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1、免疫组化实验免疫组化实验主要内容主要内容免疫组化实验免疫组化实验一一.免疫组化原理及应用免疫组化原理及应用二二.免疫组化的基本流程免疫组化的基本流程三三.免疫组化的试剂及仪器免疫组化的试剂及仪器四四.免疫组化的结果分析免疫组化的结果分析免疫组化免疫组化实验实验一一 免疫组化的原理免疫组化的原理 免疫组织化学又称免疫细胞化学，免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术性、定位、定量测定的一

2、项新技术。免疫组化免疫组化实验实验 它把免疫反应的特异性、组织化学的它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包包括荧光显微镜、电子显微镜括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等原体以及受体等)。免疫组化的应用免疫组化的应用免疫免疫组织组织化学的化学的临临床床应应用主要包括以下几方面：用主要包括以下几方面：恶恶性性肿肿瘤的瘤的诊诊断与断与鉴别诊鉴别诊断；断；确定确定转转移性移性恶

3、恶性性肿肿瘤的原瘤的原发发部位；部位；对对某某类肿类肿瘤瘤进进行行进进一步的病理分型；一步的病理分型；软组织肿软组织肿瘤的治瘤的治疗疗一般需根据正确的一般需根据正确的组织组织学分学分类类，因其种，因其种类类多、多、组织组织形形态态相像，有相像，有时难时难以区分其以区分其组织组织来源，来源，应应用多种用多种标标志志进进行免疫行免疫组组化研究化研究对软组织肿对软组织肿瘤的瘤的诊诊断是不可缺少的；断是不可缺少的；发现发现微小微小转转移灶，有助于移灶，有助于临临床治床治疗疗方案的确定，包括手方案的确定，包括手术术范范围围的确定。的确定。为临为临床提供治床提供治疗疗方案的方案的选择选择。二二 免疫组化的

4、基本流程免疫组化的基本流程免疫组化实验免疫组化实验2 2.脱蜡与水化脱蜡与水化2.细胞通透、封闭内源性过氧化物酶 4 4.抗原修复、暴抗原修复、暴露抗原决定簇露抗原决定簇 5 5.封闭非特异性封闭非特异性蛋白蛋白 6 6.一抗孵育一抗孵育 7 7.二抗孵育二抗孵育8 8.SP.SP 反应反应 9 9.显色显色 1010.复染、脱水、复染、脱水、透明、封片透明、封片3 3.细胞通透、封细胞通透、封闭内源性过氧化闭内源性过氧化物酶物酶 1.1.石蜡制片石蜡制片1.石蜡制片石蜡制片石蜡制片是将材料石蜡制片是将材料经经固定、脱水、透明、浸蜡后包埋在石蜡里固定、脱水、透明、浸蜡后包埋在石蜡里面面进进行切

5、片。行切片。此法适用范此法适用范围围，制片手段完，制片手段完备备，能将材料切成极薄的片子（可，能将材料切成极薄的片子（可切至切至2-8微米左右），并能制成微米左右），并能制成连续连续的片子，的片子，这这是其它制片法是其它制片法难难以达到的，因此在光学以达到的，因此在光学显显微微镜镜的制片技的制片技术术上它是最常用的一种上它是最常用的一种方法。方法。除了一些除了一些经经不住石蜡切片法中所不住石蜡切片法中所应应用的各种用的各种药剂处药剂处理的材料不理的材料不能能应应用石蜡切片以外，一般的材料都可以用此法制片，但有制用石蜡切片以外，一般的材料都可以用此法制片，但有制作作时间较长时间较长，操作，操作过

6、过程复程复杂杂以及材料易以及材料易发发硬或硬或发发脆等缺点。脆等缺点。该该法多采用法多采用旋旋转转式切片机式切片机进进行切片。行切片。石蜡制片操作程序如下：石蜡制片操作程序如下：（一）材料的采集与分割（一）材料的采集与分割（二）固定（二）固定（三）脱水（三）脱水（四）透明（四）透明（五）浸蜡（五）浸蜡（六）包埋（埋蜡、沉床）（六）包埋（埋蜡、沉床）（七）修（七）修块块（八）切片（八）切片（九）粘片（九）粘片1.1 材料的采集与分割材料的采集与分割采集材料采集材料应应根据制片的目的和要求而定，材料根据制片的目的和要求而定，材料要有代表性，无病虫害或其它要有代表性，无病虫害或其它损伤损伤，如要，如

7、要观观察察病理解剖，病理解剖，则则要取病斑、病症部位。要取病斑、病症部位。采下的材料采下的材料应应立即放在立即放在标标本箱或湿布包起来本箱或湿布包起来带带回回实验实验室室进进行分割固定。行分割固定。为为使固定液能迅速的渗透材料，材料要使固定液能迅速的渗透材料，材料要进进行分割。分割行分割。分割时动时动作要迅速，以防材料萎作要迅速，以防材料萎蔫。蔫。分割分割块块的大小，宜小不宜大，切取的的大小，宜小不宜大，切取的组织组织块块不宜太大，以利于固定不宜太大，以利于固定剂剂穿透，通穿透，通常以常以组织块组织块大小：大小：1.51.50.2cm为主为主，分割，分割后立即后立即进行进行固定固定。注意事注意

8、事项项：（1）取材）取材动动作要迅速，不宜作太久的拖延以免作要迅速，不宜作太久的拖延以免组织细组织细胞的成分、胞的成分、结结构等构等发发生生变变化。化。（2）切片材料）切片材料应应根据需要根据需要观观察的部位察的部位进进行行选择选择，尽可能不要尽可能不要损伤损伤所需要的部分。所需要的部分。1.2固定固定将切好的将切好的组织组织用生理用生理盐盐水水组织组织洗一下，立即投洗一下，立即投入中性福入中性福尔尔马马林固定液中固定，固定林固定液中固定，固定3050min。注意事注意事项项：（1）一般固定液，都以新配）一般固定液，都以新配为为好，配好后好，配好后应贮应贮存在阴凉存在阴凉处处，不，不宜放在日光

9、下，以免引起化学宜放在日光下，以免引起化学变变化，失去固定作用。化，失去固定作用。（2）有些混合固定液的成份之）有些混合固定液的成份之间间会会发发生氧化生氧化还还原作用，一定要原作用，一定要在使用前才混合，如果混合太早，固定在使用前才混合，如果混合太早，固定时时就没有作用了。就没有作用了。（3）固定材料）固定材料时时，固定液必固定液必须须充足，一般充足，一般为为材料材料块块的的2030倍，倍，有些水分多的材料，中有些水分多的材料，中间应间应更更换换1-2次新液。次新液。（4）材料固定完）材料固定完毕毕后，保存于后，保存于严严密密紧紧塞或加盖的容器里，同塞或加盖的容器里，同时时在容器外上在容器外

10、上标签标签，并随同材料在溶液中投入相，并随同材料在溶液中投入相应应的的标签标签，以免，以免相互混淆。相互混淆。标签标签上注明固定液、材料来源、日期等。上注明固定液、材料来源、日期等。标签标签上的上的文字，文字，应应用黑色用黑色铅铅笔或笔或绘图绘图黑墨水黑墨水书书写。写。1.3.脱水脱水脱水的目的是除去脱水的目的是除去组织组织中的水分，便于透中的水分，便于透明、浸蜡、包埋等步明、浸蜡、包埋等步骤骤的的进进行，因行，因为这为这些些程序中所用的程序中所用的药药品都不能与水混合，所以品都不能与水混合，所以必必须须脱水。常用的脱水脱水。常用的脱水剂为剂为酒精酒精。材料材料经经固定后固定后,流水冲洗，数小

11、流水冲洗，数小时时或或过过夜。夜。材料依次材料依次经经70%、80%、90%各各级级乙醇溶乙醇溶液脱水，各液脱水，各30min，再放入，再放入95%、100%各各2次，每次各次，每次各20min。注意事注意事项项：（1）脱水必）脱水必须须在有盖的玻璃品中在有盖的玻璃品中进进行，防止吸收空气中的水分。行，防止吸收空气中的水分。（2）在更）在更换换高一高一级级的脱水的脱水剂时剂时，最好不要移，最好不要移动动材料以免材料以免损损坏，坏，可用吸管吸出器皿中的脱水可用吸管吸出器皿中的脱水剂剂，再用吸水吸尽器皿内剩余液，再用吸水吸尽器皿内剩余液，然后于皿中加入高一然后于皿中加入高一级级脱水脱水剂剂。（3）

12、在低）在低浓浓度酒精中，每度酒精中，每级级停留不宜太停留不宜太长长，否，否则则易使易使组织变软组织变软，助助长长材料的解体。材料的解体。（4）在高）在高浓浓度或度或纯纯酒精中，每酒精中，每级级停留的停留的时间时间也不宜太也不宜太长长，否，否则则会使会使组织变组织变脆，影响切片。脆，影响切片。（5）如需）如需过过夜，夜，应应停留在停留在70%酒精中。酒精中。（6）脱水必）脱水必须彻须彻底，否底，否则则不易透明，甚至使透明不易透明，甚至使透明剂剂内出内出现现白色白色混混浊现浊现象象。1.4透明透明透明的目的是将脱水透明的目的是将脱水剂剂从材料中除去，使材料从材料中除去，使材料透明，增透明，增记记折

13、光系数；同折光系数；同时时便于下步的浸蜡和便于下步的浸蜡和包埋等程序。包埋等程序。常用的透明常用的透明剂为剂为二甲苯和二甲苯和氯氯仿，适用原仿，适用原则则也是也是逐逐级进级进行，可减少材料收行，可减少材料收缩缩。步步骤为骤为：纯纯酒精、二甲苯等量混合液酒精、二甲苯等量混合液15min，二，二甲苯甲苯15min、15min（至透明（至透明为为止）。止）。注意事注意事项项（1）使用透明）使用透明剂时剂时，要随，要随时时盖盖紧紧盖子，以免空盖子，以免空气中的水分气中的水分进进入。入。（2）更）更换换每每级级透明透明剂剂，动动作要迅速，一方面作要迅速，一方面为为了不使材料了不使材料块块干涸，另一方面能

14、避免吸收湿气。干涸，另一方面能避免吸收湿气。（3）在透明）在透明过过程中，程中，如果材料周如果材料周围围出出现现白色白色雾雾状，状，说说明材料中的水未被脱明材料中的水未被脱净净，应应退回退回纯纯酒精酒精中重新脱水，然后再透明。中重新脱水，然后再透明。1.5.透蜡透蜡透蜡的目的是除去透蜡的目的是除去组织组织中的透明中的透明剂剂（如二甲苯（如二甲苯等），使石蜡渗透到等），使石蜡渗透到组织组织内部达到内部达到饱饱和程度以和程度以便包埋。透蜡便包埋。透蜡时间时间根据根据组织组织大小而定。透蜡大小而定。透蜡应应在恒温箱内在恒温箱内进进行，并保持箱内温度在行，并保持箱内温度在55-60左左右，注意温度不要

15、右，注意温度不要过过高，以免高，以免组织发组织发脆。一般脆。一般置于恒温箱置于恒温箱0.5h。放入二甲苯和石蜡各半的混合液放入二甲苯和石蜡各半的混合液15min，再放入，再放入石蜡石蜡、石蜡、石蜡透蜡各透蜡各50-60分分钟钟。1.6.包埋包埋包埋包埋时时，用，用镊镊子子夹夹取石蜡模子（金属取石蜡模子（金属质质地）在酒精灯上稍加地）在酒精灯上稍加热热，放在平的桌面上，从，放在平的桌面上，从温箱中取出盛放温箱中取出盛放纯纯石蜡的蜡杯，倒入少石蜡的蜡杯，倒入少许许石蜡。石蜡。再将再将镊镊子在酒精灯上稍加子在酒精灯上稍加热热，夹夹取材料将切面取材料将切面朝下放入蜡模中，排列整朝下放入蜡模中，排列整齐

16、齐。再放上包埋盒，。再放上包埋盒，轻轻轻轻倒入熔蜡。倒入熔蜡。1.7.修修块块将已包埋好的蜡将已包埋好的蜡块块切成小切成小块块，每一小，每一小块块包含一包含一块块材料。然后按材料。然后按照所需的切面，用照所需的切面，用单单面刀片将小蜡面刀片将小蜡块块切成梯形，并可粗切成梯形，并可粗视视到材到材料切面。然后用料切面。然后用烧红烧红的蜡的蜡铲铲把蜡把蜡块块底部牢固的粘接在底部牢固的粘接在载载蜡器上。蜡器上。1.8.切片切片用切片机（如旋用切片机（如旋转转切片机）将蜡切片机）将蜡块块切成切成连续连续的蜡的蜡带带。切片。切片时时先先把切片刀把切片刀夹夹在刀架上，再把在刀架上，再把载载蜡器蜡器夹夹在固定装置上（注意安装在固定装置上（注意安装切刀的角度，刀口运行方向与材料切面平行），然后切刀的角度，刀口运行方向与材料切面平行），然后调调整好所整好所需厚度，一般可在需厚度，一般可在714微米，微米，视视材料和所需材料和所需观观察察对对象而定，象而定，转转动动切片机切片。切片机切片。具体步具体步骤骤如下：如下：将已固定和修好的石蜡将已固定和修好的石蜡块块装在切片机的装在切片机的夹夹物台上。物台上。将切