抗白血病天然香精油研究.docx

1、抗白血病天然香精油研究抗白血病天然香精油研究 李化，姚响，冯罕博，吴朝希摘 要 山苍子主要分布在我国，是重要药用植物和香料经济植物；柠檬醛是其精油主要组分。虽然该精油范围广，但未见文献记载其具有抗白血病功效。近年国外报道，柠檬醛能诱导早幼粒白血病HL-60细胞凋亡，但机理不明。本项目拟采用MTT法将山苍子油与多种天然植物香精油进行抗白血病细胞生物活性比较；拟采用生物化学与生物物理方法研究不同浓度的柠檬醛（山苍子油的主要成分）对白血病细胞株（K562、HL-60）生长、繁殖及代谢的影响。另外通过观察拉曼指纹图谱变化，研究表征柠檬醛抗白血病功效的最佳参数。以此为拓展山苍子油在中药领域应用奠定理论基

2、础。关键词 山苍子油；柠檬醛；白血病 The Research of Anti-leukemia Natural Essential OilsAbstract：Cubeba, which mainly distribute in our country, is a kind of important medicinal plants and spices commercial crop.Citral is the main component of its essential oils . Although the Litsea cubeba oil is widely used in med

3、icine, we cant find any records about its efficacy of Anti-leukemia in literatures. In recent years,it was found that the Citral has the potency of inducing promyelocytic leukemia HL-60 cell apoptosis but its mechanisms is not revealed yet. The project planed to adopt the method of MTT to compare th

4、e biological activity in anti-leukemia between Litsea cubeba oil and several other natural plant essential oils.It also use the methods of biochemistry and biophysics to study the effects of different concentrations of citral(the major components of Litsea Cubeba oil) in the growth, reproduction and

5、 metabolism of Leukemia cell line (K562, HL-60).In addition,we also focus on the changes of the cells Raman fingerprint to find the optimal parameters of citral in its efficiency of anti-leukemic. The results will provide a theoretical foundation of Litsea cubeba oil for expanding its fields in the

6、application of Chinese traditional medicine.Keywords：Litsea cubeba oil；Citral；Leukemia目 录一、立项依据及研究进展 1二、研究内容 32.1白血病细胞株的培养 32.2细胞生长曲线、培养细胞起始浓度和药物作用时间的确定 32.3 MTT法对不同香精油抑制白血病细胞生长作用比较 32.4 柠檬醛对白血病细胞代谢酶活性的影响 42.5 流式细胞术研究柠檬醛对白血病细胞诱导凋亡作用 42.6 柠檬醛对白血病细胞表面Zeta电位和Kc的影响 52.7 激光拉曼显微散射技术实时无扰监测柠檬醛与K562细胞的作用过程 5

7、三、实验结果及其分析 73.1生长曲线绘制、细胞培养起始浓度及药物作用时间的确定 73.2.不同香精油对K562细胞的生长增殖能力影响 73.3 柠檬醛对白血病细胞代谢酶活性的影响 83.4 柠檬醛对HL-60和K562细胞抑制作用的途径不径相同 93.5 柠檬醛具有削弱白血病细胞表面负电位的作用 113.6 柠檬醛对白血病细胞膜流动性具有显著损伤效应 113.7 白血病细胞的靶分子性质分析 12四、研究成果 13五、总结与展望 14六、致谢 14七、参考文献 15一、立项依据及研究进展在世界范围内抗肿瘤药物的研究已逐步转向天然药物。天然植物精油及其挥发性单体独特的理化性质、生物学活性和特殊疗

8、效，尤其是长期使用无遗传风险的巨大优势，使得人们从植物精油中寻找治疗人类疑难疾病药物并深究其机理的兴趣越来越浓1-2。白血病发病率和死亡率居儿童及青少年恶性肿瘤首位，且发病率呈逐年增加趋势。因此，深入开展对白血病致病机制研究并开发新型、高效、价廉的治疗药物，不仅是从事相关专业研究人员的当务之急，而且是关系到儿童和青少年健康大事。从目前来看采用纯中药医治白血病堪为上策。从天然植物中提取的香精油资源丰富，来源广泛，价格低廉，若开发成抗白血病药物，将可使大多数低收入患者受益。山苍子Litsea cubeba（Lour）Pers主要分布在我国，是重要的药用植物和香料经济植物。山苍子果实既可入药，又被用

9、作提取精油的主要原料。我国山苍子精油生产和出口量居世界第一，其主要成分柠檬醛含量高达65-80%，易提纯，只要控制好温度和蒸汽压，即可获得96.3%以上的纯度。文献记载山苍子精油不仅能治疗胃病、关节炎、溃疡等多种疾病，而且能用作合成医药和化妆品的原料、食品及日用化工产品的增香剂及农产品的防霉保鲜剂。大量研究表明，柠檬醛为多用途与功效山苍子精油的有效单体。毒理学研究表明，无论是山苍子精油还是柠檬醛单体，对动物和人体均无急性和累积性毒害，毒性较低3-4。山苍子精油药用范围虽广，但抗白血病功效未见文献报道。近五年来，国外研究表明，含柠檬醛精油及单组分柠檬醛具有显著特异性诱导人白血病细胞凋亡活性，但机

10、制仍不明晰5-7。总之，山苍子精油不仅资源丰富，而且提取高纯度柠檬醛（含量大于96%）的可操作性好。所以对这一大宗中药资源抗白血病新药效给予系统而科学评价，拓展其新的应用领域并开发出具有自主创新特色的中药制剂、中药单体乃致中药新药具有重要的经济和社会效益。这不仅可使大多数低收入患者受益，提高他们健康水平和生活质量，而且是推进中药事业走向现代化的重要契机。本项目拟采用生物化学及生物物理学的方法研究不同的香精油对白血病细胞株（K562、HL-60）生长、繁殖及代谢的影响，了解不同香精油抗白血病功效及对细胞生理状态的影响，并通过拉曼指纹图谱变化，研究表征山苍子油抗白血病功效的最佳参数，为拓展山苍子油

11、在中药领域应用奠定理论基础。二、研究内容2.1白血病细胞株的培养2.1.1细胞株：HL-60、K562 (中山大学生科院)，冻存于70到80。2.1.2细胞复苏方法：快速融化法，保证细胞外结晶快速融化，以避免慢速融化水分渗入细胞内，再次形成胞内结晶损伤细胞8。2.1.3培养基：RMPI1640细胞培养液：含10 %胎牛血清、双抗(青、链霉素，各100 UI/ml)2.1.4培养条件：37、5% CO2的恒温箱培养2.1.5培养密度：5104个/ml，每2-3天更换培养基并进行传代2.2细胞生长曲线、培养细胞起始浓度和药物作用时间的确定分别用血球计数法和MTT法9测定白血病HL-60细胞株生长曲

12、线，并据此得出实验时选取细胞培养的细胞浓度和用香精油处理细胞时选择的加药时间。2.3 MTT法对不同香精油抑制白血病细胞生长作用比较通过不同香精油不同浓度作用HL-60细胞不同时间，再通过MTT法检测其抑制率来反映不同香精油对HL-60细胞抑制作用。在此基础上我们根据抑制作用结果从中选出几种香精油以及最佳的作用时间和作用浓度进行下一步实验。2.4 柠檬醛对白血病细胞代谢酶活性的影响2.4.1 HL-60细胞乳酸脱氢酶活性测定2.4.1.1 酶分离提取和考马斯亮兰法测定酶提取液中蛋白含量10-132.4.1.2 体外乳酸脱氢酶酶促反应体系构建及酶活性测定14反应公式： LDH丙酮酸 + NADH

13、 + H+ 乳酸 + NAD+NADH在340 nm处有特殊吸光，而NAD+没有这样的性质，所以可以记NADH在酶促反应中量的增加即在340 nm处吸光度的增加可以表示LDH的活力。2.4.2 HL-60细胞琥珀酸脱氢酶活性测定2.4.2.1酶分离提取和考马斯亮兰法测定酶提取液中蛋白含量15-172.4.2.2体外琥珀酸脱氢酶（MTT检测底物）反应体系的构建及酶活性测定18NBT(氯化硝基四氮唑兰)法：以NBT为受氢体，接受由琥珀酸钠盐被酶作用而脱下来的氢，进而形成蓝紫色的沉淀，于反应体系中加入PMS混匀，37 反应45 min，然后加入TCA终止反应，再加入异丙醇溶解显色，混匀，在548 n

14、m处测OD值。规定：45 min内548 nm下OD值为1.0时的酶量为一个活力单位，比活力活力单位/毫克蛋白。2.5 流式细胞术研究柠檬醛对白血病细胞诱导凋亡作用以白血病细胞HL-60和K562细胞株为实验细胞株，采用双染法进行不同浓度柠檬醛在作用4h和24h下的细胞凋亡分析。首先进行Annexin V-FITC染色，上机前5分钟再加入PI染色，流式细胞仪是使悬浮在液体中分散的经荧光标记的细胞或微粒逐个通过样品池，同时由荧光探测器捕获荧光信号并转换成分别代表前向散射角、侧向散射角和不同荧光强度的电脉冲信号，经计算机处理形成相应的点图，直方图和加三维结构图像进行分析。利用流式细胞仪可以检测出白

15、血病细胞经过柠檬醛作用后的凋亡情况。通过此步骤可以检测出柠檬醛对白血病细胞核DNA的影响以及柠檬醛作用白血病细胞后细胞凋亡情况。2.6 柠檬醛对白血病细胞表面Zeta电位和Kc的影响肿瘤细胞表面所带负电荷数量比较正常细胞明显要多，这与肿瘤细胞扩散和迁移能力直接相关，也是肿瘤细胞的一个显著特征。为了解柠檬醛对白血病细胞表面电荷是否有作用及剂量-时效关系怎样，采用了细胞表面Zeta电位的无扰测定技术。膜的弯曲模量Kc值直接反映细胞的变形能力，其值越小表示细胞的变形能力越好，细胞的生理特性越佳；反之，其值越大表示细胞膜的变形能力越差。通过对柠檬醛作用过的K562细胞进行Kc值的检测来研究柠檬醛对K5

16、62细胞的变形能力、膜骨架以及膜的流动性的影响，探究柠檬醛是否对膜骨架和膜流动性有损伤作用。2.7 激光拉曼显微散射技术实时无扰监测柠檬醛与K562细胞的作用过程最后通过激光拉曼散射19-22检测山苍子油作用后的细胞。激光拉曼光谱法的原理是拉曼散射效应。当用波长比试样粒径小得多的单色光照射气体、液体或透明试样时，大部分的光会按原来的方向透射，而一小部分则按不同的角度散射开来，产生散射光。在垂直方向观察时，除了与原入射光有相同频率的瑞利散射外，还对称分布着若干条很弱的与入射光频率发生位移的拉曼谱线，这种现象称为拉曼效应。由于拉曼谱线的数目，位移的大小，谱线的长度直接与试样分子振动或转动能级有关。

17、因此，与红外吸收光谱类似，对拉曼光谱的研究，也可以得到有关分子振动或转动的信息。经过激光拉曼散射检测后处理数据，选择表征山苍子油抗白血病功效的最佳参数。三、实验结果及其分析3.1生长曲线绘制、细胞培养起始浓度及药物作用时间的确定 图1 二种方法测得的白血病细胞（HL-60）生长曲线从图1中可以看出，HL-60细胞在传代后初始阶段增长缓慢，在24 h后开始进入对数增长期，培养至72 h时依然处于对数期；由此为实验得到对数生长期细胞提供参考依据。根据细胞生长曲线的结果所示，我们确定传代细胞的初始浓度为4105个/ml，培养至24小时后可取细胞进行相关药物作用实验。3.2.不同香精油对K562细胞的

18、生长增殖能力影响图2 同一浓度不同香精油对K562细胞存活的影响图2表明，所选择的12种香精油均对对K562细胞生长有20%以上的致死率，有7种精油达60%以上的致死率，其中最强的前三位是肉桂油、柠檬醛和柠檬草油。由于高活性的柠檬醛是我国特有山苍子香精油的主要组份且从其提取柠檬醛方法简便易行，故深入研究其抗白血病分子机制对开发这一特色林副产品的药用价值具有重要意义。3.3 柠檬醛对白血病细胞代谢酶活性的影响图3 柠檬醛胁迫下HL-60细胞乳酸脱氢酶活性的剂量-时效关系图3说明555 g/ml与111 g/ml药物浓度对HL-60细胞内乳酸脱氢酶有明显的抑制作用，作用24 h酶活力降低90%以上

19、。药物浓度越低，作用时间越短，酶活性丧失越不明显。图4 柠檬醛对HL-60细胞琥珀酸脱氢酶影响的剂量与时效关系由图4看出，柠檬醛有抑制HL-60细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶（SHD）效果，并且浓度越大抑制效果越明显，但似乎与药物作用时间相关性不大。3.4 柠檬醛对HL-60和K562细胞抑制作用的途径不径相同图5-1柠檬醛对HL-60细胞抑制作用的流式分析（4h）图5-2柠檬醛对HL-60细胞抑制作用的流式分析（24h） 图5-1和5-2说明citral在作用24h下才会表现出显著的诱导HL-60细胞凋亡活性，并且呈现出剂量效应；但在作用4h下则相应浓度citral不表现出诱导HL-60细胞凋亡活

20、性，而是呈现对细胞影响较小的现象；这反映出HL-60细胞对citral的敏感性较弱。图6-1柠檬醛对K562细胞抑制作用的流式分析（4h）图6-2柠檬醛对K562细胞抑制作用的流式分析（24h）图6-1说明Citral不具有诱导K562细胞凋亡的作用，但该结果说明在柠檬醛作用4h下，随着药物浓度增大，细胞呈现坏死，并表现剂量效应关系；图6-2则反映出柠檬醛对K562细胞的坏死作用随作用时间延长而加强，同样存在剂量效应关系。无论是药物作用4h还是24h，都没有诱导细胞凋亡效应，从作用24h各组的Q1区变化（00.1%10.2%35.2）可看出，膜选择通透性损伤可能是柠檬醛对K562细胞致死效应的

21、机制。另外，从药物作用4h时222浓度组坏死细胞达到26.5%，也说明了K562细胞对citral药物的敏感性要比HL-60细胞要强。3.5 柠檬醛具有削弱白血病细胞表面负电位的作用图7 柠檬醛对K562细胞表面电荷影响的剂量-时效关系图7可以看出不同浓度的柠檬醛作用K562细胞相同时间后，细胞膜的表面的电荷是随浓度增加而减少的；相同浓度的柠檬醛作用K562细胞不同时间后，细胞膜表面电荷随时间增大而递减。由此可以说明，柠檬醛对细胞膜表面负电荷有削弱作用，也提示citral有抑制白血病细胞迁移和侵染能力的作用。3.6 柠檬醛对白血病细胞膜流动性具有显著损伤效应图8 柠檬醛对K562细胞Kc影响的

22、剂量-时效关系图8可以看出柠檬醛作用过的细胞的Kc值比对照组的都大，并随浓度增加而大幅增大，不过在一定浓度后趋向于固定值；而随着时间的增长Kc值有减少的趋势，但是12.8浓度的例外。由此说明了K562细胞的形变能力越来越差，同时也表明膜骨架和膜流动性受损伤越来越严重。3.7 白血病细胞的靶分子性质分析CK 27.75 222图9-1 不同浓度柠檬醛胁迫下K562细胞拉曼光谱比较（4h）CK 27.75 222图9-2 不同浓度柠檬醛胁迫下K562细胞拉曼光谱比较（24h）采用激光拉曼散射技术实时无扰地采集了经不同浓度柠檬醛作用后的HL-60细胞的拉曼图谱，图谱的谱形特征具有显著差异。根据与标准

23、谱库的拉曼特征谱线比对，结果表明无扰拉曼技术在活细胞体内证明了柠檬醛化学簇,-不饱和醛基是其功效基团，即其与蛋白质半胱氨酸残基作用的分子反应机制；并证明这种相互作用能导致蛋白质多肽链二级结构变化。由于时间限制及相公佐证实验尚未结束，故对光谱进一步深入解析和揭示剂量关系内容还有待继续完成。四、研究成果经过大量的实验，证实了不同香精油对白血病细胞的抑制作用具有不同的抑制效果。经过我们的筛选，我们可以发现有几种香精油对HL-60细胞抑制作用效果特别好，例如肉桂醛、柠檬醛和柠檬草油。在进一步实验结果表明柠檬醛能抑制HL-60生长柠檬醛对HL-60细胞内LDH的时间剂量效应明显，随着药物浓度以及处理时间

24、的延长，酶活性降低越大柠檬醛对SDH有一定的抑制作用，并且在低浓度时酶活性对浓度变化很敏感。接着我们以流式分析发现K562细胞对citral药物的敏感性要比HL-60细胞要强。柠檬醛对K562细胞的表面负电荷有削弱作用，并对膜流动性具有显著损伤效应。最后由于时间限制及还需要相关佐证实验，不同浓度柠檬醛胁迫下K562细胞拉曼光谱解析没能作进一步的研究。五、总结与展望经过将近一年的实验研究，本项目研究顺利完成，对照项目申报书，不仅完成各项研究内容并取得预期成果，而且还增加了某些方面深入的探索内容，达到本项目总体指标的要求，并已准备将相关研究成果撰写成研究论文，争取在SCI刊源杂志上发表。但是由于本

25、科生课程多，时间精力有限，所学的专业知识也不够，需要查阅大量文献，使得本项目研究花费很多时间和精力，导致未能完成对研究项目论文的撰写和发表。同时经费有限，也限制了研究的进一步进行。各种不同的香精油在我国拥有丰富资源，若开发成抗白血病药物，将可使大多数低收入患者受益。此外，开展不同香精油抗白血病功效的研究，将推进我国特有天然产物在中医药领域的应用，服务于人类卫生事业，提高人们生存质量。因此，对天然的香精油对白血病功能研究是一个治疗白血病很好的切入点，如果能继续深入做研究，相信一定会给白血病患者带来福音。六、致谢首先，我们要感谢指导老师罗曼教授，在她的细心指导和严格的要求下，我们完成了挑战杯的项目

26、。接着，我们要感谢黄菲等师兄师姐，我们从他们身上学到很多。我们的成长总要是建立在许多人的身上，感谢所有帮助过我们的人，无论何时何地，我们都会把对你们的感谢放在心里。七、参考文献1AE Edris, Pharmaceutical and Therapeutic Potentials of Essential Oils and Their Individual Volatile Constituents: A Review. Phytother Res, 2007, 21(4): 308-23.2F. Bakkali et al, Biological Effects of Essential O

27、ilsA Review. Food Chem Toxicol, 2008, 46(2): 446-753NTP, Toxicology and carcinogenesiss studies of citral (microencapsulated) (CAS No. 5392-40-5) in F344 /N rats and B6C3F1 mice (feed studies). Natl Toxicol Program Tech Rep Ser, 2003, (505): 1-268.4Man Luo, Li-ke Jiang, Guo-lin Zou, Acute and Geneti

28、c Toxicity of Essential Oil Extracted from Litsea cubeba (Lour.) Pers. Journal of Food Protection, 2005, 68 (3): 581-588.5Tomona Hata et al, Induction of Apoptosis by Citrus paradisi Essential Oil in human leukemic (HL- 60) cells. 2003，In Vivo. (Athens, Greece), 17:553-560.6Nativ Dudai et al, Citral

29、 is a new inducer of caspase-3 in tumor cell lines. Planta Med, 2005，71(5): 484-8. 7A Kumar et al, An essential oil and its major constituent isointermedeol induce apoptosis by increased expression of mitochondrial cytochrome c and apical death receptors in human leukaemia HL-60 cells. Chem Biol Int

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