诺如病毒标本处理和室检测技术方案.docx

1、诺如病毒标本处理和室检测技术方案附件4诺如病毒标本处理和实验室检测技术方案诺如病毒完整的检测及分型流程包括标本前处理、RNA提取、Real-time RT-PCR检测、传统RT-PCR检测、测序和基因分型6个步骤。Real-time RT-PCR方法灵敏度和准确度高，是检测诺如病毒的金标准。用传统RT-PCR可对Real-time RT-PCR阳性标本的PCR产物进行测序，通过序列分析确定诺如病毒的基因群和基因型。在发生聚集或暴发时，ELISA方法可作为辅助的手段快速检测诺如病毒抗原。食品、水、环境涂抹样检测方法的灵敏度不稳定，仅作为参考方法。一、标本前处理1.粪便、呕吐物1.1设备和材料微量

2、移液器、无菌过滤器、漩涡振荡器、微量离心机、1.5 ml无菌离心管、10 mM pH值为7.07.4的PBS。1.2 操作方法（1）离心管每管分装0.5 mlPBS。用一次性移液管（或无菌棒）添加豌豆大小的粪便（约0.1 g），稀释成约10至20（重量/体积）的粪便悬浮液。当粪便样品是液态时，不必在PBS中稀释，直接使用500 l的样品。（2）漩涡振荡每个样品1 min。在2 400 g下离心5 min，使得固体沉淀。澄清上清液可以直接用于病毒核酸提取或贮存于70。（3）取澄清的上清液200 l进行RNA提取。2.水通过阴离子滤膜过滤水样品。用牛肉膏（1.5%w/v）含0.05 M甘氨酸（pH

3、9.0）缓冲液洗脱附在膜上的病毒。使用Microsep 100TM 或 CentriconTM columns离心管进一步浓缩洗脱液。2.1设备和材料DEPC水、新配置次氯酸盐（至少1%）或等效消毒剂、Millipore HA filter（孔径0.45um、）、换膜过滤器、真空泵、计时器、PH值酸度计、磁力搅拌器及转子、低温冰箱（-20、-70）、Microsep 100 K columns（PALL公司）、Centriprep YM-50（Millipore公司）、洗脱液（BE-0.05Gly pH7.0）、PBS (pH7.2)、离心机、氯仿、丁醇。2.2操作方法2.2.1过滤装置准备（

4、1）使用无菌的镊子将滤膜放在滤器架上，滤膜有3层，型号分别为Millipore HA filter、AP15和AP20，放置顺序为Millipore HA filter AP15 AP20。注意：暴露出滤膜表面使其能与水样接触，请将滤膜光滑表面的那边向下。所有的玻璃器皿应干净无菌。每批水样使用不同的漏斗。（2）将滤膜置中，将有刻度的漏斗放在滤器的上边。（3）使用不锈钢滤器夹进行水的密封。（4）真空泵连接1 000 ml的锥形瓶。注意：为防止气溶胶的污染，应在无菌的环境中过滤，在生物安全柜进行操作。（5）向滤器中倒入20 ml无菌水（DEPC水）检查滤膜的密封情况。（6）打开泵，调整水的流速至形

5、成缓慢的细流。2.2.2 水样品的过滤（1）向玻璃漏斗里倒水样，当水样完全滤过立刻关闭真空泵。（2）用不锈钢的滤器夹，小心移开滤膜上的刻度漏斗。2.2.3 用酸漂洗滤膜将膜用无菌的镊子夹放在有200 ml0.05 mM H2SO4（pH3.0）的无菌500 ml烧杯中进行漂洗滤膜去除Mg2+。2.2.4 洗脱（1）将膜夹出放在无菌的60mm培养皿中，加5ml 洗脱液。盖上铝箔。注意：要将滤膜的上边向下（倒置）放在锥形瓶里。（2）将锥形瓶放在恒温摇床上，转速0.01g（45rpm），室温（23 3），15min。（3）关闭摇床，将洗脱液（大约5ml）转移到管子里。2.2.5 中和洗脱液用1 N

6、HCl或1 N NaOH调整洗脱液的pH到7.07.4。检测前，洗脱液在70储藏。2.2.6 二次浓缩方法一：用Microsep 100 K columns或Centriprep YM-50浓缩病毒（1）为防止病毒的附着，先用无病毒粒子的洗脱液浸湿过滤器。（2）将水标本滤膜洗脱液（大约5 ml）加入到浓缩柱中，2 400 g离心5 min。（3）吸取浓缩液（约150 l），转移至1.5 ml离心管中。方法二：PEG沉淀（1）向标本洗脱液中加入NaCl终浓度是0.3 mol/L（若洗脱液为5ml加0.08775g的NaCl）, 有助于病毒的沉淀，再等量加入PEG-6000终浓度为12.5（w/v

7、）（若洗脱液为5 ml，加0.0625g的PEG-6000。4 过夜。（2）4 ，9 600 g离心30 min，收集沉淀；（3）Millipore HA filter，倾倒并弃掉上清液。每个离心管添加150500 l pH7.2（0.2）PBS重悬沉淀物。将离心管放置在离心管架上，为更好的让缓冲液与沉淀物接触，将离心管架成一定角度放置。室温放置30 min。注意：如果沉淀物没有溶解，可用缓冲液反复的轻轻吹打沉淀物。吹打过力会产生气泡。（4）向悬液中加入等体积的氯仿/丁醇（1:1 vol/vol）混合。去除病毒悬液中的抑制剂。（5）4 ，9 600 g，离心20 min。（6）分离出水相（上清

8、液），80储藏。（7）取200 l上清液进行核酸提取。 3.环境涂抹样将棉签在PBS里蘸湿，用力涂抹待测表面（最大面积100 cm2）后，立即浸入核酸提取试剂盒裂解缓冲液中，将棉签用力压EP管的侧壁，释放棉签中的液体。重复浸入和压侧壁的步骤34次，确保病毒最大释放量，直接进入核酸提取步骤。4.食品4.1贝类4.1.1设备和材料:诺如病毒质控样（中国食品药品检定研究院）、高速离心机（可离心15ml50 ml体积）、台式离心机、碎花制冰机、生物安全柜、实时荧光定量PCR检测系统、眼科剪、眼科镊、一次性无菌培养皿、恒温摇床、高压灭菌器、电磨均质器（LX134MO）、一次性研磨杵（上海生工）、15 m

9、l去RNAase离心管、1.5 ml 去RNAaseEppendorf 管、20 l、200 l、1 000 l微量移液器、 PBS溶液 pH7.2 （Gebico）、蛋白酶K（PCR级 Roche）。4.1.2 贝类样品处理程序采集贝类样品，进行解剖，剪取消化腺和肠道后均质，最后提取RNA。4.1.3 解剖方法5个贝类个体作为一件样品，分别解剖，取其消化腺和肠道，用于检测。如果一件样品的消化腺和肠道的总质量不够2.0 g，应适当增加取样量，使得每件样品检验的总质量达到2.0 g。（1）牡蛎的解剖方法使用灭菌的刀具将牡蛎壳撬开，使用灭菌的眼科剪和眼科镊，先将牡蛎的内脏部分剪取下来放到一个灭菌的

10、平皿里，沿肠道将牡蛎软体部分剪开，暴露出肠道和消化腺，将多余的组织去掉，取其消化腺和肠道用于检测。牡蛎的解刨过程及解剖结构见（2）海虹用灭菌刀具将双壳撬开，将消化腺用镊子直接夹下，同时尽量将肠道取下。由于海虹的消化腺相对牡蛎较小，所以需要增加取样的海虹个体数，以使得总质量达到2.0 g，用于后续的检测。（3）扇贝、毛蚶与文蛤扇贝与毛蚶的解剖结构与海虹相似，参照海虹的方法将壳打开后，直接判断消化腺所处的位置，用眼科镊和眼科剪，将其消化腺和肠道取下用于诺如病毒的检测。文蛤的消化腺包在内脏团里，在解剖时可以直接用镊子在内脏团消化腺位置撕开，将消化腺取下，同时将肠道取出，用于检测，文蛤的消化腺体积较小

11、，需要适当增加取样量以满足检验的要求。4.1.4均质将上述解剖下的消化腺和肠道放到50 ml灭菌的小烧杯内，用电磨均质器（LX134MO）将消化腺仔细打碎，成糊状。4.1.5蛋白酶K消化将上述均质的消化腺，分别称取2.00.1 g，加入15 ml的离心管，然后每管加入2 ml的PBS溶液，加入20 mg/ml蛋白酶K（Roche）溶液10 l 进行消化，另外取1件样品加入诺如病毒的阳性质控球，作为外部质控阳性对照。4.1.6将上述样品于摇床37，0.57g（320rpm）振荡1h。恒温水浴60，保持15min；将15ml离心管，3000g离心5min，取200l用于RNA的提取，剩余部分冷冻保

12、存，用于复检。4.2三文鱼4.2.1设备和材料诺如病毒质控样（中国食品药品检定研究院）、恒温振荡器、食品均值器、天平：感量0.1 g、高速低温离心机（4 ，10000 g）、5PEG8000/NaCl溶液（PEG8000 5002g，NaCl 871g,先用450ml蒸馏水溶解，稍微加热，待溶解后定容至1000ml，121，15min灭菌）、磷酸盐缓冲液（PBS pH 7.2）、Tris/甘氨酸/牛肉膏缓冲液（TGBE）( Tris base 12.10.2g,甘氨酸 3.80.1g，牛肉膏101.0g，蒸馏水10001ml，121，15min灭菌)、氯仿/正丁醇（1:1体积比）溶液。4.2.

13、2 样品处理程序及方法（1）取三文鱼样品25 g，剪碎后置于带滤网的均质袋中，加人TGBE缓冲液40 ml，均质均匀，于室温60 r/min震荡20 min。（2）取滤液至50 ml新的离心管中，4 ，10000 g离心30 min。（3）取上清液（小心避开液体表面的油脂层），加入上清液1/4体积的5PEG/NaCl溶液，颠倒60 s，4 ，60 r/min震荡60 min。（4）将上述溶液于4 ，10000 g离心30 min，弃去上清液。向沉淀物中加入PBS溶液700 l，震荡重悬。（5）加入与上述重悬液等体积的氯仿/正丁醇（1:1）溶液，充分振荡，室温孵育5 min。于4 ，10000

14、g离心15 min。（6）取上层水相液体200 l用于提取病毒RNA。4.3草莓、蓝莓4.3.1 设备和材料诺如病毒质控样（中国食品药品检定研究院）、PEG8000（Polyethylene glycol）、氯化钠（NaCl）、氯化钾（KCl）、碳酸氢钠（NaHCO3）、磷酸二氢钾（KH2PO3）、磷酸氢二钠（Na2HPO3）、NaOH溶液（5M）、HCl溶液（1M）、纯水（Milli Q系统净化）、氯仿（Methenyl trichoride）、丁醇（1-Butanol）、牛肉膏（Beef Extract）、甘氨酸（Glycine）、蛋白酶K（Proteinase K）、果胶酶（Pectin

15、ase from Aspergilus niger，Sigma）、5PEG/NaCl缓冲液（PEG8000 5002 g，NaCl 871 g,先用450ml蒸馏水溶解，稍微加热，待溶解后定容至1000ml，121，15min灭菌）、TGBE缓冲液( Tris base 12.10.2 g,甘氨酸 3.80.1 g，牛肉膏101.0 g，蒸馏水10001 ml，121 ，15 min灭菌)、DHZ-D型冷冻恒温振荡器、FE20K型酸度计、小型高速离心机、CR22E型高速冷冻离心机。4.3.2样品处理程序及方法（1）取样称取25 g草莓（蓝莓）样本放入滤膜均质袋中，加入40 ml TGBE缓冲液

16、，（取一份样本作为阳性对照，可在这步加入诺如病毒的阳性质控球），以及30单位果胶酶（Pectinase from Aspergilus niger, Sigma）（2）样品提取室温振荡孵育10 min，测量pH值。若pH9.0；将流出液倒至离心管中（必要情况下使用2个离心管），4 ，10 000 g离心30 min；上清移至一新管或瓶，用HCl(1 M)调节pH至7.00.5；（3）样品富集浓缩加入1/4体积的5PEG/NaCl缓冲液，在4 条件下，于振荡孵育器孵育60 min；4 ，10 000 g离心30 min（必要情况下将液体分装于2只离心管）；弃去上层溶液，4 ，再次10 000 g

17、离心5 min以使颗粒紧凑；弃去上层溶液，用500 l PBS重悬沉淀。如果一个样品分两管离心，则用同样体积PBS依次重悬；将重悬液移至新的EP管中，加入等体积的氯仿/丁醇溶液，涡旋混匀，室温孵育5 min。4 ，10 000 g离心15 min，小心将水相转移至新管待提取RNA。4.4生菜和苗芽菜4.4.1设备和材料食品均质器（可拆卸、可清洗、可高压灭菌）、电子天平（感量0.01 g）、台式离心机（最高转速15 000 g）、微型离心机、电热恒温水浴锅（0-100）、涡旋振荡器、实时荧光PCR仪、Roche，LightCycler 480。4.4.2样品处理程序及方法（1）同一批次的生菜或苗

18、芽菜样品，随机抽取样品数不少于5件，并用灭菌处理的剪刀剪碎至2.5 cm2.5 cm2.5 cm大小的形状，称量25g放入带有滤膜均质袋一侧中，作为待试样品。另称取200 g样品放入50ml离心管中，80 保存，留作备样，并做好标记。（2）向上述均质袋中加入40 ml TGBE buffer，均质器拍打混匀，尼龙扎带封口后，室温振荡约20 min。（3）将均质袋滤膜一侧液体倾入50 ml 离心管，4 条件下10 000g离心30 min。（4）离心结束后，将上清转移至另一50 ml 离心管，加入1/4倍体积的5PEG/NaCl溶液，室温条件振荡60 min。（5）振荡完毕，4 条件下10 00

19、0g离心30 min。（6）离心结束，弃上清，继续4条件下10 000g离心5 min压实沉淀。（7）向沉淀加入500 l PBS溶液以溶解沉淀。吸取溶解沉淀后的PBS溶液200 l转移至无菌离心管中，作为试样。剩余的溶液分装到离心管中标记作为备样，80冻存。二、核酸提取各类样品经前处理后，每个样品分别取200 l，下面表格中提供的RNA提取试剂盒供参考，按试剂盒说明书操作提取RNA。样品种类试剂盒粪便或呕吐物QIAGEN病毒核酸提取试剂盒（QIAamp viral RNA mini kit ）或Geneaid 病毒核酸提取试剂盒（Viral Nucleic Acid Extraction K

20、it II）水和环境标本NucliSENS Lysis Buffer和NucliSENS Magnetic试剂盒（梅里埃公司）食品标本High Pure Viral RNA Kit（罗氏公司）三、诺如病毒核酸检测方法1.方法：（1）样本类型：粪便、呕吐物、肛拭子、水、环境涂抹样；（2）分析方法：采用诺如病毒双重Real-time （TaqMan）RT-PCR分析：（3）使用范围：ABI 7500 realtime PCR、Smartcycler (Cepheid), Mx3005P, Mx3000P (Stratagene)和ICycler iQTM Real-Time PCR检测系统(Bio

21、Rad)等。本设计应用QuantiTect Multiplex RT-PCR Kits (Qiagen)，引物和探针浓度分别被优化为终浓度400 nM和200 nM。每个试剂盒特异的RT最适环境和活化步骤，需要遵循制造说明书使用。该试验方法来自美国CDC诺如病毒暴发网络（CaliciNet USA）双重Real-time RT-PCR操作标准，引物设计参考文献59。2.设备和材料涡流混合器、微量离心机、移液器（量程为P20、P200和P1000）、Real-time PCR仪可以是ABI 7500 (ABI)、Smartcycler (Cepheid)、Mx3005P or Mx3000P (

22、Strategene)或BioRad iCycler iQTM Real-Time PCR检测系统(BioRad)。一次性手套、带滤芯枪头、无菌 1.5ml 微量离心管、RNA酶去除剂、96-孔反应板、盖子或薄膜。3.诺如病毒寡核苷酸引物/探针表1 多重荧光定量RT-PCR扩增诺如病毒的引物和探针基因型引物/探针序列（5-3）工作浓度nM）GICog 1FCGYTGGATGCGITTYCATGA400Cog 1RCTTAGACGCCATCATCATTYAC400Ring 1AFAMAGATYGCGATCYCCTGTCCABHQa200Ring 1BFAMAGATCGCGGTCTCCTGTCCA

23、BHQa200GIICog 2FCARGARBCNATGTTYAGRTGGATGAG400Cog 2RTCGACGCCATCTTCATTCACA400Ring 2JOETGGGAGGGCGATCGCAATCTBHQb200 注：a GI TaqMan探针：5端用FAM荧光素标记，3端用BHQ淬灭基团标记；BHQ淬灭基团1更好；bGII TaqMan探针：5端用JOE（HEX或VIC等）荧光素标记，3端用BHQ淬灭基团标记 4.操作方法（1）实验准备用RNA酶去除剂擦拭工作台表面、移液器和离心机除去潜在的RNA酶污染。Real time PCR仪开机预热15 min。（2）试剂准备所有试剂冰浴；

24、轻弹管壁混合2QuantiTect Multiplex RT-PCR Master Mix反应液；涡旋所有引物和探针5 s；QuantiTect Multiplex RT Mix、引物、探针置于冰上。（3）对照设立每一次实验都要包括无模板对照(NC)（第一个和最后一个孔各设一个）和阳性对照 (PC) （GI和GII诺如病毒核酸或标准品）。（4）检测注意：请在PCR清洁区准备、配制反应体系（master mix）。在1.5 ml离心管中准备master mix；确定每次分析的反应数(N)，需要多配反应数来弥补重复移液中的小量丢失：如果样本数(n)（包括NC和VC对照）=1-14,做n+1个反应的

25、mix。如果样本数(n)（包括NC和VC对照）15,做n+2个反应的mix。配制Real-time RT-PCR反应混合液22.5l（表2）表2 诺如病毒双重反应体系配制方案组成成分体积（l）终浓度（nM）RNase-free water4.25Cog 1F（10M）1400Cog 1R（10M）1400Ring 1A（10M）0.5200Ring 1B（10M）0.5200Cog 2F（10M）1400Cog 2R（10M）1400Ring 2（10M）0.5200RNase-free water4.25QuantiTect Multiplex RT Mix0.252QuantiTect M

26、ultiplex RT-PCR Master Mix12.51吸打混匀Master Mix。按如下方式排列阴性对照、阳性对照和样品，在每孔中加入22.5l Master Mix。123456789101112ANCS1S2S3S4S5S6S7S8NCPC(GI)PC(GII)BCDEFGH*阴性模板对照(NC) 加入第一列，样本加入后面的11列，检查加入样本时可能的交叉污染。病毒模板对照(PC在所有样本和NC密封后加入到最后。加入2.5lDEPC水到第一个NC孔，盖好。将反应平板转移到核酸处理区域或清洁区外面。将RNA样本从70C冰箱转移在冰上融化;漩涡振荡5 s之后快速离心5 s，移液2.5

27、 l RNA样本到标记好的孔。例如, 加样本1 (S1)到平板位置A2和B2。如果样本体积小于2.5 l, 加DEPC水至反应管使总反应体积达到25 l。加2.5 l水到最后的NC孔，盖好。最后, 移液GI和GII诺如病毒阳性对照各2.5 l到适当的PC孔，盖好。小心混合平板。4离心平板0.02 g（500 rpm） 1 min，以移除孔中可能存在的气泡和液滴。 RT-PCR扩增条件：按照ABI 7500 (or other platform) 的说明书放置好平板。终反应体积为25 l。根据QuantiTect Multiplex RT-PCR Kits说明书，RT-PCR热循环程序为：循环数

28、温度（）时间15020min19515min459445S6045S5.结果解释（1）阴性对照（NC）如果一个或更多NC反应出现假阳性,则可能发生了污染。这种情况下,检测无效，需重复检测。（2）阳性对照（PC）阳性对照产生超过阈值的荧光曲线或扩增图像。（3）检测样本只有在所有质量控制严格准确时，如果曲线在Ct值为40，则认为检测样本为阳性。四、诺如病毒传统RT-PCR分析原理：人诺如病毒分为5个基因组（Genogroup，G），其中GI、GII和GIV型可感染人。本方案利用衣壳蛋白的部分区域（region C）来对诺如病毒进行分型。本方案由四个引物组成，扩增ORF2的5末端，编码主要外壳蛋白V

29、P1。引物G1SKF和G1SKR用于GI的检测，扩增片段330 bp。引物和CoG2F和G2SKR用于GII的监测，扩增片段387 bp。1.设备与材料涡流混合器、微量离心机、移液器、PCR仪、微波炉、电泳仪和制胶器。一次性手套、带滤芯枪头、无菌 1.5 ml 微量离心管、RNA酶去除剂、薄壁PCR管（Rnase free，0.5 ml）、Loading Buffer、Qiangen OneStep RT-PCR Kit（货号：210212）2.诺如病毒寡核苷酸引物/探针（见表3）表3 诺如病毒传统RT-PCR寡核苷酸引物Region型别引物名称序列（5-3）产物(bp)CIG1SKF (+)CTGCCCGAATTYGTAAATGA330G1SKR (+)CCAACCCARCCATTRTACAIICOG2F (+)CARGARBCNATGTTYAGRTGGATGAG387G2SKR (-)CCRCCNGCATRHCCRTTRTACAT3.操作方法（1）实验准备用RNA酶去除剂擦拭工作台表面、移液管和离心机以去掉潜在的RNA酶污染。（2）试剂准备所有试剂冰浴。轻弹管壁混合5X缓冲液。离心酶、RNA酶抑制剂和dNTPs后将其放在冰上备用涡旋所有引物5s，离心5s备用。（3）对照设立每次PC