胡萝卜组织培养系统实验.docx

1、胡萝卜组织培养系统实验云南大学生命科学实验教学中心实 验 报 告课程名称： 细胞工程实验院系：生命科学学院年级专业：2013级生物技术（国家生命科学与技术基地班）姓名：杨梦梅选课号：2015107066学号：20131070156座号：A2开课日期：2015.09 学期：2015秋季学期任课教师：吕琦、牛芸云南大学生命科学实验教学中心 制胡萝卜愈伤组织的诱导、继代及细胞悬浮培养研究第一作者：杨梦梅 同组实验者：赵姗(云南大学生命科学学院, 昆明 650504)摘要: 以胡萝卜肉质根为外植体诱导出愈伤组织, 并建立细胞悬浮系. 实验结果表明: 胡萝卜肉质根是诱导愈伤组织和进行细胞悬浮培养的可行外

2、植体; 诱导致密型愈伤组织的最佳激素浓度配比是 0.5 mg/ L 2, 4- D+ 0.4 mg/ L KT;继代培养 1代 2时,可得到高活性的悬浮细胞系；细胞悬浮培养细胞经过 14 天达到高峰期（生长平台）。关键词: 胡萝卜; 组织培养; 细胞悬浮培养; 致密型愈伤组织; The study about inducement, subculture and suspension cell lines of Carrots callusAbstract: Carrots flesh roots can induce callus as explants, and then it estab

3、lishes suspension cell lines. The experimental results show that: Carrotsflesh roots really can induce callus and then make suspension cell lines. In order to induce high density callus, the best hormone ratio is 0.5 mg/ L 2, 4- D+ 0.4 mg/ L KT. Subculturing the cell line for 1 to 2 times, we can ob

4、tain the suspension cell line with high activity. After 2 weeks, the cell line reaches to the peak of growth.Keywords: Carrot; tissue culture experiments; suspension cell; callus in high density 胡萝卜( Daucus carota L . ) , 属于十字花科植物, 是一种十分重要的蔬菜作物, 由于胡萝卜肉质根营养丰富，约含有88的水、68糖、12植物纤维，0712蛋白质、1灰份及03脂肪 ，及其适于

5、生食、加工、烹调等多种用途, 在世界范围内广泛栽培。中国是农业大国, 胡萝卜作为蔬菜作物在人们生活中起着重要的作用。因此, 加快我国胡萝卜育种研究以成为迫切需要。近些年来, 随着生物技术与分子生物学技术的快速发展, 作为生物技术研究的理想材料, 许多国家对胡萝卜体细胞杂交技术、遗传转化与再生技术、分子标记与基因克隆技术进行了广泛深入的研究。我国科研工作者在胡萝卜的生物技术与分子 生物学研究上也取得了一定进展, 特别是在组织培养、原生质体融合 、遗传转化及再生等方面。但是在胡萝卜细胞培养方面并不是太多, 因此继续深入研究还是很有必要的。本文对胡萝卜愈伤组织诱导的最佳培养基和细胞悬浮培养的条件进行

6、探讨, 为其次生代谢产物- 胡萝卜素、- 胡萝卜素（维生素A前体）的生产以及将来的工厂化和分子生物学研究打下基础。1材料和方法1. 1 材料来源胡萝卜肉质根自农贸市场购买. 1. 2 方法1. 2. 1 MS培养基的配制1000ml1)用大烧杯取蒸馏水100-120ml2)依次用移液管量取加入母液：100ml大量（10x）、100ml大量钙盐（10x）、10ml微量I（100x）、1ml微量II（1000x）、10ml铁盐（100x）、10ml有机（100x）、100ml有机肌醇（10x）、以及适当含量植物激素。 3)称取30g蔗糖加入，搅拌直至全部溶解，作为1号溶液备用。4)称取9g琼脂，用

7、量筒量取500ml蒸馏水一起加入1000ml体积白瓷缸中，放在电炉上一边加热一边搅拌，加热直至清澈无沉淀。将1号溶液加入，继续加热搅拌，至将要沸腾，离火。5)用pH试纸调pH至5.8-6.0 。6)在白瓷缸中定容至1000ml，搅拌均匀。7)分装至350ml培养瓶中每瓶约4050ml。121高压灭菌20min。探究实验：培养基代号基本培养基2，4-D mg/LKTmg/LM1MS无无M2MS1无M3MS20.5M4MS无11. 2. 2胡萝卜愈伤组织的诱导( 1) 以胡萝卜肉质根形成层为外植体诱导。用自来水洗净胡萝卜肉质根, 用小刀切成长约67cm块段, 将其在 75% 的酒精中消毒 60s,

8、 再用0. 1% 的升汞消毒 10min或用20%次氯酸钠水溶液消毒20min, 最后用无菌水漂洗三遍每遍510min.（2）消毒好的胡萝卜根块, 切去形态学下端的510mm厚的一片, 留下部分用消毒好的小刀, 沿截面横切成厚度 35mm 左右的小圆片, 然后将小圆片的韧皮部和木质部切去, 留下形成层, 再切成长 3mm, 宽 1. 5mm, 高 35mm 的小长块, 分别接种在M1、M2、M3、M4的诱导培养基上.（3）获得愈伤后进行继代培养, 培养环境条件与诱导培养相同.1. 2. 3胡萝卜愈伤组织的继代（1）从培养瓶中取出愈伤组织，置于无菌培养皿内，用解剖刀将愈伤组织坏死部分剔除并将愈伤

9、组织切成黄豆大小颗粒，放在无激素的新鲜培养基表面，用镊子轻轻压实，每个培养瓶接种23个切块。用记号笔标注操作者、组别和日期。（2）34周后在相同培养基上继代培养1次。1. 2. 4胡萝卜细胞无菌系的建立悬浮培养（1）用镊子夹取在固体继代培养基上继代 10d 左右的胚性愈伤组织即分散性好、疏松的愈伤, 称取鲜重2g左右的胡萝卜愈伤组织，在灭过菌的培养皿中用无菌镊子尽量将其拨散。（2）将散碎的愈伤组织转移入盛有20ml液体无激素MS培养基的三角瓶中。（3）置于80120r/min摇床上25暗培养。（4）每隔3天换液1次，用吸管吸去3/4旧培养液，再加入等量新鲜培养液。连续培养2 代 4 代后逐渐形

10、成稳定的细胞系。1.2.5胡萝卜细胞再分化实验构建胡萝卜愈伤组织的“器官分化”与“体细胞胚发生”（1）在超净工作台上，用镊子去除继代培养12次的疏松愈伤组织，在无菌载台上分割成长 3mm, 宽 1. 5mm, 高 35mm 的小长块，去除黑色、灰色或棕色的坏死细胞部分。（2）接种在M5、M6培养基上，每瓶13块，轻轻压实，以保证和培养基充分接触。（3)标注清楚组别和日期。26，光照16h/d，4周后观察实验结果。2实验结果2. 1 实验结果记录：2.1.1培养基配置结果：我们组负责配置的是M1，M2，M3，M4每种各接种两瓶。2.1.2愈伤组织诱导结果：总接种瓶数8瓶总接种块数23块污染瓶数3

11、瓶污染块数5未污染瓶数5瓶未污染块数18块未污染块中愈伤组织发生块数15愈伤组织发生率83.33%愈伤组织发生情况记录18块接种成功，其中有11块愈伤组织的色泽较新鲜呈近乎白色，7块颜色偏深黄，浑浊。污染情况及原因分析未成功的3瓶中，污染瓶中，有1瓶是霉菌污染，分析原因为培养基内水分过多，因此要选择水分适宜的培养基； 1瓶细菌污染，可能是接种过程中接种器械消毒不够，掀开封口膜时碰到了封口膜里面，也可能是封口膜没绑好；一瓶为在接种过程中胡萝卜组织被烫伤，分析原因为手术刀在灼烧后没有完全冷却就使用，导致胡萝卜切面被烫伤。2.1.3愈伤组织继代培养结果：总接种瓶数4瓶总接种块数11污染瓶数2污染块数

12、5未污染瓶数2未污染块数6未污染块中愈伤组织发生块数6愈伤组织发生率100%愈伤组织发生情况记录6块接种成功，其中有4块愈伤组织的色泽较新鲜呈浅黄色，2块颜色偏深黄，浑浊。污染情况及原因分析两瓶都是在接种过程中胡萝卜组织被烫伤，分析原因为手术刀在灼烧后没有完全冷却就使用，导致胡萝卜切面被烫伤。2.1.4胡萝卜细胞无菌系的建立悬浮培养结果：（以大组812人统计结果）瓶号接种质量g3天后质量g6天后质量g14天后质量g平均每天增值质量g11.982.002.733.900.142.1.5胡萝卜细胞再分化实验构建胡萝卜愈伤组织的“器官分化”与“体细胞胚发生”结果：因实验培养时间问题，还未观察到具体结

13、果。预测实验结果为：如果愈伤组织脱分化以后进行再分化，则应当先时愈伤组织下部分化出根，在上部发育出芽，随着不断地生长，最终发育成完整的植株；如果是体细胞胚发生，则可以不经过愈伤组织阶段就可以发育为体细胞胚；但是体细胞胚比愈伤组织难生成得多，很多植物还无法进行体细胞胚的诱导生成，体细胞胚一旦形成，便可慢慢的分化为完整的植株。与愈伤组织发生相比，体细胞胚更不容易发生遗传变异，从而诱导分化发育成的植株更稳定。2.2实验结果图片第一次培养M1-1 M2-1 M2-2 M4-1 M3-1 培养成功M4-2 霉菌M1-2 细菌污染M3-2 细菌污染 烫伤污染情况：接种8瓶，污染3瓶，5瓶未污染第二次培养1

14、-2烫伤2-1霉菌1-1 愈伤组织2-2愈伤组织继代实验情况因未观察到，所以未附图。3.分析讨论：3.1对实验现象、实验结果的分析及其结论3.1.1胡萝卜愈伤组织诱导实验中，被污染了5瓶，说明在整个实验过程中，一定要注意无菌操作，否则，任何一个环节染菌都会导致外植体被污染，使得实验失败。3.1.2外植体的选择很重要，由于实验中选了根部上端，但切面比较靠内的胡萝卜，与其他组相比愈伤组织的量或是色泽方面都比较好，但切块太小，也许是因为不一样大小的胡萝卜，但消毒时间是一样的，可能使得胡萝卜组织受伤较重。3.1.3同一小组中，或同一个人的实验结果都会不一样，这是由于个人操作差异，主要是培养基分装时没混

15、匀，以及无菌操作不够规范，实验熟悉度不过造成的。3.1.4外植体经过消毒等处理，可在愈伤组织诱导培养基上进行培养，诱导脱分化形成愈伤组织，并且通过改变2,4-D和KT的浓度，可以诱导愈伤组织再分化形成植物体然后再在继代培养基上可以增殖得到更多更好的愈伤组织。3.2实验总结3.2.1植物组织培养实验一般历时较长，因此要及时将实验过程中的每一部分的操作内容以和实验数据记录下来。以后每门实验课都应当准备一本实验记录本，用于记录数据，在实验数据出现问题时也方便排查问题所在。3.2.2由于是以小组形式进行实验，所以每个人的工作安排合理的话，可以提高效率。各个大组分别轮流成批配置培养基可地有效节约了时间与

16、精力。3.2.3在本次实验中我了解并掌握了胡萝卜愈伤组织的诱导和继代培养的原理和一般流程。3.2.4对植物组织培养实验中熟练掌握无菌操作的技术十分的重要，它对实验的成功直接影响，可有效提高愈伤组织的成活率。3.2.5由于本次实验中所需的培养基配方是由老师提供的，所以对于培养基配方的确定这一方面的把握不够。实验中愈伤组织的诱导培养和继代培养条件和时间等都是由老师进行安排，我们只是来看结果，所以实际上，对于培养条件等我们都掌握不够。3.2.7总得来说，对于实验操作流程和注意事项，以及实验结果的观察分析还是能够掌握的。4.展望拓展：这次的实验总体来说还是失败的，第一次实验成功率低原因在于在做实验前没

17、有好好了解实验流程，虽然老师在上课时做了相应的讲解，但一些细节上的操作和技巧还是没有弄明白,对于无菌操作的重要性还是没有深刻的意识。在第二次实验中我更加注意了这个问题，将无菌操作台上的物品按最合理的方式放置，既不影响操作，也方便拿取，操作过程不离实验台，仪器轻拿轻放，尽量不带起空气大幅度流动，将酒精灯移到空气滤膜附近，在整个过程都在酒精灯旁操作；另一方面，在以后的实验中自己一定要提前对实验内容有所了解，将课件及实验讲义上的知识吃透,理清实验思路。这是能做出成功实验的基础,否则,在老师讲解时听不懂,自己思路不清晰，这将使我们在做实验时的难度加大,浪费做实验的宝贵时间，实验也不易做成功。经过这次的

18、测试技术实验,我个人得到了不少的收获,一方面加深了我对课本理论的认识,另一方面也提高了实验操作能力。这次的实验跟我们以前做的实验不同，因为这次实验大部分是个人操作，我觉得这次我是真真正正的自己亲自去完成，所以是我觉得这次实验最宝贵，最深刻的。比较高兴的一点是我的愈伤组织成活率在同班同学里还是比较高的，在准备愈伤组织的扩大化培养中，大多数同学用的都是我的材料，心里感到很自豪。在这次的实验中我也深深体会到课本上的纯理论知识对于实践的指导作用：弄懂实验原理，然后通过实验的操作的靠自己亲自动手，亲自开动脑筋，亲自去请教别人才能得到提高的。临近期末，非常感谢牛芸老师和吕琦老师在本学期给予我们的细致生动的

19、教学，也许以后不见得会再学习更多更加专业的后续课程，但是它对于我们拓展专业及相关知识面、温习所学的细胞工程内容、应用理论分析问题、解决问题的方面体现的思维方式却让我受益匪浅。特别是牛芸老师在指导我实验操作时说的那一句“这样来控制会比较省力，可爱的孩子!”谢谢老师的悉心教导，在此，学生提前祝福老师新年快乐，身体健康!参考文献：1 汪洪；夏鸿亮；李校；杨树林. 胡萝卜愈伤组织诱导培养的研究J.北方园艺,2012(06):103105.2 尹文兵；李丽娟；黄勤妮；李艳红. 胡萝卜愈伤组织的诱导及细胞悬浮培养研究J.山西师范大学学报（自然科学版版）,2004(06):7176.3 莫德鑫；郭玉华；孙静

20、；耿惠莉. 胡萝卜组织培养J. 教学仪器与实验,2010,7(26):4243.4 曾小美；王凌健；夏镇澳；沈允钢. 胡萝卜光自养型愈伤组织的诱导培养及其光合特性J.实验生物学报, 2003,36(1):1822.5 胡蓉. 胡萝卜愈伤组织建立中的几个问题探讨J. 川北教育学院学报（自然科学版）,1995（02）:79.6 吴石君；林忠平；马诚；王玉秀；赵玉锦；刘红军. 从胡萝卜愈伤组织分离的原生质体获得再生植株J. 遗传学报, 1977,4(04):363365.7 周玲艳；秦华明. 胡萝卜悬浮细胞系及高效再生系统的建立J. 安徽农业科学, 2006,34(16):39293931.8 李浚明；朱登云. 植物组织培养（第3版）.中国农业大学出版社,2005,2(01):3639.9 潘瑞炽.植物组织培养（第三版）. 广州：广东高等教育出版社,2003(01):243247.10 郭勇；崔堂兵；谢秀帧编著.植物细胞培养与应用.北京：科学出版社,2004(07):611.教师评语：成绩签名日期