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1、第三章 细胞生物学研究方法,第一节 细胞形态结构观察方法 一、光学显微镜技术 二、电镜技术 三、扫描隧道显微镜,细胞形态结构观察方法细胞组分分析方法细胞培养、细胞工程与显微操作技术,分辨率(resolution)R=0.61/sin 其中为入射光线波长；n=介质折射率；=样品对物镜镜口张角的半角,在光学显微镜中，照明系统是可见光，使用的是玻璃透镜系统，可直接通过目镜观察镜像。,分辨率区分两质点间最小距离人眼为0.2 mm，光镜为0.2m电镜为0.2 nm最大放大倍数人眼/光镜分辨率 放大倍数 1000,普通光学显微镜,相差显微镜,Fluorescence microscope,Fluoresc

2、ence image of epithelial cell,DNA in blue and microtubules in green,荧光显微镜,特点：光源紫外线 波长较短 分辨力高,2.1.5 激光扫描共聚焦显微境（Laser scanning confocal microscope,LCSM）,用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描。能显示细胞样品的立体结构。分辨力是普通光学显微镜的3倍。用途类似荧光显微镜，能扫描不同层次，形成立体图像。,laser confocal scanning microscope,LCSM,在光学显微镜中，照明系统是可见光，使用的是玻璃透镜系统，可直接通过目镜

3、观察镜像。在电子显微镜中，照明系统为电子束，使用电磁透镜，通过荧光屏观察样品的镜像。,制 片（样）技 术,通常以锇酸和戊二醛固定样品，丙酮逐级脱水，环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式切片，重金属（铀、铅）盐染色。,光学显微镜、TEM、SEM成像原理比较,冰冻蚀刻 freeze-etching,快速冷冻低温断裂断裂面蚀刻复型,2.2.2 扫描电子显微镜,Scanning electron microscope（SEM）,细胞组分分析方法（cell fractionation purification）差速离心和密度梯度离心法分离大分子 细胞组分显示方法 Feulgen Schiff PAS特

4、异蛋白抗原定位定性 IF IEM特异核酸序列定位与定性 ISH放射自显影定量细胞化学分析技术 FCM,一、超速离心分离细胞器和大分子步骤 匀浆将细胞破碎保留细胞器（超声、研磨、冻融）分级分离离心 分析化学组成、功能,1.差速离心(differential centrifugation),2.密度梯度离心,差速离心法differential centrifugation,原理：由低速到高速逐渐沉降将不同大小的颗粒分离。,细胞核,线粒体等,微粒体,核糖体等,差速离心法,不同的细胞器、大分子和病毒的密度及相应的沉降系数,五、放射自显影术 autoradiography,原理：,利用放射性同位素所放射

5、出的射线作用于感光乳胶的卤化银晶体，从而产生潜影，再通过显影把感光的卤化银还原为黑色的金属银颗粒，根据感光乳胶上的银粒所在的部位和黑度来判断样品中的放射性物质分布的位置和强度。,放射自显影的三种类型,宏观自显影,光镜自显影,电镜自显影,放射自显影的主要步骤：,放射性同位素标记,制片,涂乳胶烘干,曝光,显影定影,观察,显微分光光度术 流式细胞术（flow cytometry,FCM)检测细胞及其组分的物理和化学特性，可对细胞进行分选，还可以检测细胞及其组分的多种结构和功能参数。,六、定量细胞化学分析技术,第三节 细胞培养 细胞工程 显微操作一、细胞培养 Cell culture 一门科学，一门技术，应用广泛二、细胞工程 细胞融合 细胞杂交 单克隆抗体 显微操作,1.细胞培养（cell culture）2.原代培养(primary culture)3.传代培养(secondary culture)4.细胞系(cell line)5.细胞株（cell strain),本章要点,细胞生物学研究的方法（原理）与应用,