实验一：大肠杆菌的培养和分离(29张PPT).pptx

1、实验一：实验一：大肠杆菌大肠杆菌的的培养培养和和分离分离微生物结构结构简单简单,形体形体微小微小.通常要用通常要用光学显微镜光学显微镜或电子显微镜或电子显微镜才能看到，有的甚至没有细才能看到，有的甚至没有细胞结构。胞结构。特点：种类：病毒无细胞无细胞结构结构细菌：大肠杆菌、乳酸菌大肠杆菌、乳酸菌放线菌蓝藻（蓝细菌）支原体、衣原体真菌：霉菌、酵母菌霉菌、酵母菌原生生物：变形虫、草履虫变形虫、草履虫原核原核细胞细胞真核真核细胞细胞大肠杆菌革兰氏革兰氏_（填阴或阳）性菌（填阴或阳）性菌阴代谢类型：代谢类型：异养，兼性厌氧型人和哺乳动物肠道，此外还广泛分布人和哺乳动物肠道，此外还广泛分布于水、于水、污

2、水、土壤、谷类、乳制品污水、土壤、谷类、乳制品等当中。等当中。分布：分布：大肠杆菌在人体的大肠杆菌在人体的大肠杆菌在人体的大肠杆菌在人体的_中一般对人体无害，但任何中一般对人体无害，但任何中一般对人体无害，但任何中一般对人体无害，但任何大肠杆菌如果进入大肠杆菌如果进入大肠杆菌如果进入大肠杆菌如果进入_都会对人体产生危害。都会对人体产生危害。都会对人体产生危害。都会对人体产生危害。大肠杆菌是大肠杆菌是大肠杆菌是大肠杆菌是_工程中被广泛采用的工具。工程中被广泛采用的工具。工程中被广泛采用的工具。工程中被广泛采用的工具。肠道肠道肠道肠道泌尿系统泌尿系统泌尿系统泌尿系统基因基因基因基因有氧生长较好，有

3、氧生长较好，无氧维持生存无氧维持生存液体培养基液体培养基液体培养基液体培养基：扩大培养扩大培养固体培养基：固体培养基：固体培养基：固体培养基：菌种保存、分离纯化、鉴菌种保存、分离纯化、鉴定、活菌计数等定、活菌计数等半固体培养基半固体培养基半固体培养基半固体培养基按按照照物物理理性性质质按功能分按功能分普通培养基普通培养基普通培养基普通培养基选择培养基：选择培养基：选择培养基：选择培养基：筛选筛选筛选筛选鉴别培养基：鉴别培养基：鉴别培养基：鉴别培养基：鉴定鉴定鉴定鉴定按成分按成分合成培养基：合成培养基：合成培养基：合成培养基：天然培养基：天然培养基：天然培养基：天然培养基：人工按照需要配置人工按

4、照需要配置人工按照需要配置人工按照需要配置血清、血浆、组织液等血清、血浆、组织液等血清、血浆、组织液等血清、血浆、组织液等 供微生物、植物组织和动物组织生供微生物、植物组织和动物组织生长和维持用的人工配制的养料。长和维持用的人工配制的养料。培养基 灭菌和消毒灭菌和消毒灭菌：灭菌：使用使用强烈的理化因素强烈的理化因素消灭物体内消灭物体内外外所有所有微生物，包括芽孢和孢子。微生物，包括芽孢和孢子。消毒：消毒：使用使用较温和理化因素较温和理化因素，仅杀死物，仅杀死物体表面或内部的体表面或内部的一部分一部分对人体有害的微对人体有害的微生物的过程。生物的过程。不能杀死芽孢和孢子。不能杀死芽孢和孢子。灭菌

5、方法灭菌方法培养基、无菌水、培养基、无菌水、各种耐高温的玻璃金属器具各种耐高温的玻璃金属器具100kPa100kPa、121 121 下维持下维持15-30min15-30min需要保持干燥需要保持干燥耐高温的玻璃金属器皿耐高温的玻璃金属器皿160-170 160-170 下加热下加热1-2h1-2h接种环等金属器具接种环等金属器具高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌（湿热灭菌）（湿热灭菌）（湿热灭菌）（湿热灭菌）酒精灯灼烧灭菌酒精灯灼烧灭菌酒精灯灼烧灭菌酒精灯灼烧灭菌干热灭菌干热灭菌干热灭菌干热灭菌消毒的方法消毒的方法1 1、煮沸消毒法、煮沸消毒法:100:100煮沸煮沸5-6m

6、in5-6min2 2、巴氏消毒法：、巴氏消毒法：70-75 70-75 下煮下煮30min30min或或 80 80 下煮下煮15min15min3 3、化学药剂消毒法、化学药剂消毒法:用用75%75%酒精、新洁酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒尔灭等进行皮肤消毒;氯气消毒水源氯气消毒水源菌落单个单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个就会形成一个肉眼可见肉眼可见的，具有一定形态结的，具有一定形态结构的构的子细胞群体子细胞群体。大肠杆菌的培养和分离大肠杆菌的培养和分离实验步骤实验步骤在两个在两个在两个在两个250mL250mL250mL250mL的三

7、角瓶中分别装入的三角瓶中分别装入的三角瓶中分别装入的三角瓶中分别装入50mL LB50mL LB50mL LB50mL LB液体培养基和液体培养基和液体培养基和液体培养基和50mL LB50mL LB50mL LB50mL LB固体培养基（刚刚配固体培养基（刚刚配固体培养基（刚刚配固体培养基（刚刚配好，尚未凝固）。好，尚未凝固）。好，尚未凝固）。好，尚未凝固）。步骤一：步骤一：细菌喜荤，霉菌喜素细菌喜荤，霉菌喜素蛋白胨蛋白胨和和酵母提取物酵母提取物，提供提供碳源碳源和和氮源氮源；氯化钠氯化钠，维持一定的维持一定的渗透压渗透压；用用无机物无机物或添加蔗或添加蔗糖糖的豆芽汁的豆芽汁即可即可中性偏中

8、性偏碱碱；中性偏中性偏酸酸；LBLB液体液体培养基：培养基：蛋白胨，酵母提取物，氯化钠，加水蛋白胨，酵母提取物，氯化钠，加水蛋白胨，酵母提取物，氯化钠，加水蛋白胨，酵母提取物，氯化钠，加水50mL50mL50mL50mL（固体培养基则再加入（固体培养基则再加入（固体培养基则再加入（固体培养基则再加入1g1g1g1g琼脂琼脂琼脂琼脂）步骤二：步骤二：将将将将LBLBLBLB液体培养基配好，加入琼脂并加热液体培养基配好，加入琼脂并加热液体培养基配好，加入琼脂并加热液体培养基配好，加入琼脂并加热使之融化后，通过玻璃漏斗加入试管中，使之融化后，通过玻璃漏斗加入试管中，使之融化后，通过玻璃漏斗加入试管中

9、，使之融化后，通过玻璃漏斗加入试管中，每试管每试管每试管每试管2mL,2mL,2mL,2mL,加棉塞并将试管捆在一起，加棉塞并将试管捆在一起，加棉塞并将试管捆在一起，加棉塞并将试管捆在一起，上端加盖一张牛皮纸。上端加盖一张牛皮纸。上端加盖一张牛皮纸。上端加盖一张牛皮纸。步骤三：步骤三：灭菌灭菌要求所利用的微生物不要求所利用的微生物不要求所利用的微生物不要求所利用的微生物不被其他微生物污染，因被其他微生物污染，因被其他微生物污染，因被其他微生物污染，因此在培养微生物时必须此在培养微生物时必须此在培养微生物时必须此在培养微生物时必须进行进行进行进行无菌操作操作操作操作要灭菌要灭菌的器材的器材培养皿

10、培养皿试管试管三角瓶三角瓶移液管移液管三角刮刀三角刮刀接种环接种环加加加加棉花塞棉花塞棉花塞棉花塞或或或或塑料盖塑料盖塑料盖塑料盖用用用用封口膜封口膜封口膜封口膜或或或或6 6 6 6层纱布层纱布层纱布层纱布封口封口封口封口上端用镊子放入少量上端用镊子放入少量上端用镊子放入少量上端用镊子放入少量棉花棉花棉花棉花各种培养基各种培养基用牛皮纸包好，用牛皮纸包好，用牛皮纸包好，用牛皮纸包好，放入灭菌锅放入灭菌锅放入灭菌锅放入灭菌锅121121（1kg/cm1kg/cm2 2压力）压力）灭菌灭菌灭菌灭菌15min15min15min15min实验中所需的棉花不能用脱脂棉，因脱脂棉易吸实验中所需的棉花不

11、能用脱脂棉，因脱脂棉易吸实验中所需的棉花不能用脱脂棉，因脱脂棉易吸实验中所需的棉花不能用脱脂棉，因脱脂棉易吸水，吸水后容易引起污染。水，吸水后容易引起污染。水，吸水后容易引起污染。水，吸水后容易引起污染。注意注意1 1 1 1、如果培养基中有葡萄糖，为防止葡萄糖、如果培养基中有葡萄糖，为防止葡萄糖、如果培养基中有葡萄糖，为防止葡萄糖、如果培养基中有葡萄糖，为防止葡萄糖分解碳化分解碳化分解碳化分解碳化，要用要用要用要用500g/cm500g/cm500g/cm500g/cm2 2 2 2压力（压力（压力（压力（90909090以上）以上）以上）以上）30min30min30min30min。2

12、2 2 2、有些不能加热灭菌的化合物，如、有些不能加热灭菌的化合物，如、有些不能加热灭菌的化合物，如、有些不能加热灭菌的化合物，如尿素（加热会尿素（加热会尿素（加热会尿素（加热会分解）分解）分解）分解）等，只能用等，只能用等，只能用等，只能用G6G6G6G6玻璃砂漏斗玻璃砂漏斗玻璃砂漏斗玻璃砂漏斗过滤，但玻璃砂过滤，但玻璃砂过滤，但玻璃砂过滤，但玻璃砂漏斗使用前也要在漏斗使用前也要在漏斗使用前也要在漏斗使用前也要在121121121121下用纸包好灭菌。下用纸包好灭菌。下用纸包好灭菌。下用纸包好灭菌。玻璃砂漏斗有玻璃砂漏斗有6 6种，即种，即G1G1G6G6，G6G6孔径孔径最小最小，细菌不能

13、过滤。，细菌不能过滤。玻璃砂漏斗用后需用玻璃砂漏斗用后需用1mol/L1mol/L的的HClHCl浸泡，并浸泡，并抽滤去酸抽滤去酸，再用蒸馏水洗至洗出液，再用蒸馏水洗至洗出液呈中性呈中性，干燥后保存。干燥后保存。安全阀安全阀放气阀放气阀（连着一条（连着一条软管）软管）压力表压力表121121（1kg/cm1kg/cm2 2压压力）灭菌力）灭菌15min15min待灭菌锅压力与大待灭菌锅压力与大气压相同时（即没气压相同时（即没有压力了）打开锅有压力了）打开锅盖。盖。灭菌后，通常将实验用具放入灭菌后，通常将实验用具放入60806080的烘箱中的烘箱中烘干，以除去灭菌时的水分。烘干，以除去灭菌时的水

14、分。步骤四：步骤四：将有培养基的三角瓶和培养皿放到将有培养基的三角瓶和培养皿放到超净台超净台上；上；打开超净台的紫外灯和过滤风（注意打打开超净台的紫外灯和过滤风（注意打开紫外灯后人必须离开）开紫外灯后人必须离开）待固体培养基冷却到待固体培养基冷却到6060时（手放上还有些热时（手放上还有些热的时候），的时候），关闭关闭紫外灯，紫外灯，点燃点燃酒精灯，用镊子酒精灯，用镊子夹出夹出酒精棉球酒精棉球擦拭擦拭桌面桌面，并用酒精棉球，并用酒精棉球擦手擦手。步骤五：步骤五：倒平板倒平板在在在在酒精灯火焰酒精灯火焰酒精灯火焰酒精灯火焰旁，以旁，以旁，以旁，以右手右手右手右手无无无无名指及小指夹持含有固体培名

15、指及小指夹持含有固体培名指及小指夹持含有固体培名指及小指夹持含有固体培养基的三角瓶的养基的三角瓶的养基的三角瓶的养基的三角瓶的封口膜封口膜封口膜封口膜，右，右，右，右手其他手其他手其他手其他3 3 3 3个手指拿着个手指拿着个手指拿着个手指拿着三角瓶三角瓶三角瓶三角瓶；左手左手左手左手拿着拿着拿着拿着培养皿培养皿培养皿培养皿，并打开上，并打开上，并打开上，并打开上盖的一边，将三角瓶中的培盖的一边，将三角瓶中的培盖的一边，将三角瓶中的培盖的一边，将三角瓶中的培养基倒在培养皿里。养基倒在培养皿里。养基倒在培养皿里。养基倒在培养皿里。将培养基分别倒至将培养基分别倒至4 4个培养皿中，每倒入一个培个培

16、养皿中，每倒入一个培养皿后养皿后立即立即将培养皿置于将培养皿置于水平位置水平位置上，并上，并轻轻晃轻轻晃动动，使培养基，使培养基铺满底部铺满底部，待凝固后形成平面。，待凝固后形成平面。步骤六：步骤六：接种接种将将大肠杆菌斜面大肠杆菌斜面和有和有液体培养基液体培养基的的三角瓶三角瓶放在放在左手左手中中 ，靠近酒精灯火焰；，靠近酒精灯火焰；右手右手拿着拿着接种环接种环，并用右手无名指和小指夹住斜面的棉塞和三角并用右手无名指和小指夹住斜面的棉塞和三角瓶封口膜。瓶封口膜。注意：接种前，接种环接触培养基以达到冷却接种前，接种环接触培养基以达到冷却的目的，然后再取菌体。的目的，然后再取菌体。将菌体放入三角瓶的液体培养基中，将三将菌体放入三角瓶的液体培养基中，将三角瓶的封口膜和斜面的的棉塞复原。角瓶的封口膜和斜面的的棉塞复原。摇床摇床在在3737，每分钟，每分钟200200转的摇床上振荡培养转的摇床上振荡培养12h12h。步骤七：步骤七：划线分离划线分离在酒精灯火焰上灼烧接种环；在酒精灯火焰上灼烧接种环；在酒精灯火焰上灼烧接种环；在酒精灯火焰上灼烧接种环；将摇床上培养了将摇床上培养了将摇床上培养了将