基因表达的分析技术.docx

1、基因表达的分析技术第二篇细胞的遗传物质 第三章基因表达的分析技术 生物性状的表现均是通过基因表达调控实现的。对基因结构与基因表达调控进行研究，是揭示生命本质的必经之路。在基因组研究的过程中，逐步建立起一系列行之有效的技术。针对不同的研究内容，可建立不同的研究路线。第一节 PCR技术聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）技术是一种体外核酸扩增技术，具有特异、敏感、产率高、快速、简便等突出优点。PCR技术日斟完善，成为分子生物学和分子遗传学研究的最重要的技术。应用PCR技术可以使特定的基因或DNA片段在很短的时间内体外扩增数十万至百万倍。扩增的片段可以直接通过电

2、泳观察，并作进一步的分析。一、实验原理PCR是根据DNA变性复性的原理，通过特异性引物，完成特异片段扩增。第一，按照欲检测的DNA的5和3端的碱基顺序各合成一段长约1824个碱基的寡核苷酸序列作为引物（primer）。引物设计需要根据以下原则：引物的长度保持在1824bp之间，引物过短将影响产物的特异性，而引物过长将影响产物的合成效率；GC含量应保持在4560%之间；5和3端的引物间不能形成互补。第二，将待检测的DNA变性后，加入四种单核苷酸（dNTP）、引物和耐热DNA聚合酶以及缓冲液。通过95变性，在进入较低的温度使引物与待扩增的DNA链复性结合，然后在聚合酶的作用下，体系中的脱氧核苷酸与

3、模板DNA链互补配对，不断延伸合成新互补链，最终使一条DNA双链合成为两条双链。通过变性（9295）复性（4060）引物延伸（6572）的顺序循环20至40个周期，就可以得到大量的DNA片段。理论上循环20周期可使DNA扩增100余万倍。二、PCR技术的分类及其应用范围1逆转录PCR 逆转录PCR（RT-PCR）是将RNA反转录和PCR结合而建立起来的一种PCR技术。其包括两个过程：通过逆转录合成cDNA和对之进行PCR扩增。其中，用于逆转录的RNA模板要求完整，并且不含DNA和蛋白质等杂质。逆转录PCR可以检测低于10个拷贝的特异RNA。2原位PCR 原位PCR技术（in situ PCR）

4、是将检测细胞内特定基因的原位杂交技术和聚合酶链式反应(PCR)法相结合的方法。它是扩增组织切片或细胞内微量的基因，并将其检测出来的技术。3甲基化PCR 甲基化PCR与常规PCR在原理上一致，但在引物的设计以及DNA样本的处理上有所不同。针对扩增的DNA甲基化区域，一般需要设计三条引物：正常序列引物、甲基化对应引物以及DNA序列修饰引物。通过三组PCR，判断DNA序列中甲基化的存在与否。4实时荧光定量PCR 实时荧光定量PCR（real time quantitative PCR）是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现实时监测整个PCR进程，并能对起始模板进行定量分析。RT-PC

5、R需要荧光探针参与，常用的探针可分为以下几类：1）内掺式染料SYBR Green I；2）序列特异性探针：Taqman， Molecular Beacons， Dual Probes； 3）特异性引物： Amplifluor（Intergen）， Lux引物， Scorpion； 4）阴阳探针。荧光定量PCR不仅可以测定靶DNA的含量，用于临床诊断，而且可以应用不同的探针检测基因突变和SNP分析。5多重引物PCR 多重引物PCR是在同一扩增体系加入多对引物，同时扩增多个基因片段的PCR技术。其技术的优点是通过一次扩增可诊断几种疾病或同一疾病的几个不同的基因突变。6随机引物PCR 多态DNA的随

6、机扩增 （random amplication of polymorphic DNA，RAPD）或随机引物PCR（arbitrarily primed PCR，AP PCR）是应用基因组DNA中单一、随机序列的短引物，通过PCR扩增产生一组代表种或株特性的DNA片段。因此，RAPD是获得种或株的DNA分子指纹图谱的通用方法。7套式PCR 又称巢式PCR，是对靶DNA片段设计两套引物系统，第1套引物扩增1530个循环，再用扩增的DNA片段内设定的第2套引物扩增1530个循环，可使目的DNA序列得到高效扩增。套式引物PCR可减少引物的非特异性扩增，增加特异性扩增,减少PCR的误诊率。8突变体构建P

7、CR（1）应用载体构建突变体的PCR：原理是将野生型目的基因的cDNA插入到克隆载体上，设计携带突变点的一对引物，对克隆载体进行扩增，然后将经过PCR而获得的DNA转染感受态细胞，并用筛选培养基筛选转染的细胞，获得的克隆可以通过细胞扩增，获得大量的携带突变体DNA的载体。（2）应用内外引物构建突变体的PCR：载体构建突变体PCR是构建点突变的高效方法，但不适用于缺失、易位、倒位等突变方式。内外引物构建突变体PCR可以克服载体构建突变体PCR的不足。其原理是合成两对引物，即一对扩增整个cDNA的外引物和一对包含突变序列并部分互补的内引物。分别以一个外引物与一个内引物进行PCR，可以获得两条DNA

8、序列，该两条DNA在突变位点存在部分重合。去除引物，将两条DNA变性，而后进行复性，将可导致两条DNA重合部分互补，并在Taq酶的作用下补齐3末端。用外引物扩增DNA，将获得含有突变的cDNA。PCR引物的设计是PCR成功的关键，必须遵守以下原则：确定扩增区域及其长度；确定引物的值；避免引物自身二聚体、引物间二聚体和发夹结构等二级结构的形成；具有扩增的特异性。三、应用PCR技术检测性别决定基因（一）实验原理SRY基因又称睾丸决定基因（Testis determining factor），位于人类Y染色体，在X染色体上没有相应的同源节段。根据SRY基因序列合成一对特异性引物，通过PCR反应检查患

9、者有无此基因相应扩增片段，以及患者的表型可对患者的真正性别和病因作出判断，另外对胎儿性别的产前诊断有利于防止性连锁遗传病患儿的出生。（二）实验准备1. 材料 人体静脉血、注射器、微量加样器及吸头、1.5ml及0.5ml Eppendorf管。引物序列：（SRY1：5-GATCAGCAAGCAGCTGGGATACCAGTG-3；SRY2：5-CTGTAGCGGTCCCGTTGCTGCGGTG-3）2. 试剂（实验中有关试剂和器材要进行高压灭菌处理）生理盐水、细胞裂解液（50mmol Tris-HCl，pH 8.0；1mmol Na2 EDTA ，pH 8.0；0.5% SDS；0.1mmol N

10、aCl）、10mg/ml蛋白酶K 、20%SDS 、水饱和酚(1mol/L Tris-HCl 抽提)、酚：氯仿：异戊醇（25241）、氯仿：异戊醇（241）、8mol/L 醋酸钾、无水乙醇、70%乙醇、TE（pH8.0）（10 mmol/L Tris-HCl，pH8.0；0.1 mmol/L Na2EDTA，pH8.0）、10buffer（500mmol/L KCl、100mmol/L TrisHCl，pH8.3，室温15mmol/L MgCl2；0.1% 明胶）、4dNTP（1 mmol/LdATP，1 mmol/L dCTP，1 mmol/L dGTP，1 mmol/L dTTP）、Taq

11、 酶（1U/l）、引物溶液（10pmol/l）、5TBE缓冲液（1000ml）（54g Tris碱，27.5g硼酸，20ml 0.5mol/L EDTA，pH8.0）、DNA分子量标记、2%琼脂糖凝胶、载样缓冲液（100ml）（0.2%溴酚蓝，50%蔗糖，10mol/L NaOH 12滴）、10mg/ml溴化乙锭溶液（戴手套谨慎称取溴化乙锭约200mg，放入棕色瓶中，加重蒸水20ml，溶解后置4冰箱保存备用。使用时100ml琼脂糖凝胶中加5l 10mg/ml 溴化乙锭溶液，终浓度为0.5g/ml）。3. 实验仪器 PCR扩增仪、超净工作台、高速台式离心机、电泳仪及电泳槽、紫外检测仪。（三）实验

12、步骤1. DNA模板制备方法：取毛发12根，尽量剪碎，于1520ml生理盐水中100水浴10min，离心取上清备用。方法：外周血提取DNA（1）白细胞的分离抗凝血用12倍的生理盐水或磷酸缓冲的生理盐水（PBS）稀释并混合。在50ml离心管中加入1倍体积淋巴细胞分离液（上海试剂二厂），在上面仔细铺一层2倍体积已稀释的血液。室温以2000rpm离心15min20min，红细胞应沉于管底，而白色的淋巴细胞应分布于上层血浆与下层淋巴细胞分离液的界面。吸弃血浆，小心吸取淋巴细胞层，直至把淋巴细胞转移完全。用生理盐水或PBS洗淋巴细胞二次。最后得到的淋巴细胞沉淀，可立即用于DNA的提取，或冻存于超低温冰箱

13、中，直至使用。（2）DNA的提取（见本篇第一章）。2. PCR反应体系配制及扩增（1）PCR反应总体积50l，取一洁净的0.5ml Eppendorf管，依次加入：10buffer 5ldNTP 5l引物1 2.5l引物2 2.5l模板DNA 10lTaq DNA 2Ud3H2O 补足50l（2）将反应管放入PCR扩增仪上进行聚合酶链反应，条件为94变性10min后，94 45s、55 45s、72 90s共30个循环；最末一个循环紧接72再延伸10min。3. 扩增产物电泳检测取PCR扩增产物10l与2l上样缓冲液混合后，与DNA Marker同时进行琼脂糖凝胶电泳。电泳结束，取出凝胶置于紫

14、外检测仪上观察。（四）注意事项1. 实验过程应设阴性及阳性模板对照。2. PCR常见问题及解决办法（1）没有得到预期的PCR扩增产物：确证聚合酶的活性是否正常；DNA解链是否充分，变性温度是否准确；引物组成是否正确，有无二级结构组成；反应系统有无蛋白酶或核酸酶存在，使聚合酶或模板及产物降解。（2）有非特异性扩增产物出现：增加复性温度，缩短复性时间及延伸时间；降低引物和Taq DNA聚合酶的用量；调整Mg2+浓度；减少热循环次数。（3）形成了引物二聚体：检查引物的序列，特别是3端是否有互补区；增加引物的长度；调整引物与模板浓度，使模板比例增高，降低引物使用浓度；增加复性温度；减少热循环次数。（4

15、）PCR产物在凝胶电泳中成片状：减少Taq DNA聚合酶的用量；增加复性温度，减少复性时间及延伸时间；降低Mg2+浓度；减少循环次数；从凝胶中回收与预期分子量相同的DNA，再次进行PCR反应。3. 实验安全溴化乙锭是强诱变剂，并有中度毒性，取用含有这一染料的溶液时务必戴上手套，这些溶液经使用后，应进行净化处理。第二节单链构象多态性（SSCP）分析单链构象多态性（singlestrandconformationpolymorphism，SSCP）分析是利用DNA或RNA单链构象具有多态性的特点，结合PCR进行基因检测的一种分析技术，称为PCR-SSCP技术。其基本原理为：DNA或cDNA在变性后

16、，由于序列的不同而导致单链DNA的空间结构各异。在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的过程中，不同空间结构的单链DNA迁移率存在差异。因此，PCR-SSCP可以用来鉴定单核苷酸的差异。该技术已被广泛用于癌基因和抗癌基因变异的检测、遗传病的致病基因分析以及基因诊断、基因制图等领域。PCR-SSCP的敏感性随核苷酸片段长度的增加而降低，在检测200个核苷酸片段中单个碱基的突变时，检出率高达90%；而400个核苷酸片段单个碱基突变的检出率为80%。因而，在实验中要将大片段分成较短的片段。哺乳动物基因组中的外显子一般小于300个碱基，可以使用内含子引物直接对目的片段进行PCR-SSCP。一、PCR-SSCP技术

17、的基本程序PCR-SSCP技术的基本程序为：首先PCR扩增特定靶序列，然后将扩增产物变性为单链，进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，DNA单链的迁移率除与DNA链的长短有关外，更主要的是取决于DNA单链所形成的构象。在非变性条件下，DNA单链可自身折叠形成具有一定空间结构的构象。这种构象由DNA单链碱基决定，其稳定性靠分子内局部顺序的相互作用（主要为氢键）来维持。相同长度的DNA单链其顺序不同，甚至单个碱基不同，所形成的构象不同，电泳迁移率也不同。PCR产物变性后，单链产物经中性聚丙烯酰胺凝胶电泳，靶DNA中含单碱基置换，或数个碱基插入或缺失等改变时，因迁移

18、率变化会出现泳动变位，从而可将变异DNA与正常DNA区分开。由此可见，PCR-SSCP分析技术是一种DNA单链凝胶电泳技术，它根据形成不同构象的等长DNA单链在中性聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移率变化来检测基因变异。二、实验准备（一）试剂甲酰胺加样缓冲液（95%甲酰胺，20mmoL/L EDTA，0.05%溴酚蓝和0.05%二甲苯青）、6%丙烯酰胺（丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺=491）、10%甘油、0.5TBE、10%醋酸、2%硝酸银、显影液（3%无水碳酸钠，0.2%甲醛，0.02%硫代硫酸钠）、去离子水（二）实验仪器PCR扩增仪、超净工作台、高速台式离心机、电泳仪及电泳槽、紫外检测仪。三、实验步骤

19、1目的片段的PCR及其产物的变性 根据扩增的目的片段制定PCR扩增条件。PCR扩增结束后，用5倍体积的甲酰胺加样缓冲液混合。将样品于95变性5min并直接置于冰浴上。2电泳 电泳胶有两种：聚丙烯酰胺凝胶由6%丙烯酰胺、10%甘油和0.5TBE组成。上样5l，在室温下0.5W/cm，用0.5TBE电极缓冲液电泳2.5h以上；聚丙烯酰胺凝胶由6%丙烯酰胺和0.5TBE组成。上样5l，在4下0.5 W/cm，用0.5TBE电极缓冲液电泳2.5h以上。3染色 取下凝胶，置10%醋酸固定液中30min，再以去离子水漂洗3次（2min/次），加入2%硝酸银染液染色20min后，去离子水洗胶20s，凝胶置显

20、影液中显色510min，以10%醋酸终止反应，漂洗及分析结果。4结果判读 SSCP结果判读的标准是正常个体由于等位基因相同，仅存在两条单链，因此在凝胶上多出现两条带，有时由于两条链接近可形成一条带，或一条单链有两种空间结构可形成三条带；突变个体由于等位基因不同，可以形成四种不同的单链，因此在凝胶上多出现四条带，有时也可形成五条带。如果存在复杂突变，可以形成超过5条的带纹（图2-3-1）。图2-3-1 SSCP结果图（1为未变性的PCR产物;2、4、6、8、9为正常个体；3、5、7为突变携带者）四、注意事项1. 核酸片段的大小是决定检测敏感性的首要因素： 用于SSCP分析的核酸片段越小，检测的敏

21、感性越高。对于大于400bp的PCR产物可采用以下两种策略进一步处理：用限制性内切酶对PCR产物进行消化，产生较小片段；通过改变引物的位置和增加PCR扩增次数，缩短PCR产物。2. 聚丙烯酰胺凝胶孔径的大小是影响检测敏感性的另一个重要的因素：一般情况下，丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺的比例为491。可以选用10%甘油在室温或无甘油在4条件下进行电泳。3. 游离引物：游离引物可能同 PCR产物结合而改变其泳动率，即使游离引物量为6nM都有明显影响。因此，应尽可能除去游离引物。可以采用不对称引物扩增方法，尽可能消耗多余的引物。也可以运用过柱或磁性球方法纯化PCR产物。或者是稀释PCR产物，减少游离引物的

22、干扰。4. 低浓度变性剂：凝胶中加入低浓度的变性剂，如510甘油、5尿素或甲酸胺、10二甲亚砜（DMSO）或蔗糖等有助于提高敏感性，可能是因为轻微改变单链DNA的构象，增加分子的表面积，降低单链DNA的泳动率。但有些变异序列却只能在没有甘油的凝胶中被检出。因此，对同一序列使用23种条件做SSCP，可能提高敏感性。5. 电泳温度：一般认为保持凝胶内温度恒定是SSCP分析最关键的因素，温度有可能直接影响DNA分子内部稳定力的形成及其所决定的单链构象，从而影响突变的检出。室温下电泳适于大多数情况，但由于在电泳时温度会升高，为确保电泳温度相对恒定，应采取以下措施：减少凝胶厚度，降低电压，有效的空气冷却

23、或循环水冷却等。6. 凝胶的长度： 可用测序板进行SSCP分析，凝胶板长度在40cm以上。7. 凝胶浓度及厚度： 凝胶浓度很重要，一般使用58的凝胶，凝胶浓度不同，突变带的相对位置也不相同，如果在进行未知突变种类的SSCP分析时，最好采用两种以上凝胶浓度，这样可以提高突变种类的检出率。凝胶的厚度对SSCP分析也很重要，凝胶越厚，背景越深，在上样量较多的前提下，尽量使凝胶越薄越好。8. 假阴性：一般认为，如没有污染，PCRSSCP分析不存在假阳性结果，但可能出现假阴性结果，后者是由于点突变引起的空间构象变化甚微，迁移率相差无几所致，尤其是点突变发生在扩增片段的两端时。如果有阳性和阴性对照，结果可

24、以重复确定的突变带是可信的，如果没有阳性对照，应经测序来确定其是否为突变带。由于PCRSSCP的不足之处主要是可能检出假阴性结果。应通过设置阳性对照，摸索电泳条件，假阴性结果在很大程度上是可以避免的。但对未知基因变异的检测，假阴性结果就难以百分之百地消除。9. 结果分析：单链凝胶电泳时，互补单链迁移率不同，一般形成两条单链带。PCR产物进行单链凝胶电泳之前，通过加热变性产生单链。如变性不彻底，残留双链亦可形成一条带因此，PCRSSCP分析结果至少显示三条带。但是，由于一种DNA单链有时可形成两种或多种构象，检出三条或四条单链带就不足为奇。 第三节基因表达谱研究技术人类基因组大约有30000个左

25、右的结构基因，其中在任一细胞中表达的基因仅占总数的15%。管家基因在任何生长发育阶段以及生理状态下均有所表达，而奢侈基因的表达则有组织特异性、时空特异性以及调节特异性。两者同时决定了包括发育与分化、内环境稳定(homeostans)、对逆境的反应、细胞周期调控、衰老乃至程序化死亡等整个生命过程。基因表达的变化是调控生命活动过程的核心机制。通过比较同一类或不同种类细胞在不同生理条件下或在不同生长发育阶段的基因表达差异，可为分析生命活动过程提供重要信息。因此，基因的表达谱研究是揭示细胞生长、细胞分化、组织器官建立以及细胞衰老死亡的重要方向。研究基因表达谱的方法主要有基因表达系列分析、基因芯片技术、

26、差异显示PCR法以及消减杂交技术等（表2-3-1）。表2-3-1 不同基因表达谱研究技术的比较方法技术与原理优点缺点基因表达系列分析克隆、DNA测序不需特殊设备、实验成本较低、测序效率较高、可获得新基因。克隆步骤较多、基因片段有可能丢失、提供信息有限。基因芯片分子杂交操作简便、不需测序。实验费用高、需要特殊设备；存在假阳性和假阴性；图象和数据分析工作量较大。差异显示PCR电泳、分子杂交、PCR技术、DNA测序不需特殊设备、可展示所有基因、差异表达基因片段、可获得新基因。方法繁琐、假阳性高、片段短而靠近mRNA3末端。代表性差异分析技术克隆、PCR技术、分子杂交mRNA需求少、特异性高酶切连接步

27、骤多、cDNA存在丢失现象、获得的片段是酶切片段。抑制消减杂交技术PCR、克隆、测序特异性高低丰度cDNA存在丢失、不能合成全长cDNA。基于PCR的消减杂交技术分子杂交、PCR、克隆、测序设备要求不高、操作简便、可获得新基因。研究经费高、不能同时展示所有的基因和差异基因、存在一定的假阳性、需大量测序。一、SAGE技术（一）概述基因表达系列分析（serial analysis of gene expression，SAGE）是由Velculescu等建立并用以分析基因组表达的方法，可以在未知目的基因的前提下，分析来自一个细胞的全部转录本信息；对已知或未知基因表达进行定性和定量分析；假阳性率低，

28、可重复性强。随着SAGE技术的日益成熟，在基因表达方面已经得到了广泛的使用。（二）SAGE的原理mRNA的3末端特定部位存在可以标识其特异性的标签（tag），其长度一般在1014个核苷酸之间，检测tag可以获得该mRNA的表达信息。SAGE技术主要是基于以上原理，通过获得tag从而确定基因的表达情况。其次，分离获得的tag可以通过串联连接克隆于载体上，以便测序，提高了分析效率。同时，根据同一tag重复次数，可以判断转录本的表达水平。SAGE技术包括以下几个步骤：提取RNA，并将其与携带生物素标记的oligodT混合，以mRNA为模板，经逆转录得到双链cDNA；锚定酶(anchoringenzy

29、me，AE) 酶切生物素标记的双链cDNA。锚定酶要求至少在每一种转录本上有一个酶切位点，一般4碱基限制性内切酶能达到这种要求。Nia 是一种广泛的限制性内切酶，平均每250bp就存在一个Nia 识别位点CATG，因此是理想的SAGE锚定酶；应用带有亲和素的磁珠分离生物素标记的cDNA3端酶解片段，获得mRNA polyA尾部与最近的酶切位点之间的片段；将分离得到的 cDNA酶切片段等分为A和B两部分，分别与设计好的两种连接子A或B连接。连接后的DNA片段在3端包含有S型内切酶（如BsmF ）的识别位点；用S型内切酶（又称标签酶）消化以上步骤获得的连接产物，并去除与磁珠相连的DNA片段。S型内

30、切酶的作用方式以标签酶BsmF 为例，BsmF 的识别和切割位点为5-GGGAC（N）10-3/3-CCCTG（N）14-5，因此产生连有接头的短cDNA片段，长为10碱基，即释放的cDNA标签，不同的标签酶获得的碱基数不同，如Fok I可以获得9碱基的标签；利用Klenow片段或T4 DNA聚合酶消化产生的粘性末端，混合两个cDNA池的短cDNA片段，并连接成100bp的双标签（ditag）以引物A和B通过PCR扩增双标签，扩增产物含有2个尾尾相接的标签(一个Ditag)，其侧翼有锚定酶切割位点；利用锚定酶酶切扩增产物，分离纯化以收集标签(Ditag)； 将每3050个双标签连接起来，并克隆

31、到pZErO-1载体中，建立SAGE文库；对插入到pZErO-1载体中的双标签序列进行测序，并利用相应的应用软件进行结果分析，确定原始序列中每个标签序列、数目以及发生率。同时可以与NCBI的SAGEmap、GenBank以及EST公众数据库进行比对，找出标签与基因及EST之间的对应关系，对标签进行定性（图2-3-2、2-3-）。图 2-3-2 通过SAGE获得的DNA片段图2-3-3 SAGE的测序图（三）SAGE技术的应用1全基因组转录图谱的建立 早在1995年，Velculescu等选择BsmFI和Nia 分别作为标签酶和锚定酶对胰腺组织中1000多个标签进行手工测序，发现95%以上的标签能够代表唯一的转录物。2001年，Caron等将公众SAGE数据库的231万标签以及他们自己从神经母细胞瘤分离到的16万个标签按照组织来源分成12组，并经过计算，将这12组不同组织的标签与已做染色体定位的基因进行比对，获得了可以反映基因表达丰度的全基因组转录图谱，并发现染色体上存在高表达的基因簇区域（region of increased gene expression，RIDGE）。结果提示，基因组结构是高度有序的，一个典型的RIDGE在1CR（centiary）的染色体长度上通常含有