PCR技术及应用_精品文档.ppt

1、生物化学暨分子生物学教研室生物化学暨分子生物学教研室关亚群关亚群PCRPCR技术的创建技术的创建l l1983198319831983年年年年,Mullis,Mullis,Mullis,Mullis发明了发明了发明了发明了PCRPCRPCRPCR技术技术技术技术,使使使使KhoranaKhoranaKhoranaKhorana的设想的设想的设想的设想得到实现。得到实现。得到实现。得到实现。l l1988198819881988年年年年SaikiSaikiSaikiSaiki等将耐热等将耐热等将耐热等将耐热DNADNADNADNA聚合酶（聚合酶（聚合酶（聚合酶（TaqTaqTaqTaq）引入了）

2、引入了）引入了）引入了PCRPCRPCRPCR技术技术技术技术 l l1989198919891989年美国年美国年美国年美国ScienceScienceScienceScience杂志将杂志将杂志将杂志将PCRPCRPCRPCR列为十余项重列为十余项重列为十余项重列为十余项重大科学发明之首大科学发明之首大科学发明之首大科学发明之首,比喻比喻比喻比喻1989198919891989年为年为年为年为PCRPCRPCRPCR爆炸年爆炸年爆炸年爆炸年,Mullis,Mullis,Mullis,Mullis荣获荣获荣获荣获1993199319931993年度诺贝尔化学奖。年度诺贝尔化学奖。年度诺贝尔化

3、学奖。年度诺贝尔化学奖。Khorana(1971)Khorana(1971)Khorana(1971)Khorana(1971)等提出在体外经等提出在体外经等提出在体外经等提出在体外经DNADNADNADNA变性变性变性变性,与适与适与适与适当引物杂交当引物杂交当引物杂交当引物杂交,再用再用再用再用DNADNADNADNA聚合酶延伸聚合酶延伸聚合酶延伸聚合酶延伸,克隆克隆克隆克隆DNADNADNADNA的的的的设想。设想。设想。设想。但由于测序和引物合成的困难，以及但由于测序和引物合成的困难，以及但由于测序和引物合成的困难，以及但由于测序和引物合成的困难，以及70707070年代年代年代年代基

4、因工程技术的发明使克隆基因成为可能，基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，所以，所以，所以，KhoranaKhoranaKhoranaKhorana的设想被人们遗忘了的设想被人们遗忘了的设想被人们遗忘了的设想被人们遗忘了1983 1983 1983 1983 KaryKaryKaryKary B Mullis B Mullis B Mullis B Mullis（1944-1944-1944-1944-）发明发明发明发明1985 1985 1985 1985 开始有文章发表开始有文章发表开始有文章发表开始有文章发

5、表1993 1993 1993 1993 获诺贝尔奖获诺贝尔奖获诺贝尔奖获诺贝尔奖广泛用于分子生物学研究领域广泛用于分子生物学研究领域广泛用于分子生物学研究领域广泛用于分子生物学研究领域http:/http:/一、一、PCRPCR技术的基本原理技术的基本原理 （一）基本概念（一）基本概念 Polymerase chain reactionPolymerase chain reaction，PCRPCR 即即聚聚合合酶酶链链反反应应。是是以以拟拟扩扩增增的的DNADNA分分子子为为模模板板，以以一一对对分分别别与与模模板板5 5末末端端和和3 3末末端端互互补补的的寡寡核核苷苷酸酸片片段段为为引

6、引物物，在在DNADNA聚聚合合酶酶的的作作用用下下，按按照照半半保保留留复复制制的的机机制制，使使目目的的DNADNA片片段段得得到到扩扩增增的的技术。技术。一、一、PCRPCR技术的基本原理技术的基本原理（二）基本原理（二）基本原理无细胞分子克隆法：变性变性-退火退火-延伸三个步骤延伸三个步骤 l模板模板DNADNA的变性：的变性：93939595左右，左右，l模板模板DNADNA与引物的退火与引物的退火(复性复性)：Ta=TmTa=Tm3 35 5 l引物的延伸：引物的延伸：TaqTaq DNA DNA聚合酶之聚合酶之5 5 3 3DNADNA聚合酶活性聚合酶活性一、一、PCRPCR技术

7、的基本原理技术的基本原理1234522557294时间（min）温度（）适温延伸3高温变性1低温退火2重复1-3步25-30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍（二）基本原理（二）基本原理预变性预变性预变性预变性（三）（三）PCRPCR技术的特点技术的特点（1）高度的灵敏性30303030轮循环轮循环轮循环轮循环扩增量达扩增量达扩增量达扩增量达2 2 2 230303030个拷贝（个拷贝（个拷贝（个拷贝（101010109 9 9 9拷贝）拷贝）拷贝）拷贝）PCRPCRPCRPCR产物每轮循环增加一倍产物每轮循环增加一倍产物

8、每轮循环增加一倍产物每轮循环增加一倍（2）特异性引物的序列及其与模板结合的特异性引物的序列及其与模板结合的特异性是决定是决定PCRPCR反应结果的关键。反应结果的关键。引物设计的最大原则是最大限度地提引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特异性；同时尽可能减高扩增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。少非特异性扩增。（三）（三）PCRPCR技术的特点技术的特点（4）用途广泛（3）操作简便易行PCRPCR扩增法扩增法,只需要数小时只需要数小时,就可就可以用电泳法检出以用电泳法检出1g1g基因组基因组DNADNA中仅含数个拷贝的模板序列。中仅含数个拷贝的模板序列。生命学科生命学科 医学工

9、程医学工程遗传工程遗传工程 疾病诊断疾病诊断法医学法医学 考古学考古学（四）（四）PCRPCR标准反应体系标准反应体系DNA模板：模板：引物引物：引物确定了扩增产物的序列和长度引物确定了扩增产物的序列和长度反应缓冲液：反应缓冲液：10-50mmol/L 10-50mmol/L Tris-HClTris-HCl (pH8.3-8.8,20)(pH8.3-8.8,20)MgMg2+2+：forfor TaqTaq polymerase activity polymerase activitydNTP耐热聚合酶：耐热聚合酶：1969196919691969年，美国黄石国家公园温泉；年，美国黄石国家公

10、园温泉；年，美国黄石国家公园温泉；年，美国黄石国家公园温泉；94KDa94KDa94KDa94KDa；活性活性活性活性：在几种水生栖热菌中活性最高，：在几种水生栖热菌中活性最高，：在几种水生栖热菌中活性最高，：在几种水生栖热菌中活性最高，200 200 200 200 000U/mg 000U/mg 000U/mg 000U/mg。1988198819881988年引入了年引入了年引入了年引入了PCRPCRPCRPCR技术技术技术技术 ddH2O（四）（四）PCRPCR标准反应体系标准反应体系DNA模板：模板：纯化的基因组或质粒纯化的基因组或质粒DNA；由由RNA转化得到的转化得到的cDNA；

11、未经纯化的粗制生物样品（细菌未经纯化的粗制生物样品（细菌克隆或噬菌斑克隆或噬菌斑）（四）（四）PCRPCR标准反应体系标准反应体系Primer design(1)Length：1830bp(2)G+C contents：40 60，ATCG random distributed(3)primers：no complementary sequence(4)3end of the primer：no modification(5)5end of the primer：can be modified(6)Specificity：less than 70%homology with non-speci

12、fic amplification sequence,or 8bp continuous complementary base（四）（四）PCRPCR标准反应体系标准反应体系PrimerdesignedwiththehelpofcomputerlDNA databaselconservative region comparisionlPrimers or Blast（四）（四）PCRPCR标准反应体系标准反应体系TaqTaq DNA DNA聚合酶聚合酶离子需要：离子需要：对对对对MgMgMgMg2+2+2+2+、单价离子性质和浓度较敏感。、单价离子性质和浓度较敏感。、单价离子性质和浓度较敏感。

13、、单价离子性质和浓度较敏感。最适浓度为最适浓度为最适浓度为最适浓度为50mmol/L50mmol/L50mmol/L50mmol/L。忠实性忠实性忠实性忠实性:没有校正单核苷酸错配功能没有校正单核苷酸错配功能没有校正单核苷酸错配功能没有校正单核苷酸错配功能致命弱点。致命弱点。致命弱点。致命弱点。一般出错率为一般出错率为一般出错率为一般出错率为2 2 2 2 10101010-4-4-4-4核苷酸核苷酸核苷酸核苷酸/每轮循环，每轮循环，每轮循环，每轮循环，利用利用利用利用PCRPCRPCRPCR克隆、测序时尤应注意。克隆、测序时尤应注意。克隆、测序时尤应注意。克隆、测序时尤应注意。抑制剂抑制剂抑

14、制剂抑制剂:尿素、乙醇、尿素、乙醇、尿素、乙醇、尿素、乙醇、DMSODMSODMSODMSO、DMFDMFDMFDMF、甲酰胺、甲酰胺、甲酰胺、甲酰胺、SDSSDSSDSSDS 及许多其他化学药剂。及许多其他化学药剂。及许多其他化学药剂。及许多其他化学药剂。内源内源内源内源DNA:DNA:DNA:DNA:不同来源的酶可能由于制备过程中残留的不同来源的酶可能由于制备过程中残留的不同来源的酶可能由于制备过程中残留的不同来源的酶可能由于制备过程中残留的 原细菌原细菌原细菌原细菌DNADNADNADNA或或或或PCRPCRPCRPCR产物的污染而含有不明来源产物的污染而含有不明来源产物的污染而含有不明

15、来源产物的污染而含有不明来源 的的的的DNADNADNADNA。在使用扩增保守序列的通用引物，。在使用扩增保守序列的通用引物，。在使用扩增保守序列的通用引物，。在使用扩增保守序列的通用引物，会在无模板对照管出现扩增带。会在无模板对照管出现扩增带。会在无模板对照管出现扩增带。会在无模板对照管出现扩增带。保存保存保存保存:在在在在-20-20-20-20至少至少至少至少6 6 6 6个月个月个月个月（四）（四）PCRPCR标准反应体系标准反应体系PCR optimizationPCR optimization变性温度和时间：变性温度和时间：变性温度和时间：变性温度和时间：9292929295959

16、595，富含，富含，富含，富含G G G G和和和和C C C C的序列，可适当提高，的序列，可适当提高，的序列，可适当提高，的序列，可适当提高，但过高或时间过长都会导致酶活性损失。但过高或时间过长都会导致酶活性损失。但过高或时间过长都会导致酶活性损失。但过高或时间过长都会导致酶活性损失。退火温度与时间退火温度与时间退火温度与时间退火温度与时间引物中引物中引物中引物中G G G G、C C C C含量高、含量高、含量高、含量高、长度长并与模板完全配对时，应提高温长度长并与模板完全配对时，应提高温长度长并与模板完全配对时，应提高温长度长并与模板完全配对时，应提高温度。温度越高，产物特异性越高。通常度。温度越高，产物特异性越高。通常度。温度越高，产物特异性越高。通常度。温度越高，产物特异性越高。通常3737373755555555、1-21-21-21-2分钟。分钟。分钟。分钟。延伸温度和时间延伸温度和时间延伸温度和时间延伸温度和时间温度：温度：温度：温度：72727272，接近，接近，接近，接近TaqTaqTaqTaq酶的最适酶的最适酶的最适酶的最适75757575时间：过长会导致产物非