基因表达和基因重组_精品文档.ppt

1、基因重组和基因工程 Genetic Recombination and Genetic Engineering,第 十 四 章,概论,基因重组：不同的DNA分子间发生共价连接形成重组DNA 分子。,重组DNA技术发展史,pSC101,EcoRI,Boyer 和Cohen的实验,Boyer 和Cohen的实验,pR6-5,大肠杆菌,pSC101,pR6-5,抗四环素,抗卡那霉素,EcoRI,抗卡那霉素基因,DNA连接酶,重组DNA分子,培养平皿,大肠杆菌,人体生长激素释放激素(SS),抑制和调节多种激素的作用,从动物脑中提取:5mg-50万只羊脑,基因工程,9升大肠杆菌 培养液,SS基因,基因载

2、体,重组体,分,切,接,转,筛,表,SS,第 一 节DNA的重组 DNA Recombination,DNA重组,接合作用(conjugation),转化作用(transformation),转导作用(transduction),转 座(transposition),同源重组(homologous recombination),位点特异的重组(site-specific recombination),发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologous recombination)，又称基本重组。是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的

3、交换。,一、同源重组,二、细菌的基因转移与重组,（一）接合作用,当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌）的DNA转移称为接合作用(conjugation)。,可接合质粒如 F 因子(F factor),质粒 细菌染色体外的小型环状双链DNA分子,（二）转化作用,通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，称为转化作用(transformation)。,例：溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。,（三）转导作用,当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（供体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA

4、转移及基因重组即为转导作用(transduction)。,噬菌体的生活史,溶菌生长途径(lysis pathway)溶源菌生长途径(lysogenic pathway),例,第 二 节 重组DNA技术,DNA Recombination Technique,相关概念DNA克隆工具酶目的基因基因载体基本原理 重组DNA技术与医学的关系,本节主要内容,一、重组DNA技术相关概念,克隆(clone)来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。,获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。,（一）DNA克隆,技术水平：分子克隆(molecular clone)即DNA 克隆 细胞克隆个体克隆（

5、动物或植物）,DNA克隆应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA(recombinant DNA)。,生物技术工程:基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等,目的 分离获得某一感兴趣的基因或DNA 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）,基因工程(genetic engineering)实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组DNA

6、工艺学。,（二）工具酶,限制性核酸内切酶 DNA聚合酶 逆转录酶 T4DNA连接酶 碱性磷酸酶 末端转移酶 Taq DNA聚合酶,重组DNA技术中常用的工具酶,限制性核酸内切酶,定义限制性核酸内切酶(restriction endonuclease,RE)是识别DNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。,+,Bam H,作用与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。,分类、（基因工程技术中常用型）,第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。,命名,Hin

7、d,Haemophilus influenzae d株流感嗜血杆菌d株的第三种酶,类酶识别序列特点 回文结构(palindrome),切口：平端切口、粘端切口,Bam H,+,Hind,+,平端切口,粘端切口,同功异源酶来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。,+,Bam H,+,Bst,有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatible end)。,Bam H,Bg l,+,+,同尾酶,（三）目的基因,目的基因,需要克隆的DNA片段。,编码某种蛋白质,研究某基因结构和功能的关系,

8、研究某基因与疾病的关系,按照人的愿望设计和建造非天然的基因表达体系。,基因工程产品,cDNA：经反转录合成的、与mRNA互补的DNA链。基因组DNA：代表一个细胞或生物体整套遗传信息的所有DNA序列。,（四）基因载体,定义：为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。,克隆载体(cloning vector)-为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体。表达载体(expression vector)-为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体。,常用载体 质粒DNA、噬菌体DNA、病毒DNA,载体的选择标准,能自主复制；具有两个以上的遗传标记物

9、，便于重组体的筛选和鉴定；有克隆位点（外源DNA插入点）即多个单一酶切位点；分子量小，以容纳较大的外源DNA。,存在于细菌染色体外的小型环状DNA分子。具有自我复制功能。带有抗性基因及表型识别等遗传性标记物。经改造后具有多克隆位点。举例：pBR322质粒,质粒,宿主细胞,ori,抗Amp,宿主细菌,含Amp培养基,多克隆位点,ori,复制起始点,遗传标记,Amp,polylinker,基因载体,噬菌体DNA改造系统 gt系列（插入型，适用cDNA克隆）EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）,噬菌体(phage),M13噬菌体DNA改造系统（含lacZ基因）M13mp系列pUC系列,粘性质粒(c

10、osmid),酵母人工染色体(yeast artificial chromosome,YAC)细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome,BAC)动物病毒DNA改造的载体（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）,其他,二、重组DNA技术基本原理,以 质 粒 为 载 体 的DNA 克 隆 过 程,（一）目的基因的获取,1.化学合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。2.基因组DNA文库(genomic DNA library)3.cDNA文库(cDNA library)4.聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PC

11、R)（见第22章）,*化学合成法获取目的基因,由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列,组织或细胞染色体DNA,基因片断,克隆载体,重组DNA分子,含重组分子的转化菌,限制性内切酶,受体菌,基因组DNA文库存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合,*从基因组DNA文库获取目的基因,cDNA文库 以 mRNA 为模板，利用反转录酶合成与mRNA互补的DNA，再复制成双链 cDNA，与适当载体连接后转入受体菌，即获得cDNA文库。,cDNA,mRNA的提取与纯化,从mRNA制备cDNA,逆转录酶,聚合酶,mRNA,cDNA,杂化双链,cDNA文库法,cDNA文库,聚合酶链式反应（PCR

12、）,目的基因,基因载体,重组体,（二）克隆载体的选择和构建,（三）外源基因与载体的连接,1.粘性末端连接方式：(1)同一限制酶切位点连接(2)不同限制酶切位点连接配伍末端连接非配伍末端连接,Bam H切割反应,T4 DNA连接酶15C,同一限制酶切位点连接,不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接,Eco R切割位点,Bg l切割位点,配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。,2.平端连接适用于：限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形成的平端,3.同聚物加尾连接在末端转移酶(terminal transferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接

13、。,载体DNA,目的基因,限制酶或机械剪切,限制酶,4.人工接头(linker)连接由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。,人工接头及其应用,受体菌条件安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷处于感受态(competent),导入方式转化(transformation)转染(transfection)感染(infection),（四）重组DNA导入受体菌,（五）重组体的筛选 1.直接选择法(1)抗药性标记选择(2)标志补救(marker rescue)(3)分子杂交法原位杂交Southern印迹 2.免疫学方法如免疫化学方法及酶免检测分析等,(插入失活法)抗药性标记选择,互

14、补,互补的检测,原位杂交,Southern印迹,鸡的肌球蛋白的克隆和检出,重组DNA技术操作过程可形象归纳为,小 结,重组DNA技术操作的主要步骤,表达体系的建立表达载体的构建受体细胞的建立表达产物的分离纯化,（六）克隆基因的表达,1.原核表达体系（E.coli表达体系最为常用）标准：选择标志强启动子 翻译调控序列多接头克隆位点E.coli表达体系的不足 不宜表达真核基因组DNA不能加工表达的真核蛋白质表达的蛋白质常形成不溶性包涵体(inclusion body)很难表达大量可溶性蛋白,大鼠胰岛素原cDNA的表达和分泌,优点：可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA可适当修饰表达的蛋白质表达产物

15、分区域积累缺点：操作技术难、费时、经济,转染 将表达载体导入真核细胞的过程,方法：磷酸钙转染DEAE葡聚糖介导转染电穿孔 脂质体转染 显微注射,2.真核表达体系 酵母、昆虫、乳类动物细胞,表达载体pFASTBACI 的物理图谱,（一）疾病基因的发现与克隆根据基因定位克隆之并研究其性质，而认识疾病的分子机制。,三、重组技术与医学的关系,（二）生物制药,重组DNA医药产品,基因诊断(genetic diagnosis)是利用分子生物学及分子遗传的技术和原理，在DNA水平分析、鉴定遗传疾病所涉及基因的置换、缺失或插入等突变。,（三）基因诊断,基本过程,区分或鉴定DNA的异常,分离、扩增待测的DNA片断,标准.能正确扩增靶基因；.能准确区分单个碱基的差别；.本底或噪声低，不干扰DNA的鉴定;.便于完全自动化操作，适合大面积、大人群普查。,（四）基因治疗,定义基因治疗(gene therapy)是向有功能缺陷的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补偿其基因的缺陷，从而达到治疗的目的。,方式体细胞基因治疗(somatic cell gene therapy)性细胞基因治疗(germ line gene therapy),1.产前诊断2.携带者测试3.症候前诊断4.遗传病易感性,（五）遗传疾病的预防,欲以基因工程方法高效表达人胰岛素，请设计实验方案。,