乌鸡家鸡血清测定-结题报告_精品文档.pptx

1、血清成分分析 陈佳丽 潘茜茜 林艳青 指导老师：张旭老师 2012-12-29目录1血清胆固醇的测定 2血清清蛋白-球蛋白的分离与鉴定 3谷丙转氨酶活性的鉴定及活力单位的测定 http:/ http:/ 邻苯二甲醛试剂，邻苯二甲醛试剂，90%醋酸，混合酸，标准胆固醇贮液醋酸，混合酸，标准胆固醇贮液（1mg/mL），标准胆固醇应用液（），标准胆固醇应用液（0.1mg/mL）实验步骤1 取清洁干燥试管5支，编号，按表格加入试剂。2 加毕，混匀，静置10min，以550nm波长比色测定，以吸光度值为纵坐标，胆固醇含量为横坐标，做标准曲线。本 1 取3支清洁干燥试管，编号后，按表格加入试剂。2 加毕，

2、混匀，静置10min，于550nm波长比色，以对照管校零点，对照标准曲线即知100mL样品中总胆固醇含量（mg）。本绘制表格记录标准曲线及样品各试剂吸光值。绘制标准曲线，在曲线上描出与样品吸光值对应的胆固醇含量。实验结果对照标准曲线可得：家鸡血清对照标准曲线可得：家鸡血清550nm处的光波吸收值为处的光波吸收值为 0.130。100ml家鸡血清中胆固醇的含量为家鸡血清中胆固醇的含量为75mg。根据参考资料鸡的血清胆固醇的含量在根据参考资料鸡的血清胆固醇的含量在51-196mg/100ml之间是在之间是在可信范围内可信范围内1。所以本实验测得家鸡血清胆固醇含量。所以本实验测得家鸡血清胆固醇含量7

3、5mg/100ml是在可信范围内。是在可信范围内。实验分析1.1.硫酸颜色的高低对显色有影响，所以混合硫酸颜色的高低对显色有影响，所以混合酸的配制和测定过程中的加量都应准确。酸的配制和测定过程中的加量都应准确。2.2.显色要避免高温（采用混合酸液反应时温显色要避免高温（采用混合酸液反应时温度不会升得太高，一般在度不会升得太高，一般在4 4到到3232摄氏度时，摄氏度时，颜色能稳定颜色能稳定2h2h）。）。3.3.做标准曲线时试管一定要洁净干燥，因为做标准曲线时试管一定要洁净干燥，因为本身所加的蒸馏水只有本身所加的蒸馏水只有0.01ml.0.01ml.。4.4.用微量进样器时一定要看清刻度。用微

4、量进样器时一定要看清刻度。5.5.实验中注意混匀时不要摇晃至产生气泡，实验中注意混匀时不要摇晃至产生气泡，防止影响实验结果。防止影响实验结果。6.6.实验中注意勿让混合酸腐化分光光度计。实验中注意勿让混合酸腐化分光光度计。返回返回目录1血清清蛋白与血清清蛋白与-球蛋白的盐析球蛋白的盐析 2蛋白质透析与浓缩蛋白质透析与浓缩3凝胶层析的实验凝胶层析的实验4醋酸纤维素薄膜电泳醋酸纤维素薄膜电泳实验原理血清清蛋白与血清清蛋白与-球蛋白的盐析球蛋白的盐析 血清中含有清蛋白和各种球蛋白（血清中含有清蛋白和各种球蛋白（-球蛋白等），由球蛋白等），由于它们所带电荷不同、相对分子质量不同，在高浓度盐溶于它们所带

5、电荷不同、相对分子质量不同，在高浓度盐溶液中的溶解度不同，因此可利用它们在中性盐溶液中溶解液中的溶解度不同，因此可利用它们在中性盐溶液中溶解度的差异而进行沉淀分离，此法称为盐析法。度的差异而进行沉淀分离，此法称为盐析法。实验材料血清：一管为家鸡血清，一管为乌骨鸡血清血清：一管为家鸡血清，一管为乌骨鸡血清 PBS（NH4）2SO4溶液溶液 双缩脲试剂双缩脲试剂 酪蛋白酪蛋白 蔗糖蔗糖 BaCl2溶液溶液 实验步骤血清清蛋白与血清清蛋白与-球蛋白的盐析球蛋白的盐析 返回返回实验原理蛋白质透析与浓缩蛋白质透析与浓缩 1.透析是利用蛋白质等生物大分子不能通过半透膜的性质透析是利用蛋白质等生物大分子不能

6、通过半透膜的性质的一类纯化方法的一类纯化方法,可利用该方法分离大分子和小分子混合物可利用该方法分离大分子和小分子混合物.2.由于由于NH4+和和SO4 2+可以通过半透膜，二血清清蛋白不能，因可以通过半透膜，二血清清蛋白不能，因此，可以利用透析的方法是清蛋白溶液脱盐。此，可以利用透析的方法是清蛋白溶液脱盐。3.将盛有待浓缩饿将盛有待浓缩饿 大分子溶液的透析袋放入高浓度的吸水性强的大分子溶液的透析袋放入高浓度的吸水性强的蔗糖固体颗粒中，袋内溶液中的水杯蔗糖固体颗粒中，袋内溶液中的水杯 袋外的袋外的 多聚物所吸收而有效多聚物所吸收而有效地浓缩。地浓缩。实验材料透析袋、蔗糖固体颗粒透析袋、蔗糖固体颗

7、粒实验步骤蛋白质透析与浓缩的实验步骤 1.取玻璃纸（15cm15cm）两张，折成袋状。将前面第一次盐析得到的含有清蛋白的上清液和-球蛋白分别倒入两个透析袋中，用线绳系紧上口。2.用玻璃棒悬挂在盛有半杯蒸馏水的100mL烧杯中，使透析袋下半部浸入水中，流水透析1h。3.将两透析袋取出，埋入蔗糖中浓缩 返回返回实验步骤凝胶层析的实验步骤实验结果凝胶层析凝胶层析重铬酸钾蓝葡聚糖实验结果洗脱曲线实验分析1 1.凝胶层析中观察到试管中的层析液中葡蓝凝胶层析中观察到试管中的层析液中葡蓝聚糖颜色由浅变深再变浅，重铬酸钾的层析聚糖颜色由浅变深再变浅，重铬酸钾的层析液的颜色变化也是呈这种规律。液的颜色变化也是呈

8、这种规律。2.2.凝胶在实验前的保存是保存在乙醇中，所凝胶在实验前的保存是保存在乙醇中，所以在实验中要洗去凝胶中的乙醇。但是由于以在实验中要洗去凝胶中的乙醇。但是由于洗去乙醇时加的蒸馏水比较多所以在凝胶倾洗去乙醇时加的蒸馏水比较多所以在凝胶倾入柱内去水比较的浪费时间。入柱内去水比较的浪费时间。3.3.但是在葡蓝聚糖的洗脱液颜色都比较的浅，但是在葡蓝聚糖的洗脱液颜色都比较的浅，分析得到是由于在滴加样品时加的样品不够分析得到是由于在滴加样品时加的样品不够多导致颜色变化不是很明显。多导致颜色变化不是很明显。4.4.在实验中应在柱内凝胶面上加入生理盐水，在实验中应在柱内凝胶面上加入生理盐水，应为要经常

9、加生理盐水所以每次加生理盐水应为要经常加生理盐水所以每次加生理盐水都会破坏凝胶面的平整影响层析的效果。都会破坏凝胶面的平整影响层析的效果。返回返回实验原理醋酸纤维素薄膜电泳醋酸纤维素薄膜电泳 醋酸纤维素薄膜电泳醋酸纤维素薄膜电泳 是以醋酸纤维素薄膜作为支持物的电是以醋酸纤维素薄膜作为支持物的电泳方法泳方法实验材料醋酸纤维素薄膜、电泳槽醋酸纤维素薄膜、电泳槽实验步骤醋酸纤维素薄膜电泳的实验步骤实验结果实验分析1.1.观察比较全血清、血清清蛋白、观察比较全血清、血清清蛋白、y-y-球蛋白的电球蛋白的电泳图谱发现全血清图谱较为复杂可见全血清中含泳图谱发现全血清图谱较为复杂可见全血清中含有多种蛋白。而

10、血清清蛋白、有多种蛋白。而血清清蛋白、y-y-球蛋白的电泳图球蛋白的电泳图谱则只有一条线可见实验在盐析、透析时做的比谱则只有一条线可见实验在盐析、透析时做的比较好使两种蛋白完全分离出来且不含其它蛋白。较好使两种蛋白完全分离出来且不含其它蛋白。2.2.但是由于点样时画线过猛破坏了醋酸纤维素薄但是由于点样时画线过猛破坏了醋酸纤维素薄膜，所以在膜，所以在y-y-球蛋白的图谱中留下点样线。球蛋白的图谱中留下点样线。3.3.当然在实验中滤纸桥搭的不好使两边的滤纸条当然在实验中滤纸桥搭的不好使两边的滤纸条发生了相互接触，结果使发生了相互接触，结果使y-y-球蛋白的电泳图谱上球蛋白的电泳图谱上留下颜色比较浅

11、的痕迹，分析由于试验中薄膜糙留下颜色比较浅的痕迹，分析由于试验中薄膜糙面朝下所以有些面朝下所以有些y-y-球蛋白会溶于滤纸上影响球蛋白会溶于滤纸上影响y-y-球球蛋白的电泳速度。蛋白的电泳速度。4.4.烘干后的薄膜不透明原因是漂洗不够彻底。烘干后的薄膜不透明原因是漂洗不够彻底。返回返回实验原理纸层析法底物谷氨酸的减少和产物丙氨酸的生成。丙酮酸与2，4-二硝基苯肼作用生成2，4-二硝基苯腙。此物质在碱性条件下呈棕红色，其颜色的深浅与丙酮酸的含量成正比。实验材料血清：一管为家鸡血清，一管为乌骨鸡血清 1%谷氨酸溶液，1%丙酮酸钠溶液，0.1%KHCO3溶液 0.025%溴乙酸溶液，2%乙酸溶液，0

12、.1%水合茚三酮的正丁醇溶液 ，0.1%标准谷氨酸溶液，0.1%标准丙氨酸溶液，1/15 mol/L pH=7.4的磷酸缓冲液，GPT基质液，1mmol/L 2，4-二硝基苯0.4mol/LNaOH溶液实验步骤1 取清洁干燥试管5支，编号，按要求试剂。2 加毕，混匀，置于37水浴静置10min，再加入2，4-二硝基苯肼0.5ml加毕，混匀，置于37水浴静置20min，再加5mlNaOH加毕，混匀，静置10min.以520nm波长比色测定，以吸光度值为纵坐标，酶活力单位为横坐标，做标准曲线。1 取清洁干燥试管3支，编号，按要求试剂。2 加毕，混匀，置于37水浴静置10min，再加入2，4-二硝基

13、苯肼0.5ml加毕，混匀，置于37水浴静置20min，再按要求加试剂，加毕，混匀，静置10min.以520nm波长比色测定，以吸光度值为纵坐标，酶活力单位为横坐标，做标准曲线。绘制表格记录标准曲线及样品各试剂吸光值。绘制标准曲线，在曲线上描出与样品吸光值对应的酶活力单位。实验结果家鸡血清家鸡血清550nm处的光波吸收值为处的光波吸收值为 0.026。乌鸡血清乌鸡血清550nm处的光波吸收值为处的光波吸收值为 0.150.对照标准曲线可得对照标准曲线可得100ml血清谷丙氨酸酶活力单位数家鸡是血清谷丙氨酸酶活力单位数家鸡是26910。乌鸡是。乌鸡是139640。实验结果此处添加文本实验分析1.1

14、.所需试剂如基质液、丙酮酸等需冷藏。所需试剂如基质液、丙酮酸等需冷藏。2.2.为防止溶血及其它因素对酶活性影响，实验仪器应干净干燥。为防止溶血及其它因素对酶活性影响，实验仪器应干净干燥。3 3.为保证操作结果可靠，测定酶活性时应恒定为保证操作结果可靠，测定酶活性时应恒定PHPH、保温时间、保温时间4.4.谷丙氨酸酶活性的鉴定谷丙氨酸酶活性的鉴定 1 1染色之后在滤纸上显色有样品染色之后在滤纸上显色有样品0.1mol/L0.1mol/L谷氨酸、标准谷氨酸、谷氨酸、标准谷氨酸、标准丙氨酸、家鸡的血清中的未被催化的谷氨酸与经过过谷丙标准丙氨酸、家鸡的血清中的未被催化的谷氨酸与经过过谷丙转氨酶催化的得

15、到丙氨酸、乌鸡血清中的未被催化的谷氨酸与转氨酶催化的得到丙氨酸、乌鸡血清中的未被催化的谷氨酸与经过过谷丙转氨酶催化的得到丙氨酸。经过过谷丙转氨酶催化的得到丙氨酸。2 2在染色之后的滤纸上发现家鸡与乌鸡的测试管在滤纸上的线在染色之后的滤纸上发现家鸡与乌鸡的测试管在滤纸上的线有三条。说明除出了丙氨酸与谷氨酸之外还存在其它的氨基酸，有三条。说明除出了丙氨酸与谷氨酸之外还存在其它的氨基酸，分析可能是试剂有污染。分析可能是试剂有污染。3 3在滤纸上留下了小点与小斑。分析原因可能是实验时交流有在滤纸上留下了小点与小斑。分析原因可能是实验时交流有口水留在滤纸上或是实验中的手套已经被污染了。口水留在滤纸上或是

16、实验中的手套已经被污染了。5 5）谷丙转氨酶活性测定）谷丙转氨酶活性测定 实验中测定的谷丙转氨酶的活性乌鸡的活性比家鸡要高。谷实验中测定的谷丙转氨酶的活性乌鸡的活性比家鸡要高。谷丙转氨酶广泛分布于全身各组器官，它在血清中的浓度与其来丙转氨酶广泛分布于全身各组器官，它在血清中的浓度与其来源的组织细胞更新速度和该器官的功能密切相关。乌鸡血清谷源的组织细胞更新速度和该器官的功能密切相关。乌鸡血清谷丙转氨酶的活性极显著高于家鸡，表明其所在的组织细胞中的丙转氨酶的活性极显著高于家鸡，表明其所在的组织细胞中的这些酶的含量多，而且这种酶主要存在于肝、心肌、肾，尤其这些酶的含量多，而且这种酶主要存在于肝、心肌、肾，尤其肝脏是物质代谢中枢，可合成大量营养物质，酶的含量高时极肝脏是物质代谢中枢，可合成大量营养物质，酶的含量高时极有利的条件。有利的条件。感谢您的关注Thanks for your attentionThanks for your attention