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1、实用现代分子生物学复习资料现代分子生物学资料第一章绪论一、三大发现:列文虎克的细胞学说、焦耳用实验确立的能量守恒定律、达尔文的进化论。二、分子生物学定义:从分子水平研究生物大分子的结构与功能从而阐明生命现象本质的科学,主要指遗传信息的传递(复制、保持(损伤和修复、基因的表达(转录和翻译与调控。三、分子生物学研究内容:1、DNA重组技术(基因工程2、基因的表达调控3、生物大分子的结构和功能研究(结构分子生物学4、基因组、功能基因组与生物信息学研究四、DNA发现的几个实验:美国科学家A VERY用S型和R型致病菌侵染小鼠的实验、美国科学家HERSHEY在1952年从事的同位素分子标记法噬菌体侵染细

2、菌的试验。第二章染色体与DNA一、染色体的结构和组成原核生物:DNA形成一系列的环状附着在非组蛋白上形成类核。真核生物染色体有蛋白质和DNA组成,蛋白质包括组蛋白(H1,H2A、H2B、H3、H4和非组蛋白。2、C值是一种生物的单倍体基因组DNA的总量。C值往往与种系的进化的复杂程度不一致,某些低等生物却有较大的C 值,这就是著名的C值反常现象。3、DNA的一级结构:指4种脱氧核苷酸的连接及其排列顺序,DNA序列是这一概念的简称。4、双螺旋的基本特点:双链反向平行配对而成;脱氧核糖和磷酸交替连接,构成DNA骨架,碱基排在内侧;内侧碱基通过氢键互补形成碱基对(A:T,C:G。5、DNA 的二级结

3、构指两条多核苷酸链反向平行盘绕所产生的双螺旋结构。是有Watson和Crick在1953年共同发现的。分类:右手螺旋(是其通常存在形式:A-DNA,B-DNA。左手螺旋:Z-DNA。6、超螺旋:DNA双螺旋结构中,一般每转一圈有十个核苷酸对,双螺旋总处于能量最低状态。正常DNA双螺旋额外的多转或少转几圈,就会出现双螺旋空间结构改变,在DNA分子中形成额外张力,若此时DNA分子的末端是固定的或是环状分子,双联不能自由转动,额外的张力就不能释放而导致DNA分子内部院子空间位置的重排,造成扭曲,即出现超螺旋结构。从DNA到染色体过程的压缩过程:核小体的形成是染色体中DNA压缩的第一个阶段,在核小体中

4、DNA盘绕组蛋白八聚体核心,从而使分子收缩至原尺寸的1/7。染色质细丝盘绕成螺旋管状的粗丝,每个螺旋管包含6个核小体,其压缩比为6。螺旋管进一步压缩形成超螺旋,压缩比是40. 超螺旋圆筒进一步压缩5倍便成为染色体单体。总压缩比是76405。7、DNA的半保留复制:由亲代DNA生成子代DNA时,每个新形成的子代DNA中,一条链来自亲代DNA,而另一条链则是新合成的,这种复制方式称半保留复制。8半不连续复制:DNA复制过程中,前导链的合成以53方向,随着亲本双链体的解开而连续进行复制;后随链在合成过程中,一段亲本DNA单链首先暴露出来,然后以与复制叉移动相反的方向,按照53方向合成一系列的冈崎片段

5、,然后再把它们连接成完整的后随链。这种前导链的连续复制和后随链的不连续复制在生物界是有普遍性的,因而称为双螺旋的半不连续复制。9、从复制原点到终点,组成一个复制单位,叫复制子。复制时,解链酶等先将DNA的一段双链解开,形成复制点,这个复制点的形状象一个叉子,故称为复制叉。10、线性DNA双链的复制方式:、将线性复制子转变为环状或多聚分子。、在DNA末端相处发夹式结构。、在某种蛋白质的介入下,在真正的末端上启动复制。环状双链DNA的复制分为型、滚环型和D-环型几种类型。11、后随链的复制由引发体来引发,引发体像火车头一样在后随链分叉的方向上前进,并在模板上断断续续的引发生成后随链的引物RNA短链

6、,再由DNA聚合酶III作用合成DNA,直至遇到下一个引物或冈崎片段为止。由RNaseH降解RNA引物并由DNA聚合酶I将缺口补齐,再由DNA连接酶将两个冈崎片段连在一起形成大分子DNA。12、冈崎片段:DNA复制过程中,两条新生链都只能从5端向3端延伸,前导链连续合成,滞后链分段合成。这些分段合成的新生DNA片段称冈崎片段。13、DNA 的修复包括错配修复(恢复错配、碱基切除修复(切除突变的碱基、核甘酸切除修复(修复被破坏的DNA 、DNA 直接修复(修复嘧啶二体或甲基化DNA 、SOS 系统(DNA 的修复,导致变异14、DNA 的转座或叫移位(transposition:由可移位因子(t

7、ransposable element 介导的遗传物质重排现象。 转座子(transposon Tn :存在于染色体DNA 上可自主复制和位移的基本单位。原核生物转座子的类型:1、插入序列 2、复合转座子 3、TnA 家族15、DNA 的复制酶:引物合成酶(此酶以DNA 为模板合成一段RNA,这段RNA 作为合成DNA 的引物 DNA 聚合酶原核生物中的DNA 聚合酶(聚合酶主要是对DNA 损伤的修复;以及在DNA 复制时切除RNA 引物并填补其留下的空隙。聚合酶修复紫外光引起的DNA 损伤。聚合酶是 DNA 复制的主要聚合酶,还具有3-5外切酶的校对功能,提高DNA 复制的保真性。(真核生物

8、中的DNA 聚合酶:聚合酶:引物合成。聚合酶:损伤修复。聚合酶:线粒体DNA 的复制。 聚合酶:核DNA 的复制。 聚合酶:与后随链合成有关 DNA 连接酶:DNA 连接酶在DNA 复制、损伤修复、重组等过程中起重要作用 DNA 拓扑异构酶:拓扑异构酶:使DNA 一条链发生断裂和再连接,作用是松解负超螺旋。主要集中在活性转录区,同转录有关。拓扑异构酶:该酶能暂时性地切断和重新连接双链DNA ,作用是将负超螺旋引入DNA 分子。同复制有关。DNA 解螺旋酶 /解链酶:通过水解ATP 获得能量来解开双链DNA 。第三章编辑:焦建宇中心法则: 转录:是指拷贝出一条与DNA 链序列完全相同(除了T U

9、 之外的RNA 单链的过程,是基因表达的核心步骤。包括:模板识别,转录起始,转录延伸,转录终止。转录单元(transcription unit 一段从启动子开始至终止子结束的DNA 序列。有意义链和反义链:我们把与mRNA 序列相同的那条DNA 链成为编码链coding strand 或称有意义链sense strand ,并把另一条根据碱基互补原则指导mRNA 合成的DNA 链成为模板链template strand 或称反义链antisense strand 。原核RNA 聚合酶:全酶: 2 核心酶:2 2(全酶 holoenzyme =2+真核RNA 聚合酶:根据它们对-鹅膏蕈碱(- a

10、manitin 的敏感性不同分为RNA 聚合酶I 、II 、III 。 RNA 聚合酶I 对-鹅膏蕈碱不敏感 ,RNA 聚合酶II 对低浓度-鹅膏蕈碱敏感 ,RNA 聚合酶III 对高浓度-鹅膏蕈碱敏感 RNA 聚合酶全酶与启动子区闭合双链DNA 结合形成二元闭合复合物(全酶、模板DNA 再解链为二元开链复合物,转录起始,形成三元复合物(全酶、模板DNA 、新生RNA , 因子释放,RNA 合成开始 启动子定义:指能被RNA 聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA 序列。原核生物启动子结构-10 signal (TA TA box,Pribnow box 酶的紧密结合位点(富含AT 碱基,

11、利于双链打开-35 signal ( TTGACA 提供了RNA 聚合酶全酶识别的信号transcription start site10区和-35区的最佳距离-10区与-35区的最佳间距大约是1619bp.Pribnow 区下降突变(TA TAAT AATAAT Pribnow 区上升突变(TA TGTT TA TATT 蛋白质复制翻译逆转录RNA真核生物启动子结构1、核心启动子(core promoter指保证RNA聚合酶转录正常起始所必需的、最少的DNA序列,包括转录起始位点及转录起始位点上游TATA区-25bp-30bp TATA box DNA解链开始转录位置2、上游启动子元件(up

12、stream promoter element,UPE (1CAA T box -75左右,RNA聚合酶结合有关(2更上游GC box 转录因子结合其上3、增强子顺式作用元件(cis-acting element定义:影响自身基因表达活性的非编码DNA序列。能直接、间接辨认和结合转录上游区段DNA的蛋白质,现已发现数百种,统称为反式作用因子(trans-acting factors。反式作用因子中,直接或间接结合RNA聚合酶的,则称为转录因子(transcriptional factors, TF。原核与真核生物mRNA的特征比较原核生物mRNA的特征:原核mRNA的半衰期短,细菌内mRNA的

13、转录、翻译与降解几乎是同时进行许多原核mRNA以多顺反子的形式存在原核mRNA的5端无帽子结构或只有短的Poly(A尾巴在起始密码子AUG上游7-12个核苷酸处,有一段可与核糖体16S rRNA配对结合的、富含嘌呤的3-9个核苷酸的共同序列,一般为AGGA,此序列称SD序列. 使得结合于30S亚基上的起始tRNA能正确地定位于mRNA的起始密码子AUG真核生物mRNA的特征真核mRNA的5端存在帽子结构有利于核糖体对mRNA的识别,Cap0必需帽子结构具有增强翻译效率的作用:增加mRNA的稳定性,避免核酸酶的作用绝大多数真核mRNA具有Poly(A尾巴mRNA穿越核膜的能力有关,影响到mRNA

14、的稳定性和翻译效率。polyA+与polyA-终止分为两类:强终止子-内部终止子:不依赖Rho (因子的终止。弱终止子-需要因子(rho factor,又称为依赖性终止子(Rho-dependent terminator不依赖于因子的终止模板DNA上存在终止转录的特殊信号终止子又称为内在终止子,内在终止子1、终止位点上游一般存在一个富含GC碱基的二重对称区,由这段DNA转录产生的RNA容易形成发卡结构2、在终止位点签名有一段48个A组成的序列,所以转录产物的3端为寡聚U这种结构的存在决定了转录的终止依赖于因子的终止因子结合于新合成的RNA链,借助水解A TP的能量沿RNA 链运动,当RNA 聚

15、合酶遇终止子停止时,因子追上酶,促使转录终止。转录后加工5端加帽3端加尾RNA的剪接RNA的编辑5端加帽5端的一个核苷酸总是7-甲基鸟核苷三磷酸(m7Gppp。mRNA5端的这种结构称为帽子(cap。能被核糖体小亚基识别,促使mRNA和核糖体的结合;m7Gppp结构能有效地封闭mRNA 5末端,以保护mRNA免受5核酸外切酶的降解,增强mRNA的稳定。3端加尾提高了mRNA在细胞质中的稳定性RNA的剪接(Splicing生物体内内含子的主要类型:P98将转录形成的mRNA前体(pre-mRNA中的内含子剪除,将外显子连接起来的加工过程.参与RNA剪接的物质:snRNA(核内小分子RNAsnRN

16、P(与snRNA结合的核蛋白RNA的编辑是指转录后的RNA在编码区发生碱基的突变、加入或丢失等现象。内含子(intron:真核细胞基因DNA中的不编码序列,这部分序列并不编码蛋白质,又称间隔序列。外显子(exon or extron:真核细胞基因DNA中的编码序列,这部分序列可转录为RNA,并翻译成蛋白质,也称表达序列。.可译框架(ORF,open reading frame真核生物断裂(不连续基因在表达过程中时必须经历的步骤.mRNA前体内含子的剪接hnRNA:(heterogenous nuclear RNA mRNA原始转录产物或前体snRNA:(small nuclear RNA 10

17、0-300 核苷酸,以U分类:U1-6snRNP:(small nuclear ribonucleoprotein核酶(ribozyme指一类具有催化功能的RNA分子,通过催化靶位点RNA链中的磷酸二酯键的断裂,特异性的剪切底物RNA分子,从而阻断基因的表达。第四章生物信息的传递(下从mRNA到蛋白质编辑:胡雷遗传密码(genetic code: DNA(或mRNA中核苷酸序列与蛋白质中氨基酸序列之间的对应关系。(二遗传密码的性质(特点1.密码的连续性:读码无标点、无重叠,阅读方向为532.密码的简并性大多数氨基酸都存在几个密码,由一种以上密码子编码同一个氨基酸的现象称为密码子的简并性(deg

18、eneracy。密码子碱基数确定和对应性(64个密码子对20种氨基酸确定同一个氨基酸的不同密码称为同义密码(synonymous codons。密码的简并性可以减少碱基突变造成的有害效应。在标准遗传密码表中,只有一个密码子的氨基酸是Trp和Met。3.密码的方向性指阅读mRNA模板上的三联体密码时,只能沿53方向进行。4.密码的摆动性1966年,Crick提出摆动假说(Wobble hypothesistRNA上的反密码子与mRNA上的密码子配对时,密码子的第一位、第二位碱基配对是严格的,第三位碱基可以有一定变动,这种现象称为密码的摆动性或变偶性(wobble。I(肌苷,次黄嘌呤核苷 A、U、

19、C配对。5.密码的普遍性与特殊性遗传密码无论在体内还是体外,无论是对病毒、细菌、动物还是植物而言都通用。在真核细胞线粒体中,UGA不是终止密码子,是Trp的密码子;AUA不是Ile的密码子,而是Met的密码子;AGA和AGG不是Arg密码子,而是终止密码子。第二节tRNAtRNA:运送特定氨基酸到核糖体上合成蛋白质。一、tRNA的二级结构二级结构:三叶草型三级结构:倒L型稀有核苷含量多tRNA的功能在蛋白质合成中,起着运载氨基酸的作用,按照mRNA链上的密码子所决定的氨基酸顺序将氨基酸转运到核糖体的特定部位。3端CCA-OH上的氨基酸接受臂识别氨酰tRNA合成酶的位点核糖体识别位点反密码子位点

20、(一起始tRNA和延伸tRNA一类特异地识别mRNA模板上起始密码子的tRNA叫起始tRNA,其他tRNA为延伸tRNA.原核起始tRNA携带fMet真核起始tRNA携带Met氨基酰-tRNA的表示方法:真核生物:Met-tRNAiMet;原核生物:fMet-tRNAifMet。1、无义突变在蛋白质的结构基因中,一个核苷酸的改变可能使代表某个氨基酸的密码子变成终止密码子(UAG、UGA、UAA,使蛋白质合成提前终止,合成无功能的或无意义的多肽,这种突变就称为无义突变.2、错义突变错义突变是由于结构基因中某个核苷酸的变化使一种氨基酸的密码变成另外一种氨基酸的密码.3、原核生物翻译过程中核糖体结构

21、模式:P位:肽酰位(peptidyl site、A位:氨基酰位(aminoacyl site、E位:排出位(exit site(一原核生物翻译起始复合物形成11、翻译起始需要的几种成分:30S小亚基、模板mRNA、fMet-tRNAfMet、三个翻译起始因子(IF-1、IF-2 、IF-3、GTP、50S大亚基、Mg 2+ 四、肽链合成的终止和释放I.识别:RF(释放因子识别终止密码,进入核糖体的A位II.水解:RF使转肽酶变为酯酶,多肽链与tRNA之间的酯键被水解,多肽链释放III.脱离:模板mRNA、RF以及空载tRNA与核糖体脱离IV.分子伴侣(molecular chaperone2、

22、能够在细胞内辅助新生肽链正确折叠的蛋白质。是一类序列上没有相关性但有共同功能的保守性蛋白质。按是否自发性折叠分为:热休克蛋白和伴侣素。4、信号肽假说:信号肽假说内容:(1蛋白质合成起始首先合成信号肽(2SRP(信号识别蛋白与信号肽结合,翻译暂停(3SRP与SRP受体结合,核糖体与膜结合,翻译重新开始(4信号肽进入膜结构(5蛋白质过膜,信号肽被切除,翻译继续进行(6蛋白质完全过膜,核糖体解离信号肽:常指新合成多肽链中用于指导蛋白质跨膜转移的N-末端氨基酸序列(有时不一定在N端。3、蛋白质转运机制: 5、蛋白质降解中泛素的参与:蛋白质的降解依赖于泛素(ubiquitin,Ub。泛素由76个高度保守

23、的氨基酸组成,普遍存在于真核生物中,故名泛素。它最初是从小牛的胰脏中分离出来的。共价结合泛素的蛋白质能被蛋白酶体识别和降解,这是细胞内短寿命蛋白和一些异常蛋白降解的普遍途径。26S蛋白酶体是一个大型的蛋白酶,可将泛素化的蛋白质分解成短肽。泛素相当于蛋白质被摧毁的标签,被贴上标签的蛋白质就会被运送到细胞内的垃圾处理厂,在那里被降解。降解涉及到的三种重要酶:E1,E2,E3的作用:E1激活泛素分子,E2就负责把泛素分子绑在被降解蛋白质上。E3能识别被降解的蛋白质。7、核糖体循环步骤:核糖体循环包括多肽链合成的进位、转肽、脱落和移位三步反应。第五章分子生物学的研究方法(上编辑:朱孟凯1.基因操作:主

24、要包括DNA分子的切割与连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析以及基因的人工合成、定点突变和PCR扩增等。基因工程:指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其他载体分子,构成遗传物质的新组合,使之进入新的宿主细胞内并获得持续稳定增值能力和表达。基因工程技术实际上是核酸操作技术的一部分。重组DNA技术-基因工程流程1.分载体和目的基因的分离2.切限制性内切酶的应用3.接载体与目的基因连接成重组体4.转基因序列转入细胞5.筛目的基因序列克隆的筛选和鉴定6.表-目的基因在宿主细胞的表达限制性内切酶切割方式有两种1、错位切割,产生互补性的粘性末端。错位切割所产生的DNA末端,两条链不平齐,一条

25、链凸出,一条链凹进,这种末端称为黏性末端。带有相同黏性末端的DNA分子很容易在末端互补配对,连接成新的重组分子。2、沿对称轴切割,产生平齐末端基因库,也叫基因组文库,DNA文库(DNA library是指用克隆的方法将一种生物的全部基因组长期以重组体方式保持在适当的宿主中。将生物细胞基因组DNA通过限制性内切酶部分酶解后所产生的基因组DNA片段随机地同相应的载体重组、克隆,所产生的克隆群体代表了基因组DNA的所有序列。这样保存的基因组是多拷贝、多片段,当需要某一片段时,可以在这样的图书馆中查找(没有目录。cDNA文库首先获得mRNA,反转录得cDNA,经克隆后形成文库。cDAN文库和基因组文库

26、的不同之处在于,cDNA文库除却了mRNA拼接过程中除去的内含子等成分,便于DNA重组的使用。其复杂性比基因文库低得多。主要用于研究蛋白质的氨基酸顺序,可根据克隆的cDNA分子的核酸序列直接推倒出来。分子杂交:是通过各种方法将核酸分子固定在固相支持物上,然后用标记的探针与被固定的分子杂交,经显影后显示出目的分子所处的位置的过程.分子杂交包括:DNA-DNA杂交(原位杂交、点杂交、Southern杂交,DNA-RNA杂交(Northern杂交及蛋白杂交(Western 杂交等。Southern杂交用途:用来检查DNA样品中是否存在有某个特定的基因,而且还可知道其大小及酶切位点的分布。Northe

27、rn RNA 印迹杂交用途:用来检查基因组中某个特定的基因是否得到转录。聚合酶链式反应(PCR体外酶促合成特异DNA片段的新方法,主要由高温变性、低温退火和适温延伸三个步骤反复的热循环构成.SNP单核苷酸多态性single nucleotide polymorphism指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性. 只涉及到单个碱基的变异(转换或颠换,也可由碱基的插入或缺失所致。环形双链质粒DNA分子具有三种不同构型:共价闭合环状的SC构型DNA(cccDNA,开环的OC构型DNA(ocDNA,线性的L构型DNA (LDNA,三者具有不同的电泳迁移率,可在琼脂糖凝胶电泳中分开。共

28、价闭环线状开环蓝白斑筛选出阳性菌落:Lac Z 半乳糖苷酶基因,在含Xgal培养基上呈蓝色,插入外源DNA,重组子培养呈白色pUC质粒,可插入外源基因片段长度约10kb。将外源基因插入到MCS中,随质粒的表达而表达,增殖而扩增。外源基因插入到MCS后,-半乳糖苷酶的活性丧失而不显兰色菌落。如果不插入外源基因,则产生兰色。从而筛选阳性菌落。第七章基因表达的方式组成性基因表达适应性表达(诱导和阻遏表达1、组成性基因表达某些基因在一个生物个体的几乎所有细胞中持续表达,通常被称为管家基因(house-keeping gene。无论表达水平高低,管家基因较少受环境因素影响,而是在个体各个生长阶段的大多数

29、或几乎全部组织中持续表达,或变化很小。区别于其他基因,这类基因表达被视为组成性表达。2、调节蛋白操纵子(operon包括俩个区控制区:1调节基因(Regulatory gene为阻抑蛋白编码基因2启动基因(Promoter为cAMP受体蛋白(CRP和RNA聚合酶结合区。3操纵基因(0perater为阻抑蛋白结合位点。信息区由一个或数个结构基因串联在一起组成。由操纵基因以及相邻的若干结构基因所组成的功能单位,其中结构基因转录受操纵基因所控制。操纵基因是顺式控制元件,阻抑蛋白是反式作用因子真核生物的顺式作用元件是指可影响自身基因表达活性的特异DNA 序列。通常是非编码序列。包括启动子、增强子及沉默

30、子等。2、调节蛋白是调节基因转录的蛋白因子,如原核生物的阻遏蛋白和CAP蛋白(降解物基因活化蛋白、真核生物的基本转录因子和特异转录因子等。原核基因调控机制的类型与特点(一原核基因调控机制的类型1、负调控negative regulation在没有调节蛋白质存在时基因是表达的,加入某种调节蛋白质后基因活性就被关闭,这样的控制系统就叫做负控系统。其调节蛋白质叫做阻遏蛋白两种类型:负控诱导和负控阻遏2、正调控positive regulation在没有调节蛋白质存在时基因是关闭的,加入某种调节蛋白质后基因活性就被开启,这样的控制系统就叫做正控系统。其调节蛋白质叫做无辅基诱导蛋白(激活蛋白两种类型:正

31、控诱导和正控阻遏系统(二特殊代谢物调节基因表达的类型1、可诱导调节一些基因在特殊的代谢物或化合物的作用下,由原来关闭的状态转变为工作状态,即在某些物质的诱导下使基因活化.调节分解代谢的操纵子,同时受cAMP-CAP的活性调节2、可阻遏调节一些基因在特殊的代谢物或化合物的作用下,由原来开启的状态转变为关闭状态,基因的表达被阻遏.调节合成代谢的操纵子(三原核生物基因表达调控的特点调节的主要环节在转录水平上进行因子决定RNA聚合酶识别特异性主要通过操纵子模式进行调节阻遏蛋白对转录的抑制作用(阻遏机制是普遍存在的负调控作用原核生物中基因的组织形式几个作用相关的基因在染色体上串连排列在一起,由同一个调控系统来控制。这样的一个整体称为一个操纵元(operon。