窖泥细菌群落的结构演替及其与环境因子的相关性.docx

1、窖泥细菌群落的结构演替及其与环境因子的相关性窖泥细菌群落结构演替及其与环境因子的相关性酿酒科技2011年第9期(总第207期>?UQUORMAKINGSCIENCE&TECHNOLOGY201tNo.9(To1.207l窖泥细菌群落结构演替及其与环境因子的相关性陶勇,一,徐占成,李东迅,刘孟华,樊科权,姚开(1.国科学院成都生物研究所,四川成都610041;2.四川剑南春(集团)股份有限公司,IJII绵竹618200;3.四川大学食品与轻纺学院,gJ)l成都610065)摘要:利用PCR-DGGE系统研究了剑南春不同窖龄(250年)窖泥的微生物群落结构,种群演替趋势及其与环境因子

2、的相关性.结果表明,2年窖龄窖泥的细菌丰度和多样性指数与5年样品相似,而10年窖龄窖泥的细茵丰度和多样性指数则明显增加,之后的l0年基本持平,但5O年时又显着下降.相同窖龄的窖泥样品中,中层的物种丰度和多样性指数均高于上层和下层,特别是在25年样品中这一趋势更加明显.DGGE和序列分析显示,窖泥中优势种群均分布在厚壁茵门(PhylumFirmicutes)的杆菌纲(ClassBacil1)和梭茵纲(ClassClostrida),其中耐酸乳杆茵(Lactobac/usnce幻如M),芽孢茵(Bacillusfordii),未培养的瘤胃茵(uncultured尺H砷c0cce凹bacterium

3、)和梭茵(unculturedC/ostr/d/a6ncm)为窖泥样品中的主要优势种群.典型对应分析显示,窖泥微生物群落结构与环境因子具有显着的相关性,其中有效磷,氨氮,pH对微生物群落结构的影响较大,其次是腐殖质,而水分含量的影响较小.关键词:微生物;窖泥;细茵;群落结构;环境因子;变性梯度凝胶电泳中田分类号:Q933;TS262.31;TS261.1;Q938文献标识码:A文章编号:10019286(2011)09004205SuccessionofBacterialCommunityinPitMudandItsCorrelatiOIISwithEnvironmentalFactorsTA

4、OYong,XUZhancheng2LIDongxun,uMenghua2,FanKequanandYaoKai(1.ChengduInstituteofBiology,ChineseAcademyofScience,Chengdu,Sichuan610041;2.SiehuanJiannanchunGroupCo.LnMianzhu,Sichuan618200;3.Textile&FoodScienceDepartmentofSichuanUniversity,Chengdu,Sichuan610065,China)Abstract:Bacterialcommunitysuccess

5、ioninpitmudofdifferentage(from2yearsto50years)inJiannanchunGroupanditscorrelationswithenvironmentalfactorsweresystematicallystudiedbyPCR-DGGEmethods.Theresultswereasfollows:bacterialabundanceandbacterialdiversi-tyindexdisplayedhighsimilaritybetween2-year-oldand5-year-oldpitmudsamples,however,theyinc

6、reasedobviouslyin10-year-oldpitmudsamplesandthenkeptstablein20-year-oldpitmudsamples,andthendramaticallydeclinedin50-year-oldpitmudsamples;forpitmudofthesameage,bacterialabundanceandbacterialdiversityindexinmediumlayerwerehigherthanthatintheupperorlowerlayer,especiallyforpitmudsamplesof25years;I)CEp

7、rofileandsequencesanalysisindicatedthatthedominantbacterialpopulationsinpitmudsamplesWeremainlydistributedinClassBaeillandClostridaofPhylumFirmicutes.ThepredominantbacteriaincludedLactobacillusacetoto/era/18,Bac/usfoZ/,unculturedRuminococcaceaebacterium,andunculturedClostridiabacterium;CCAresultsrev

8、ealedthatthereWaSsignificantcorrelationsbetweenenvironmentalfactorsandbacterialcommunityinpitmud.Amongallenvironmentalfactors,availablephosphorous,ammonianitrogenandpHhadstrongerinfluenceonbacterialcommunitys仃uctllreinpitmud.thenfollowedbyhumicsandmoisturecontenttheleast.Keywords:microbe;Pitmud;bact

9、eria;communitystructure;environmentalfactor;DGGE浓香型白酒的生产是以窖泥微生物,大曲微生物,糟醅微生物等复杂的物质能量代谢过程为前提,其中窖泥微生物的作用使得浓香型白酒产生浓郁的窖香(.生产经验表明,窖池窖龄与酿酒质量关系极为密切.只有老窖才能出好酒.如以泸州特曲为代表的浓香型白酒.有些专家认为,50年以上的老窖才能生产特头曲,20年左右的窖池只能生产二曲,三曲酒回,由此可见,老窖池对于浓香型白酒生产及品质的重要性.窖泥微生物区系极为复杂,它是经过长期的驯化和演替而逐渐形成的.前人利用传统方法对窖池微生物区系的解析研,纯种分离及作用机理等方面做了

10、大量研究工作,为大曲白酒的发展做出了重大贡献.但研究表明,通常环境中可培养的细菌仅收稿日期:2o11-0520作者简介l冉勇(1972-),J,博士后,副研究员,主要从事环境微生物学研究.通讯作者:徐占成,中国白酒杰出贡献着名科学家,享受国务院政府津贴专家,主要从事白酒酿造与酒质评定工作,所主持的项目2次获中国食品工业协会科技进步一等奖.陶勇,徐占成,李东迅,刘孟华,樊科权,姚开?窖泥细茵群落结构演替及其与环境因子的相关性占细菌总数的0.1%10%01.大量的细菌不能培养或现阶段难于培养,因此.采用传统的分离培养方法研究窖泥微生物区系有一定的局限性.近年来,有些学者尝试借助于现代分子生物学技术

11、研究窖泥微生物群落.如罗惠波等采用PCRSSCP技术研究窖池微生物群落11-12.邓依等采用16S一23SrRNAITSAFLP指纹图谱分析窖泥原核微生物多样性【】,陕小虎等对利用PCRDGGE技术研究窖泥微生物的电泳条件进行了优化和探讨【l1.3种方法比较,DGGE除了可较好地反映样品的微生物群落结构外.还可对优势条带切胶回收,并进行序列测定和分析,从而可以进一步了解优势菌种的种属分类.总体来说,利用现代分子生物学方法系统研究窖泥微生物群落结构与演替趋势,以及与环境因子的相关性研究相对较少.本研究以剑南春不同窖龄的窖泥为研究对象.采用PCRDGGE技术对不同窖龄窖泥的微生物群落结构和变化趋势

12、进行系统研究,并利用典型对应分析(CCA)探讨了微生物群落结构与环境因子的相关性,为全面了解窖泥微生物区系分布及主要功能微生物,进而为老窖环境的人工模拟及条件控制提供理论依据.l材料与方法1.1实验材料窖泥样品取自四川剑南春股份有限公司各生产车间,窖龄分别为2年,5年,10年,20年以及5O年,取样按窖池自上而下,分上(距池口约40cm),中,下层(距池底约40cm),每层多点取样混匀.所得窖泥样品一部分用于测定水分,pH值及矿物质元素等指标,剩余部分用于窖泥原基因提取1.2理化指标检测窖泥理化指标(水分含量,pH,氨态氮,有效磷及腐殖质等)的测定,参照酿酒分析与检测【4】所述方法分析测定.1

13、.3基因组DNA提取【l5】取5g样品于50mL离心管中,加入13.5mLDNA提取Buffer(100mMTrisHCl,100mMsodiumEDTA,100mMsodiumphosphate,1.5MNaC1.1%CTAB)和l0L蛋白酶K(100mg/mL),于37,225r/min,30rain;加入20%SDS1.5mL.60孵育1h(每隔20min轻轻颠倒离心管)室温离心l0min,6000g,收集上清液.向泥土沉淀中加入4.5mLDAN提取Buffer和0.5mL20%SDS,漩涡混匀10S于65,5min,室温离心10min,6000g,收集上清液(重复2次),混合所有上清液

14、,加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1),室温离心5min,16000g收集水相.加人0.6倍体积的异丙醇沉淀,室温放置lh,室温离心20min,16000g,弃上清液,加入冰冷的70%的乙醇,室温离心20min,16000g,弃上清液,于室温干燥,加入500L无菌水溶解DNA,一20保存.1.4PCRDGGEPCR扩增引物选用16SrDNAV3区通用引物GC一338F(5一CGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG一3,下划线表示GC夹)和518Rr5-ATTACCGCGGCTGCTGG一3).PCR反应体系(50L)的组成:10xTaqbuffer(NI-h)2SO4)

15、5L,MgC12(25mM)5L,10mMdNTPmix1L,双向引物(10M)2L,TaqDNA聚合酶(MBIFermentas)1.25U,无菌去离子水补足至5OL/PCR扩增程序:94预变性4min:94变性45s.65退火35s,72延伸45S,33个循环;72延伸10min.PCR扩增产物采用1%琼脂糖凝胶电泳检测.对上述PCR扩增产物进行变性梯度凝胶电泳分析(BioradDcodeUniversalDetectionMutationsystem).聚丙烯酰胺凝胶f1.51Tllrl厚,16cmxl6cm)浓度为8%,变性范围选用30%60%.电泳条件为60,80V,6h.凝胶通过溴

16、化乙锭染色15min后.在凝胶成像系统(Syn.geneG:BoxHRGelDocumentation)中照相,并对优势条带进行回收.1.5DGGE图谱分析利用QuantityOne软件(BioRad)对DGGE图谱上的条带进行数字化.采用非加权配对算数平均法(UPG.MA)聚类对细菌群落进行聚类分析.研究各细菌群落的相似性.细菌丰度用DGGE图谱中条带的个数来表示.优势度:用某一特定条带的峰面积占样品总体峰面积的百分数来表示.采用ShannonWeaver指数H对细菌群落的多样性进行分析.ShannonWeaver指数H=一XPilnPi式中Pi-ni/N.在本研究中,Pi代表某一泳道的第i

17、个条带(Band)的光密度的百分含量.1.6种群结构与环境因子相关性分析.7】使用Quantityone(美国BioRad)软件对DGGE电泳图谱进行量化处理,以二进制的格式输出.运用生物统计学软件Canocoforwindows(Version4.5)对DGGE图谱量化后的数据进行典型对应分析(CCA),研究各个水样中微生物多样性与其理化指标的相关性.分析过程中去除了相对含量小于1%和只出现过1次的条带,水样的理化指标进行了标准化处理18】.1.7优势种群系统发育地位分析从DGGE凝胶切下可见条带,捣碎后于5OL无菌双蒸水中于4浸泡过夜.以溶出的DNA作模板,用338F/518R引物对其进行

18、PCR扩增(条件同前),产物酿酒科技2011年第9期(总第207期)?LIQUORMAKINGSCIENCE&TECHNOLOGY201lNo.9(To1.207)经纯化后.连接到pEASYT1载体(北京全式金生物试剂公司)并转入大肠杆菌DH5et中,挑取阳性克隆,用M13引物进行质粒PCR检测后,送上海生工测序.测序结果在NCBI数据库fhttp:/Www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)中进行比对,下载数据库中最接近的已知序列,利用ClustalXMEGA4软件进行序列同源性分析.并构建系统发育进化树(NJ算法,Bootstrap1000次).2结果与讨论2.1PCR

19、-DGGE电泳结果与聚类分析DGGE结果显示.共有28个不同条带,每个泳道均出现数量不等的较清晰条带(623),表明各样品16SrRNA的PCR产物通过DGGE实现了较好的分离(图1).表1为不同窖泥样品中的细菌的丰度结果.从表1可以看出,2年,5年窖泥细菌丰度相近,平均为14.7,而10年窖泥细菌丰度明显增加,平均为21.7,20年窖泥的细菌丰度则与10窖泥基本持平,平均为2O.7,但是50年窖泥细菌丰度则明显减少,平均只有7.7.同窖龄不同层次细菌丰度比较,220年窖泥呈中层>上层>下层.而50年窖泥呈中层>下层>上层的趋势.DGGE电泳图显示,条带B3,B7,B1

20、9和B28在各样品中均有检出,尽管其优势度各有不同,但总体而言是主要的优势种群.Bl3条带只在25年窖泥样品中检出.而在1050年窖泥样品中少有检出.表明该种群在长期生产与驯化过程中.逐渐被淘汰.B15条带则只在1020年窖泥样品中检出,而在其他样品中未检出(除2年窖泥中层样品).B16和B23条带在220年窖泥样品中,随着窖龄的增加.其优势度逐渐增加,但在50年窖泥样品中却显着减少.图1DGGE与聚类分析250分别代表窖泥样品的窖龄,s,Z和x分别代表取样的上层,中层和下层.表1不同窖泥样品中的细菌丰度窖层上层中层下层平均214l81114.35l5171315.0205O2362O9l98

21、20.77.7聚类分析结果显示,不同窖龄的样品共聚为4个簇,其中25年窖泥的上,下层样品聚为一簇.相似性指数为0.720.84;1020年窖泥的中,下层样品聚为一簇,相似性指数为0.640.75;50年窖泥样品单独聚为一簇,相似性指数0.790.83.令人奇怪的是.25年窖泥中层样品与1020年上层样品聚为一簇.相似性指数0.620.67.总体来说,25年窖泥样品与50年样品相似度较高(0.66),而与1020年样品相似度较低(0.54),其中的原因与机理还有待于进一步研究.2.2多样性指数分析ShannonWiener指数(H值)是分析样品中物种多样性中最常见的指数.不同窖龄窖泥细菌群落多样

22、性指数变化规律结果见图2.2.52L_5l0.5O25102O5O窖龄(年)图2不同窖龄窖泥细菌群落多样性指数变化规律从图2可知,不同窖龄窖泥样品中细菌的多样性指数在0.882.2之间.随着窖龄的增加.多样性指数总体上呈先增加后降低的趋势,同一窖龄样品中,中层多样性均高于上,下层,这一趋势在2年,5年和50年窖泥样品中尤其明显,而在1020年窖泥样品中,不同层次的多样性较均衡.中层多样性仅略高于上层,下层.罗惠波【等利用PCRSSCP技术研究某酒厂不同窖龄窖泥(20年,100年,200年,300年)中细菌的多样性结果显示,随着窖龄的增加.相同位置样品的多样性指数总体上呈递增趋势,其中20年窖泥

23、样品中多样性指数上层>下层>中层,而在本研究中,20年窖龄样品中多样性指数中层>上层>下层.此外,50年窖泥样品的多样性指数显着低于1020年窖泥样品,甚至低于25年样品.这与以往对于老窖微生物种群多样性的认识有所不同.但这一结果与课题组采用高通量测序所得的结果相类似(另文发表),其内在机制还有待于进一步研究.2.3优势种群的序列分析测序及系统进化树显示(图3),窖泥中优势种群主要分布厚壁菌门(PhylumFirmicutes)的杆菌纲(ClassBacil1)和梭菌纲(ClassClostrida)2个纲中.B和B7归为一簇,属杆菌纲,其中B3为耐酸乳杆菌(Lacto

24、bacillusacetotoleFOILS(T)DSM20749;M58801),序列相似性100%.乳酸菌是固态法白酒生产的重要微生物.绝大多数都是厌氧菌或兼性厌氧菌,革兰氏阳性.在固态法一一加一捣陶勇,徐占成,李东迅,刘孟华,樊科权,姚开?窖泥细菌群落结构演替及其与环境因子的相关性白酒发酵过程,乳酸菌具有促进美拉德反应,促进酿酒发酵,维护与保持酿酒微生态环境等作用19,由它代谢产生的乳酸与酵母发酵生成的酒精生成乳酸乙酯乳酸乙酯含量的多少在一定程度上决定浓香型大曲酒的质量41,B7与1株芽孢菌(Bacillusfordii;MGA12:HM057850)有99.5%相似性,研究表明.芽孢菌

25、也是产生乳酸的重要菌类:B13,B15,B16,B19和B23归为一簇,属梭菌纲.其中.B13与RDP数据库中已有序列相似较低,与之最接近的是一株未培养的互营共养单胞菌(unculturedPelosporasp.;47IIISN;EU887777),相似性仅93%,而B15则与互营共养单胞菌47IIISN和与1株互营共养单胞模式菌(Syntrophomonassapovorarts(T);AF022249)具有较高的序列相似性.分别为98.9%和97.9%.互营共养单胞菌多为厌氧有机酸降解菌,并产氢或产乙酸【2l】:B16与l株毛螺菌科Lachnospiraceae属细菌(unculture

26、dbacterium;A3C6;EU885019)较分类相近,相似性98.8%,目前还未见该属细菌在窖泥中的报道与研究.llBacillillClostridiaII图3系统进化树Bl9与B23均为未培养瘤胃菌.分别与RDP数据库中已知菌株瘤胃菌T62l6(uriculturedbacterium;T6216;EU828406)和G35一D8一LBF07(unculturedbacterium;G35一D8一L_BF07;EF559144)有95.7%和lO0%的相似性.关于瘤胃菌在酿酒中的作用还未见报道.瘤胃菌绝大部分属厌氧菌,可分解纤维素,果胶等,产生甲酸,乙酸等,其次还分解淀粉和糖类.所

27、产生的产物町能作为合成酯类的底物,但详细的机理还有待于进一步研究.B20,B27与B28归为一簇,属梭菌纲,但其分类上相对其他梭菌纲细菌来说,更接近杆菌纳.其中,B20与未培养的梭菌SRB2(uriculturedAnaerobrancasp.;SRB2;DO069229)有较高的相似性(98.9%),而B27和B28则分别与另一株未培养的梭菌L5(unculturedClostridiabacterium;L5;EU887985)有高达1o0%.99.4%的相似性,但B20与B27和B28之间的相似性较低(87.6%),表明,可能是为不同的属.梭菌早在20世纪80年代就被认为是酿酒生产中重要

28、的功能菌,如泸型梭菌(ClostridiumLushun),耳涡形梭菌8】等均为重要的产己酸菌,关于其窖内发酵机理及生态学作用前人已做了大量研究,部分成果已应用于生产.总体来说.结合DGGE电泳图可知,耐酸乳杆菌(B芽孢菌(B7T3胃菌(Bl9)和梭菌(B28)为剑南春窖泥中的主要优势种群.2.4环境因子与窖泥细菌群落的相关性分析不同窖龄窖泥样品中理化指标及矿质元素含量分析结果见表表2不同窖龄窖泥样品的理1七旨,一一/表2不同窖龄窖泥样品的理化指标一一运用典型对应分析(CCA),将DGGE图谱的数字化结果和窖泥理化指标结合在一起分析,结果见表3.理化指标为水分含量,pH,氨氮,有效磷,腐殖质等

29、5项指标.MonteCarlopermutationtest显示5个环境因子与第一排序轴(P:0.01)和全部排序轴(p:0.004)均有显着的相关性.表3典型对应分析结果表3显示.第1和第2排序轴解释了样本中32.5%的变异,前4个排序轴合并解释了45.7%的样本总变异.第1和第2排序轴的种一环境相关系数分别为0.966和0.902.这说明.窖泥中细菌群落结构与环境因子间存在较强的关联,并且前2个排序轴反映种一环境累积百分变化率达就高到65.6%,这充分解释环境与种的相关性.酿酒科技2011年第9期(总第207期)?UQUORMAKINGSCIENCE&TECHNOLOGY2011N

30、o.9ffo1.207)图4是由AX1和AX2轴生成的二维排序图.如图4所示,pH(r=一0.65),水分含量(r=:一0.49),有效磷一0.80),氨氮(r=一0.73),腐殖质(r=一0.01)均与第1排序轴负相关.其中关联较高的环境变量为有效磷,氨氮和pH,而与第2排序轴关联较高的环境变量主要是腐殖质(r=一0.56)和有效磷(F0.24).从排序图结果可知,有效磷,氨氮,pH水分含量,(r=一0.73),腐殖质与1O年和2O年窖龄窖泥微生物狴落结构呈正相关,而与2年,5年和50年窖泥群落结构呈负相关;腐殖质与2年和5年样品呈正相关,而和1050年样品呈负相关.因此,本文所选千环境变量对窖泥微生物分布的影响.依次为有效磷,氨氮,pH,腐殖质和水分含量.,.-一3结论3.1DGGE结果显示.不同窖龄窖泥样品细菌丰度不同,1020年窖泥样品中细菌丰度最高,然后是25年的窖泥样品,而50年窖泥样品的细菌丰度最低.多样性指数也显示了相似的趋势.此外.细菌丰度和多样性指数分析均显示同一窖龄样品中.中层多样性要高于上层,下层.3.216SrRNA序列分析表明.窖泥中优势种群主要分布在厚壁菌门的杆菌纲和