RNA提取及反转录_精品文档.ppt

1、RNA提取提取Week 6RNA提取提取RNA提取纯化目的提取纯化目的RNA提取纯化原理提取纯化原理RNA提取纯化的实验流程提取纯化的实验流程RNA的评价与鉴定的评价与鉴定 实验目的实验目的了解了解RNA相关操作中的注意事项相关操作中的注意事项掌握掌握Trizol法提取组织总法提取组织总RNA的原理及提取的原理及提取的方法的方法了解了解RNA评价鉴定评价鉴定的相关指标的相关指标注意事项注意事项1 1、全程佩戴一次性手套、全程佩戴一次性手套!防止皮肤防止皮肤RNARNA酶污染；酶污染；2 2、研钵、钥匙研钵、钥匙160160 烘箱高温灭菌烘箱高温灭菌4h4h；3 3、超净工作台紫外灭菌、超净工作

2、台紫外灭菌1.5h1.5h，枪头、离心管高压灭，枪头、离心管高压灭菌。菌。4实验材料实验材料大叶藻大叶藻细胞裂解原理细胞裂解原理Trizol法法即异硫氰酸胍即异硫氰酸胍-苯酚法苯酚法细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解在核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放在核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放RNA分离纯化，分离纯化，DNA和和RNA不同不同pH溶解溶解度不同度不同RNA沉淀沉淀实验步骤实验步骤1、取、取100mg样品，液氮研磨充分样品，液氮研磨充分,加入加入1mL Trizol,涡旋混匀，室温下放置涡旋混匀，室温下放置5min,裂解。裂解。2、向裂解液中、向裂解液中加

3、入加入200 L氯仿，剧烈震荡氯仿，剧烈震荡15s，室，室温放置温放置2-3min，4，12000rpm,离心离心15min。3、取上清液取上清液（400 L）于另一离心管中，加入于另一离心管中，加入400 L异丙醇混匀异丙醇混匀，冰上放置，冰上放置15min，4，12000rpm,离心离心10min。4、弃上清，弃上清，RNA沉于管低，加入沉于管低，加入75%乙醇乙醇1mL，温和震荡，悬浮沉淀。温和震荡，悬浮沉淀。5、4，12000rpm,离心离心15min，弃上清，在超净工，弃上清，在超净工作台中风干作台中风干5-10min。6、加入加入30 L的的DEPC水溶解沉淀。水溶解沉淀。RNA的

4、评价与鉴定的评价与鉴定1、1.0%琼脂糖凝胶检测琼脂糖凝胶检测检测检测RNA的完整性的完整性2、核酸蛋白定量仪测、核酸蛋白定量仪测检查检查RNA的纯度的纯度1.0%琼脂糖凝胶检测琼脂糖凝胶检测 原理：琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定核酸的常规方法。核酸是两性电解原理：琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定核酸的常规方法。核酸是两性电解质，其等电点为质，其等电点为pH2-2.5，在常规的电泳缓冲液中（，在常规的电泳缓冲液中（pH约约8.5），核酸分），核酸分子带负电荷，在电场中向正极移动。核酸分子在琼脂糖凝胶中泳动时，子带负电荷，在电场中向正极移动。核酸分子在琼脂糖凝胶中泳动时，具有电荷效应和分子筛效应，但主要为分子

5、筛效应。因此，核酸分子的具有电荷效应和分子筛效应，但主要为分子筛效应。因此，核酸分子的迁移率由下列几种因素决定：迁移率由下列几种因素决定：（1）DNA的分子大小；（的分子大小；（2）DNA分子的构象；分子的构象；（3）电源电压；）电源电压；（4）离子强度影响）离子强度影响 溴化乙啶溴化乙啶(Ethidium bromide,EB)能插入能插入DNA分子中形成复合物，分子中形成复合物，在波长为在波长为254nm紫外光照射下紫外光照射下EB能发射荧光，而且荧光的强度正比于能发射荧光，而且荧光的强度正比于核酸的含量，如将已知浓度的标准样品作电泳对照，就可估算出待测样核酸的含量，如将已知浓度的标准样品

6、作电泳对照，就可估算出待测样品的浓度。由于溴化乙啶有致癌的嫌疑，品的浓度。由于溴化乙啶有致癌的嫌疑，所以现在也开发出了安全的所以现在也开发出了安全的染料，如染料，如Sybergreen。操作方法：操作方法：制备琼脂糖凝胶：按照被分离制备琼脂糖凝胶：按照被分离DNA分子的大小，决定凝胶中琼脂糖分子的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量；一般情况下，可参考下表：的百分含量；一般情况下，可参考下表：凝胶浓度（凝胶浓度（%）线性线性DNA长度（长度（bp）0.5 100030000 0.7 80012000 1.0 50010000 1.2 4007000 1.5 2003000 2.0 502000 1

7、制备琼脂糖凝胶：称取琼脂糖，加入制备琼脂糖凝胶：称取琼脂糖，加入1xTAE电泳缓冲液，待水合数分电泳缓冲液，待水合数分钟后，置微波炉中将琼脂糖融化均匀。在加热过程中要不时摇动钟后，置微波炉中将琼脂糖融化均匀。在加热过程中要不时摇动,使附使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液；加热时应盖上封口膜于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液；加热时应盖上封口膜,以减少水份蒸以减少水份蒸发。发。2胶板的制备：将胶槽置于制胶板上胶板的制备：将胶槽置于制胶板上,插上样品梳子插上样品梳子,注意观察梳子齿注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙，待胶溶液冷却至左右的间隙，待胶溶液冷却至50左右时，左

8、右时，轻轻倒入电泳制胶板上，除掉气泡；待凝胶冷却凝固后，垂直轻拔梳轻轻倒入电泳制胶板上，除掉气泡；待凝胶冷却凝固后，垂直轻拔梳子；将凝胶放入电泳槽内，加入子；将凝胶放入电泳槽内，加入1x电泳缓冲液，使电泳缓冲液液面刚电泳缓冲液，使电泳缓冲液液面刚高出琼脂糖凝胶面；高出琼脂糖凝胶面；3加样：点样板或薄膜上混合加样：点样板或薄膜上混合DNA样品和上样缓冲液，上样缓冲液样品和上样缓冲液，上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于的最终稀释倍数应不小于1X。用。用10 L微量移液器分别将样品加入胶微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内，每加完一个样品，应更换一个加样头，以防污染，板的样品小槽内，每加完一个样品

9、，应更换一个加样头，以防污染，加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面。（注意：加样前要先记下加样的加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面。（注意：加样前要先记下加样的顺序和点样量）。顺序和点样量）。4电泳：加样后的凝胶板立即通电进行电泳，电泳：加样后的凝胶板立即通电进行电泳，DNA的迁移速度与电的迁移速度与电压成正比，最高电压不超过压成正比，最高电压不超过5V/cm。样品由负极（黑色）向正极（红。样品由负极（黑色）向正极（红色）方向移动。电压升高，琼脂糖凝胶的有效分离范围降低。当溴酚色）方向移动。电压升高，琼脂糖凝胶的有效分离范围降低。当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时，停止电泳。处

10、时，停止电泳。5观察和拍照：电泳完毕，取出凝胶观察和拍照：电泳完毕，取出凝胶,EB染色。在波长为染色。在波长为254nm的紫的紫外灯下观察染色后的电泳胶板。外灯下观察染色后的电泳胶板。DNA存在处显示出肉眼可辨的桔红色存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带。荧光条带。呈现出呈现出3条条rRNA带，分别带，分别是是5s、18s、28s rRNA的的带。带。28s亮度是亮度是18s亮度的二倍亮度的二倍。核酸蛋白定量仪检测核酸蛋白定量仪检测OD260/230和和OD260/280比值。比值。OD260/230应该在应该在2.2左右，低于左右，低于1.8表明有明显表明有明显的有机物如糖、肽、苯酚、的有机

11、物如糖、肽、苯酚、Trizol等污染等污染OD260/280应在应在1.8-2.2，我们认为，我们认为RNA中的蛋中的蛋白等污染时可以容忍的，小于白等污染时可以容忍的，小于1.8，污染较明，污染较明显，大于显，大于2.2时，说明时，说明RNA已水解成单核苷酸已水解成单核苷酸RNA反转录反转录Week 6RNA反转录反转录RNA反转录目的反转录目的RNA反转录原理反转录原理RNA反转录的实验流程反转录的实验流程思考题思考题 实验目的实验目的u学习和掌握学习和掌握cDNA第一链合成的原理第一链合成的原理u学习和掌握学习和掌握cDNA第一链合成的操作方法第一链合成的操作方法实验原理实验原理u反反转录

12、是以转录是以RNA为模板为模板,通过反转录酶，合通过反转录酶，合成成DNA的过程，是的过程，是DNA生物合成的一种特生物合成的一种特殊方式。殊方式。u本实验中本实验中cDNA第一链的合成是用第一链的合成是用oligo dT做引物与真核生物做引物与真核生物mRNA的的3末端的末端的poly A配对，在配对，在RNA聚合酶的催化下利用聚合酶的催化下利用dNTP合合成与成与RNA配对的配对的cDNA第一链。第一链。实验步骤实验步骤1、取、取1.0 g的的RNA加入加入1 L的的oligodT在在75条件下放置条件下放置5min，然后立即冰浴，然后立即冰浴5min2、再加入以下试剂：、再加入以下试剂：M-MLV Buffer 4 LdNTP 2 LRNase inhibitor 0.5 LM-MLV 0.5 LDEPC 补至补至 20 L3、将体系混匀后瞬时离心，、将体系混匀后瞬时离心，42温浴温浴90min，然后，然后95 5min,灭活酶活性。灭活酶活性。思考题思考题反转录中，反转录中，ologo dT的作用是什么？的作用是什么？