蛋白白的的基基因因分分别别与与这这两两种种荧荧光光

10、蛋蛋白白的的基基因因融融合合，并并在在细细胞胞内内表表达达出出两两种种融融合合蛋蛋白白。然然后后只只需需用用紫紫外外光光对对CFPCFP进进行行激激发发，并并检检测测GFPGFP是是否否放放出出绿绿色色荧荧光光。如如果果能能检检测测到到绿绿色色荧荧光光，那那么么可可以以说说明明这这两两种种蛋蛋白白可可能能有有相相互互作作用用；反反之之，则则是是这这两两种种蛋蛋白白没没有相互作用。有相互作用。免疫共沉淀免疫共沉淀 免免疫疫共共沉沉淀淀是是探探测测活活体体细细胞胞内内蛋蛋白白间间的的相相互互作作用用的的一一门门技技术术。它它的的原原理理是是当当细细胞胞在在非非变变性性条条件件下下被被裂裂解解时时，

11、完完整整细细胞胞内内存存在在的的许许多多蛋蛋白白质质蛋蛋白白质质间间的的相相互互作作用用被被保保留留了了下下来来。如如果果用用蛋蛋白白X X的的抗抗体体免免疫疫沉淀沉淀X X，那么与，那么与X X在体内有相互作用的蛋白在体内有相互作用的蛋白Y Y也能沉淀下来。也能沉淀下来。Co-IPCo-IP的的原原理理如如下下图图所所示示，首首先先从从细细胞胞中中提提取取蛋蛋白白质质，获获得得蛋蛋白白提提取取液液，并并将将其其与与抗抗体体孵孵育育，使使抗抗体体与与蛋蛋白白X X结结合合。将将预预处处理理过过的的protein protein G G琼琼脂脂糖糖珠珠（SepharoseSepharose）加加

12、入入到到抗抗体体与与蛋蛋白白提提取取液液的的孵孵育育液液中中反反应应，使使抗抗体体与与protein protein G G结结合合。通通过过离离心心将将琼琼脂脂糖糖珠珠沉沉降降到到管管底底，去去除除上上清清液液，然然后后再再用用缓缓冲冲液液将将琼琼脂脂糖糖珠冲洗数次，最后用珠冲洗数次，最后用western blotwestern blot（或（或SDS-PAGESDS-PAGE）进行检测。）进行检测。Pull-downPull-down技术技术 Pull-downPull-down，即即蛋蛋白白沉沉降降技技术术，它它是是建建立立在在蛋蛋白白质质亲亲和和层层析析以以及及特特异异的的配配体体（如

13、如GSHGSH或或者者镍镍）基基础础上上的一种检测蛋白质间相互作用的分析方法。的一种检测蛋白质间相互作用的分析方法。以以下下图图为为例例，将将GSTGST的的基基因因与与蛋蛋白白X X的的基基因因融融合合，表表达达出出融融合合蛋蛋白白。将将该该融融合合蛋蛋白白的的溶溶液液过过带带有有GSHGSH配配体体的的层层析析柱柱，那那么么这这一一融融合合蛋蛋白白就就能能结结合合在在配配体体上上，然然后后将将待待测测蛋蛋白白的的溶溶液液过过柱柱，并并让让其其与与融融合合蛋蛋白白反反应应一一段段时时间间。接接着着开开始始进进行行洗洗脱脱。如如果果待待测测蛋蛋白白与与蛋蛋白白X X无无相相互互作作用用，那那么

14、么在在开开始始清清洗洗的的时时候候就就会会被被洗洗下下来来；如如果果在在用用洗洗脱脱液液洗洗脱脱后后才才能能在在收收集集到到的的样样品品中中发发现现待待测测蛋蛋白白（以以及及蛋蛋白白X X），说说明明待待测测蛋蛋白白与与蛋白蛋白X X可能有相互作用。可能有相互作用。双分子荧光互补技术双分子荧光互补技术 利利用用绿绿色色荧荧光光蛋蛋白白及及其其突突变变体体的的特特性性作作为为报报告告基基因因，将将荧荧光光蛋蛋白白分分割割成成两两个个不不具具有有荧荧光光活活性性的的分分子子片片段段N N端端和和C C端端，再再分分别别与与目目标标蛋蛋白白连连接接并并融融合合表表达达，若若连连接接的的两两个个目目标

15、标蛋蛋白白发发生生相相互互作作用用，使使得得两两个个荧荧光光分分子子片片段段N N和和C C端端在在空空间间上上靠靠近近，重重新新形形成成有有活活性性的的荧荧光光基基团团，在在一一定定的的激激发发波波下下，能能够够观观察察到到相相应应的的生生物物荧荧光光，定定能能够够确确定定目目标标蛋蛋白白相相互互作作用用的的时间，位置，强弱，稳定性等。时间，位置，强弱，稳定性等。Far western blotFar western blot Far Far western western blotblot是是基基于于western western blotblot发发展展而而来来，其其原原理理如如下下图图所所示示。将将样样品品蛋蛋白白用用非非变变性性的的PAGEPAGE胶胶分分离离，然然后后转转膜膜、封封闭闭、洗洗膜膜，加加入入待待测测蛋蛋白白，使使其其与与已已在在膜膜上上的的样样品品蛋蛋白白进进行行相相互互作作用用。接接着着加加入入带带有有标标记记（如如HRPHRP）的的待待测测蛋蛋白白的的抗抗体体反反应应，最最后后进进行行显显色色（如如加加入入HRPHRP的底物），观察实验结果。的底物），观察实验结果。