不同品系果蝇酯酶同工酶的分析.docx

1、不同品系果蝇酯酶同工酶的分析不同品系果蝇酯酶同工酶的分析内蒙古师范大学毕业论文 不同品系果蝇酯酶同工酶的分析 生命科学与技术学院2001生物技术班 柴锦彪 指导教师 耿星河 摘 要: 本文将用聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法来分析黑体果蝇和黑檀体果蝇以及残翅果蝇的酯酶同工酶通过酶谱分析发现黑体果蝇和黑檀体果蝇的酯酶同工酶在条带数目分区以及强弱程度上都有很大的相同之处通过对其迁移率和分子量以及各酶的含量的比较发现它们在迁移率和分子量上有一定的差别特别是在各酶带的含量上相差特别大。至于残翅与前两种不仅表现在迁移率和分子量以及酶的含量上有不同更重要的是它的酶的条带数以及分区也与前两种有明显的不同。 关键词:

2、果蝇,同工酶,电泳迁,移率 1 概念及意义 1895年Fisher提出了同工酶的概念，是指生物体内一些结构不同但催化作1用相同的酶称之为同工酶。分析同一物种不同品种之间的同工酶电泳谱带可以从分子水平上得知它们的关系。因为同工酶的遗传学基础是通过DNA转录为RNA再翻译成酶蛋白，这就是说组成酶蛋白的多肽链中的氨基酸的种类和顺序是由多2个核苷酸决定的。因此，使用同工酶资料的最根本依据是酶在电场里移动性的改变反映了编码DNA顺序上的改变。所以通过分析果蝇同工酶的电泳谱带可以从分子水平上得知不同品系果蝇间的差别。 2 电泳技术的发展及原理 2.1 电泳技术的发展 同工酶的分离技术有:电泳法，酶学法和免

3、疫学法，其中以电泳法应用的最为广泛。Tiselius(1937)第一次应用电泳技术区分在电流作用下迁移的血清蛋白。在以后的几十年里，电泳技术有了很大的改进，它包括现在广泛应用的凝胶1 柴锦彪 11/2/2010 内蒙古师范大学毕业论文 电泳的发展及组织化学染色方法的应用，使得可以对酶蛋白进行电泳变异的研究。当前电泳的种类因支持物的不同可分为纸电泳和凝胶电泳。分离同工酶技术主要用凝胶电泳。常用的凝胶有:淀粉凝胶;醋酸纤维薄膜和聚丙烯酰胺凝胶，其中聚丙烯酰胺凝胶具有电渗作用小，不易与样品相互作用，需要样品量少，凝胶具有一定的弹性且易于保存，对热稳定，无色透明，纯度大等优点而被广泛应3用。 2.2

4、同工酶电泳原理 电泳就是带电颗粒在电场作用下向着与其电性相反的电极移动过程因为酶。(包括同工酶)都是由许多氨基酸组成，除了肽链两端有自由-NH和-COOH2以外，在侧链上还有很多可电离的基团如:氨基(咪唑基等。在一定条件都能解离为带电基团在不同的PH条件下，可分别解离成阳离子，阴离子。而带不同的电荷。作为支持物的凝胶(特别是聚丙烯酰胺凝胶)，按照一定浓度配制可以形成一定大小孔洞的胶。同时孔洞的大小对被电泳物质的阻力也不同，孔洞大，阻力小，孔洞小阻力则大。同时阻力和电泳分子有关，分子大阻力则大，分子小阻4力则小。当在一定PH的缓冲液下进行电泳时，由于同工酶的性质和分子大小不同，在电场中所受电场的

5、驱动率不同，结果在胶中泳动速率不同这样就可以把5不同的同工酶分离开来而形成不同的带。 2.3 同工酶的染色原理 电泳后凝胶上的各种酶在周围温度的作用下会向四周扩散;活性会逐渐降低，所以凝胶要尽快染色，一般应在20分钟内染色。染色原理正如1957年Hurter和Marker首先用的组织化学染色法，这种方法的特点是效率高，分辨力强，能6够对某一种酯酶的同工酶进行染色而不使其它酶着色。 3 实验所需的材料(器具及药品 3.1 材料 黑腹果蝇(黑体，黑檀体，残翅) 2 柴锦彪 11/2/2010 内蒙古师范大学毕业论文 3.2 器具 DYY,6C型电泳仪(北京市六一仪器厂)，V16-夹心式垂直板电泳槽

6、(上海精益有机玻璃仪器制品厂)，匀浆器(微量注射器(台式冷冻高速离心机，吸管，移液管，培养大指管，小离心管等。 3.3 药品及原液配制 3.3.1凝胶组成液 a(Tris,柠檬酸缓冲液:三羟甲基氨基甲烷( Tris)15g,柠檬酸1.25g，用蒸馏水溶解，调PH,8.9，定容至1000ml。b(丙烯酰胺24g，用a液溶解，定容至100ml。c(甲叉双丙烯酰胺0.75g，用a液溶解，定容至100ml。d(乙二胺四乙酸二钠0.187g，溶于15ml a液中。e(四甲其乙烯二胺原液，f(过硫酸铵0.4g溶于10ml蒸馏水中。g(丙烯酰胺10g，甲叉双丙烯酰胺2.5g，溶7于蒸馏水中，定容至100ml

7、。 3.3.2电极缓冲液 7Tris 6.2g，甘氨酸2g，溶于100ml蒸馏水中PH,8.7，用时稀释50倍。 3.3.3样品匀浆液 蔗糖1.5g，溴酚蓝0.01g，Triton100 0.05g溶于100ml蒸馏水中。 以上溶液全部放入冰箱内保存，(0,4?)f液用新鲜配制或贮存期为两周内，7其它溶液均可贮存二个月。 3.3.4染色缓冲液(0.1mol/l磷酸缓冲液) 7 14.2g磷酸氢二钠溶于水中，用2mol/l HCl调PH,6.5，定容至1000m3.3.5底物溶液 7,萘乙酸1g，,萘乙酸0.25g，溶于25ml丙酮内。 3 柴锦彪 11/2/2010 内蒙古师范大学毕业论文 7

8、3.3.6脱色固定液 5份水，1份冰醋酸，5份甲醇定容到200ml。 4 实验步骤 4.1 冷冻样品 将黑体，黑檀体，残翅三个品系的果蝇分别挑15只，放在冰箱(20?)中冻15分钟。 4.2 配制凝胶 将一长一短玻璃洗干净烘干或自然干燥后，装入橡胶板中，然后再装入电泳7槽内，用1,的琼脂溶液将长玻璃板底下封住不要留有气泡。(要防止漏胶) 4.2.1分离胶的配制 吸取a液9.8ml，b液7.5ml，c液6.7ml，d液0.65ml，e液50ul，f液0.25ml，摇匀慢慢倒入垂直板电泳槽的两块玻璃之间，等加到与电极相平时，用水或正丁醇封住，以免与空气接触影响凝胶效果。20min后便可以聚合，倒去

9、上层的水，7用滤纸吸尽余水。该层为分离胶，胶浓度为7.4,。 4.2.2浓缩胶配制 吸取a液5.9ml，g液2ml，e液10ul，f液0.1ml，混匀后倒入分离胶上部，然后插入样品梳。过30min后便聚合，该层为浓缩胶。小以抽出样品梳，这样浓缩胶上就留下隔开的加样槽。用滤纸条吸净加样槽内残存的溶液。在上下电泳槽7内分别注入电极缓冲液 。 4.2.3 处理样品 凝胶聚合时间可以进行样品处理。将冻好的果蝇分别装入小离心管中，加入100ul匀浆液，在冰浴中研碎。置于高速冷冻离心机中以12000r,min离心4 柴锦彪 11/2/2010 内蒙古师范大学毕业论文 720分钟。 4.2.4加样 用微量注

10、射器吸取30ul上清液加入点样槽内，针头要接近槽底，慢慢注入以防扩散(因为样品匀浆液中已加入蔗糖和溴酚蓝，既有加大密度的作用，又有指示作用。 4.2.5电泳 在4?冰箱内以150v电压开始电泳，方向从负到正当溴酚蓝进入分离胶后可将电压调到250v，大约4h后溴酚蓝到达底部可以结束电泳。 4.2.6染色 撬开玻璃板，小心取出凝胶投入染色液中，染液以染色缓冲液60ml，坚牢蓝40mg，底物溶液2ml，室温下染色30,40min酯酶同工酶带已清晰显示，其8中紫红色醒目的即为同工酶带 4.2.7脱色固定 取出凝胶，用水洗净后投入到脱色固定液中，浸泡过夜脱去底色后，酶带更为清晰。 5 实验结果与分析 5

11、 柴锦彪 11/2/2010 内蒙古师范大学毕业论文 ( 图1凝胶扫图)，(上图中1， (图2柱形)(上图中1， 2，3.4.5泳道为黑体6，7泳道 2，3.4.5泳道为黑体6，7泳道 为残翅，8，9泳道为黑檀体) 为残翅，8，9泳道为黑檀体) 100%90%80%70%60%50%40%30%20%10%0%123456789 5.1各酶带迁移的距离及迁移 (表1各酶带迁移的距离及迁移率) 从点样孔黑体各酶黑体各酶残翅各酶残翅各酶黑檀体各黑檀体各到溴酚蓝带的迁移带的迁移带的迁移带的迁移酶带的迁酶带的迁的距离 的距离 率 的距离 率 移的距离 移率 473 36 0.07643 24 0.05

12、095 27.5 0.05814 473 106.5 0.22611 110 0.23354 106 0.22410 473 127 0.26963 130.5 0.27770 133.5 0.28224 473 148 0.31422 14705 0.32326 154.5 0.32663 473 226.5 0.48089 212 0.45010 231 0.48837 473 234 0.49681 228 0.48407 251 0.53065 473 250 0.53078 243.5 0.51698 276 0.58351 473 344 0.72727 人图1和图2和表1可以看出

13、 各个品种的点样孔到溴酚蓝之间的距离为473。 黑体从上到下，第一条酶带迁移的距离为36，它的迁移率为0.076433，残翅第一条酶带的迁移的距离24，它的迁移率为0.05095，而黑檀体第一条酶带的6 柴锦彪 11/2/2010 内蒙古师范大学毕业论文 迁移距离为27.5，其迁移率为0.05814。 黑体第二条酶带迁移距离为106.5，其迁移率为0.22611，残翅第二条酶带的迁移的距离110，它的迁移率为0.23354，而黑檀体第二条酶带迁移的距离为106，其迁移率为0.22410。 黑体第三条酶带迁移的距离为127，其迁移率为0.26963，残翅第三条酶带迁移的距离为130.5，它的迁移

14、率为0.277.7，而黑檀体第三条酶带迁移的距离为133.5，其迁移率为0.28224。 黑体第四条酶带迁移的距离为148，其迁移率为0.31422，残翅第四条酶带迁移的距离147.5，其迁移率为0.31316，而黑檀体第四条酶带迁移的距离为154.5，其迁移率为0.32663。 黑体第五条酶带迁移的距离为226.5，其迁移率为0.48089，残翅第五条酶带迁移的距离212，其迁移率为0.45010，而黑檀体第五条酶带迁移的距离为231，其迁移率为0.48837。 黑体第六条酶带迁移的距离为234，其迁移率为0.49081，残翅第六条酶带迁移的距离228，其迁移率0.48407，而黑檀体第六条

15、酶带迁移的距离为251，其迁移率为0.53065。 黑体第七条酶带迁移的距离为250，其迁移率为0.53078，残翅第七条酶带迁移的距离243.5，其迁移率为0.51698，而黑檀体第七条酶带的迁移的距离为276，其迁移率为0.5835。 黑檀体和黑体都没有第八条带，而残翅第八条带迁移的距离为344，其迁移率为0.72727。 5.2 各酶带的分子量 如果以黑体中各酶带分子量为标准，残翅和黑檀体各酶带分子量分别如下: 7 柴锦彪 11/2/2010 内蒙古师范大学毕业论文 以下设黑体各酶带为标准，分子量从上到下的关系从表2和图3可以看出 (表2分子量对比表) 黑体从上到下各酶带分子量 残翅从上

16、到下各酶带分子量 黑檀体从上到下酶带分子量 500 536 508 450 349 349 400 342 343 350 340 338 300 356 227 250 227 197 200 209 179 150 (图3分子量折线图)其中分子量1为黑体，2为残翅，3为黑檀体) 6005004001分子量2分子量3003分子量2001000 5.3 结果分析 从图1(2(和表1以及以上分析可以看出 黑体黑檀体果蝇的酯酶同工酶的酶带均为7条，并且均分为三个区，第一区仅有一条带且为强带，第二区均为三条带且相对较弱，第三区也有三条带也比较强。而残翅则有八条带且分为四个区第一区有一条带为强带，第二

17、区有三条带为弱带，第三区也有三条带也为强带，第四区有一条带也为强带。这三个品种的带之间黑檀体和黑体与残翅之间有着很大的区别不仅表现在各酶带的迁移率的不8 柴锦彪 11/2/2010 内蒙古师范大学毕业论文 同更主要表现在酶带的分区，残翅第四区的一条带为特征带这是它不同与其它品种的一条带。而黑体黑檀体果蝇在分区以及强弱上没有太大的区别(见图1和图2)，对应每个酶带的分子量，以及各种酶的含量，以及迁移率有一定的差别，见(表1，表2)。因为酶带的宽度能说明各种酶的含量，所以我们现在来分析的酶带的宽度。不仅每一个品种的各条酶带的宽度有一定的差别，且不同品种间对应的酶带的宽度也有一定的差别。现在先分析同

18、一品种内部不同酶带宽度的比较，如:黑体第一条酶带较宽，第二条酶带更宽，第三条酶带介于第一条和第二条之间，第四条酶带则非常窄，第五，六，七条酶带宽度都差不多介于第一条和第三条之间。残翅第一条酶带最宽，而第八条酶带最窄说明残翅中第一条酶带的含量最多而第八条含量最少。总的来说第一区最宽第二中的两条较宽一条较窄，第三，第四区都非常窄。黑檀体中第二条最宽第六条最窄，其它几条介于这两条之间。这说明在同一品种内部，不同的同工酶的含量是不完全相同的。现在来分析不同品间各对应酶带间的差别，总的来说残翅的酶带比其他两个品种的酶带多一条，且多出的一条分为一个区。三个品中间各对应的酶带的宽度都不尽相同，比如说黑体第一

19、条酶带比残翅第一条酶带要窄一点儿，而第二条却比残翅要宽的多，黑体第三条比残翅第三条要宽一点儿，而第四条却又比残翅窄。它们之间并不是说某一个品种的各条酶带都比另一个品种的要宽或窄，没有这样的规律。只是它们对应的酶带宽窄不尽相同。(见图1凝胶扫描图，图2柱形图) 从以上分析可以看出黑体与黑檀体果蝇的酯酶同工酶之间的虽然在条带的数目，分区，强弱程度都有很大的相似性，但在迁移率与分子量有很大的不同，特别是酶带的宽度的差别就更大了，因为酶带的宽度就代表了酶的含量，这说明不同的品种各对应的酶的含量是有很大的差别的。至于残翅与黑体和黑檀体的比较就更明显了，残翅与它们的差别不仅表现在迁移率和分子量上，更明显的

20、是表现在条带数目和分区上。很明显残翅有八条带，且分为四个区，而黑体和黑檀体都仅有七条带，且分为三个区。这说明残翅与黑体和黑檀体的差别大一点，而黑体和黑檀体之间的差别小一点。(见图2柱形图) 6 讨论 通过以上分析，可以看出黑体果蝇与黑檀体果蝇的酯酶同工酶在酶带的分9 柴锦彪 11/2/2010 内蒙古师范大学毕业论文 区、强弱、以及数目有一定的相似性，但是各酶带的迁移率，以及各酶带的宽度即酶的含量上是有很大的区别的。所以推测它们的相同点正是决定它们在分类学上还属于同一个种，因为从它们酶带的分区和数目上基本能决定这一点。而各酶带的强弱分区以及含量正是它们各个品种间的差异。从它们的酶带也可以看出这

21、两个品种在进化上也是相对较近的。因为它们的酶带有很多的相同点。这也是从同工酶水平上研究生物亲缘关系的理论依据。而它们的不同点也正是各个品种的特别之处。因为不同的品种在表型上的差异一定会在同工酶上有所体现。而残翅与以上两种也有相同与不同之处。它们的相同点也正是决定它们是同一个种的依据。其不同在酶带数目，分区，迁移率，以及酶的含量都有所表现。这么多的不同之处也正是残翅与其它品种差别较大的原因，如残翅在体形上较其它品种小，并且它的翅已褪化，不能再飞了，这是与其它品种间最大的区别。而体现在同工酶上它的条带数目比其它品种的要多一条，且在分区上也与其它品种有所不同这正是残翅的特别之处。 致谢 在本次实验过

22、程中，得到了指导老师耿星河的精心指导，以及院系其它老师的帮助和支持，在此深表感谢。 主要参考文献: 1 俞子牛.同工酶电泳技术与遗传变异研究J海洋湖泽通报,1997, 02期. 2 周本正.实用电泳及免疫电泳技术M.湖北科学技术出版社，1988. 3 华家柽，易庆成.实用蛋白质化学技术M.上海科技出版社，1979. 4 张龙翔，张庭芳.生化实验方法和技术M.人民教育出版社，1981. 5 莽克强，徐乃正，方荣祥.聚丙烯酰胺凝胶电泳M.科学技术出版社，1975. 6 北大生物系，生物化学教研室.聚丙烯酰胺凝胶电泳生物化学实验方法和研究技术M. 1979. 7 刘祖洞，江绍慧.遗传学实验M.北京:

23、高等教育出版社，1985. 8 赵永芳.生物化学技术及其应用M.武汉大学出版社，1994. 10 柴锦彪 11/2/2010 内蒙古师范大学毕业论文 The Analysis of Esterase Isoensyme in Different Strain Drosophila College of Life Science And Technology 2001 Biotechnolgy Class Chai Jinbiao Directed by Geng Xinghe Abstract: Esterase isoenzyme zymorgrams were analysed betwe

24、en black body drosophila, ebeneous body drosophila and vestigial drosophila by polyacrylamide gel elecprophoresiss method. Certain resemblance in black body and ebeneous body drosophrla by the analysis of electropherogram, such as the numbers of esterase isoenzyme, the diseribution and the lightness

25、. But there are some differences too, such as the relative molecular weight, the relative mobility and the width of electropherogram. Additionaly, there were more certain differences between vestigial drosophila and others, such as content of enzyme, the diseribuion, the molecular weight and the width of isozyme. Key Words: drosophila, isozyme, electrophoresis, mobility 11 柴锦彪 11/2/2010 内蒙古师范大学毕业论文 本 科 毕 业 论 文 ,设计, 目 录 题 目.1 内容摘要 .1 关 键 词1 正 文.1 致 谢.10 参考文献.10 外文部分.11 全文共11页5433字 12 柴锦彪 11/2/2010