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1、腺病毒中文操作手册腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统AdEasyTM操作手册目 录第一章 简介 1第二章 应用重组腺病毒的优点 2第三章 AdEasyTM 技术 33.1 技术概况 33.2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程 3第四章 主要流程 44.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体 4 4.1.1 克隆的一般原则 4 4.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体 54.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生 5 4.2.1 共转化的一般原则 5 4.2.2 共转化方法 5 4.2.3 预期结果 54.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增 64.4 AdEasyTM重

2、组子转染QBI-293A细胞 6 4.4.1 细胞铺板 6 4.4.2 磷酸钙转化技术 7第五章 常用技术 85.1 QBI-293A细胞培养 8 5.1.1 QBI-293A细胞的初始培养 8 5.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖 8 5.1.3 QBI-293A细胞的冻存 85.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生 9 5.2.1 感染QBI-293A细胞 9 5.2.2 病毒空斑形成 9 5.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞 95.3 MOI测定 105.4 腺病毒感染力测定 10 5.4.1 X-Gal染色 115.5 重组腺病毒的筛选和纯化 11 5.5.1 挑选最

3、佳重组腺病毒：表达和基因输送 11 5.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增 12 5.5.3 Western杂交 13 5.5.4 Southern杂交和点杂交 13 5.5.5 病毒裂解产物PCR 14 5.5.6 免疫测定 14 5.5.7 功能测定 145.6 病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增 155.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒 16 5.7.1 不连续密度梯度离心 17 5.7.2 连续密度梯度离心 17 5.7.3 病毒溶液去盐和浓集 175.8 病毒滴度测定 18 5.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 19 5.8.2 空斑测定法 20 5.8.3

4、50%组织培养感染剂量法 20第六章 疑难解答 226.1 QBI-293A细胞培养 226.2 感染力测定 226.3 转移载体克隆 236.4 在BJ5183细胞中共转化和重组 246.5 转染QBI-293A细胞 256.6 筛选和测定 256.7 在QBI-293A细胞中表达 266.8 重组腺病毒的扩增 266.9 纯化 266.10 病毒滴度测定 27缩写 英文全称 中文全称Ad Adenovirus 腺病毒Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素-Gal -Ga

5、lactosidase -半乳糖苷酶bp Base Pair 碱基对BSA Bovine Serum Albumin 小牛血清白蛋白cDNA Complementary DNA 互补DNAcccDNA Closed Circular Coiled DNA 闭环螺旋DNACPE Cytopathic Effect 细胞病理效应CsCl Cesium Chloride 氯化铯DMEM Dulbeccos Modified Eagle Medium DMEM培养基DMSO Dimethyl Sulfoxide 二甲基亚砜DTT Dithiothreitol 二硫苏糖醇EDTA Ethylene Di

6、amine Tetraacetic Acid 乙二胺四乙酸EtBr Ethidium Bromide 溴化乙锭FBS Fetal Bovine Serum 胎牛血清Hr Hour 小时ITR Inverted Terminal Repeat 反向末端重复Kan Kanamycin 卡那霉素kb Kilobases 千碱基对KDa KiloDaltons 千道尔顿LB Luria-Bertani ( broth ) LB培养基MCS Multiple Cloning Site 多克隆位点Min Minute 分钟MOI Multiplicity of Infection (Virus/Cell

7、) 感染复数mRNA Messenger RNA 信使RNAMWCO MOIecular Weight Cut-off PAGE PolyAcrylamide Gel Electrophoresis 聚丙烯凝胶电泳PBS Phosphate Buffered Saline 磷酸盐缓冲液PFU Plaque Forming Unit 空斑形成单位pi Post Infection 感染后RCA Replication Competent Adenovirus 增殖性腺病毒RITR Right Inverted Terminal Repeat 右侧反向末端重复SDS Sodium Dodecyl

8、Sulfate 十二烷基硫酸钠TBE Tris Borate/EDTA 三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四乙酸TCID50 Tissue Culture Infectious Dose 50 50%组织培养感染剂量TCP Total Cellular Protein 细胞总蛋白TE Tris/EDTA TE溶液wt Wild Type 野生型X-Gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside 5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷第一章 简 介当今基因输送技术的发展日趋复杂，一些治疗药物（生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋白（单

9、克隆抗体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。人类基因组计划和正不断发展的基因治疗同样急需发展快速有效和治疗性的分析工具。为解决这一问题，基因输送技术(通常使用病毒载体如增殖缺陷的腺病毒)通过基因工程不断发展，致力于生产基因表型药物。重组腺病毒提供了一类在基因转移系统发展中有极大潜力的新的生物治疗剂。1953年对普通感冒病因的探索和研究导致了腺病毒的发现。迄今为止已发现了40多种不同血清型和93种不同种类的腺病毒，它们通常感染眼、呼吸道或胃肠上皮（Fields等，1996）。1977年，Frank Graham博士建立了一种细胞株，可在无辅助病毒的情况下产生重组腺病毒（Graham等，

10、1977）。此后，腺病毒载体作为极具潜力的哺乳动物基因转移载体而得到广泛应用，尤其是在基因治疗相关领域。迄今为止已有大量关于腺病毒及其应用的综述发表，我们给感兴趣的读者推荐以下文章：Hitt et al，1999和Wivelet al，1999。腺病毒亦可被用来在人体细胞中过量表达蛋白（Massie et al，1998 A, B）。但迄今为止还只有熟知腺病毒的研究人员才会采用腺病毒系统。昆腾生物科技公司是第一个提供完备而且能广泛应用的重组腺病毒试剂盒Adeno-QuestTM系统及其相关产品和客户服务的公司，这个系统的基础是在293细胞中产生重组腺病毒。现在介绍的AdEasyTM系统以细菌内

11、重组取代哺乳动物细胞（He et al，1998），使获得重组腺病毒对任何有细胞培养设备的分子生物实验室都更方便。重组腺病毒事实上可在任何细胞或组织中用来研究表达重组蛋白。AdEasyTM转移载体可允许插入7.5kb的外源DNA，目前正研究腺病毒其它区的缺失以提高腺病毒在基因治疗中的应用。这本手册提供了重组腺病毒技术中所有必须遵循的原则，并详细描述了产生一个重组腺病毒的所有实验步骤，包括重组腺病毒在QBI-293A细胞中扩增并纯化到1012VP的操作步骤。AdEasyTM载体系统包含了生产5型重组腺病毒所需的全部试剂，所有成分购买后即可使用。第二章 应用重组腺病毒的优点1. 宿主范围广, 对人

12、致病性低这套腺病毒载体系统可广泛用于人类及非人类蛋白的表达。腺病毒可感染一系列哺乳动物细胞，因此在大多哺乳动物细胞和组织中均可用来表达重组蛋白。2. 在增殖和非增殖细胞中感染和表达基因逆转录病毒只能感染增殖性细胞，因此DNA转染不能在非增殖细胞中进行，而必须使细胞处于持续培养状态。腺病毒则能感染几乎所有的细胞类型，除了一些抗腺病毒感染的淋巴瘤细胞。腺病毒是研究原代非增殖细胞基因表达的最佳系统，它可以使转化细胞和原代细胞中得到的结果直接进行对比。3. 能有效进行增殖，滴度高这套腺病毒系统可产生1010到1011VP/ml，浓缩后可达1013VP/ml，这一特点使它非常适用于基因治疗。4. 无需辅

13、助病毒，可容纳7.5 kb外源DNA： 为提供克隆空间，此腺病毒缺失了E1和E3早期区。此外，此腺病毒可包装比正常病毒DNA稍大的DNA分子（105%）。这些特点允许插入腺病毒的基因或多基因表达盒可达7.5kb。5. 与人类基因同源该腺病毒载体系统应用了人类病毒作为载体，以人类细胞作为宿主，因此为人类蛋白进行准确的翻译后加工和适当的折叠提供了一个理想的环境。大多数人类蛋白都可达到高水平表达并且具有完全的功能。6. 不整合到染色体中，无插入致突变性逆转录病毒可随机整合到宿主染色体，导致基因失活或激活癌基因。而腺病毒则除了卵细胞以外几乎在所有已知细胞中都不整合到染色体中，因此不会干扰其它的宿主基因

14、。在卵细胞中整合单拷贝病毒则是产生具有特定特征的转基因动物的一个较好的系统。7. 能在悬浮培养液中扩增： 293细胞可以适应悬浮培养，这一调整可使病毒大量扩增。大量事实证明悬浮293细胞可在120L的生物反应器中表达重组蛋白。8. 能同时表达多个基因这是第一个可以在同一细胞株或组织中用来设计表达多个基因的表达系统。最简单的方法是将含有两个基因的双表达盒插入腺病毒转移载体中，或者用不同的重组病毒共转染目的细胞株来分别表达一个蛋白。测定不同重组病毒的MOI比值可正确估计各重组蛋白的相对共表达情况。第三章 AdEasyTM技术3.1 技术概览AdEasyTM系统是由T.C.He等（1998）构建的用

15、来代替传统腺病毒重组系统的一个快捷系统。在这个系统中，只需二步即可产生重组腺病毒：先将表达盒装入转移载体，然后再通过同源重组插入腺病毒基因组。将外源基因插入腺病毒的最有效途径是通过同源重组，原因是：1）腺病毒DNA是大型的线性分子，含有几乎所有的内切酶切位点；2）基因组过大（36kb），难于操作。在AdEasyTM载体系统中，含有大部分腺病毒基因组的载体为超螺旋质粒，而不是线性DNA，同源重组则在大肠杆菌进行。相对于传统系统而言，这二点改进使病毒DNA操作更容易，同时由于利用了大肠杆菌的高效率同源重组特性而使重组载体的筛选更为简单。在本系统中，首先将基因cDNA插入一个转移载体，将得到的质粒用

16、PmeI线性化，然后在大肠杆菌BJ5183中与病毒DNA质粒pAdEasy-1进行同源重组。pAdEasy-1缺失了E1和E3区，其E1区功能将在293A细胞中得到互补。重组子通过卡那霉素筛选，用内切酶进行鉴定分析。最后将得到的重组腺病毒用PmeI线性化，暴露其反向末端重复序列（ITR，Iaverted Termined Repeats），转染QBI-293A细胞后产生重组病毒颗粒。同源重组在线性化的转移载体和完整的超螺旋腺病毒质粒之间进行。应用完整的腺病毒质粒而不用内切酶进行线性化，对于产生重组腺病毒至关重要。转移载体中的卡那霉素抗性基因则可用来筛选重组子。由于线性化的转移载体产生卡那霉素抗

17、性克隆的背景较低，因此此同源重组系统有较高的信噪比。大肠杆菌BJ5183有recA活性，但同时缺失介导细菌重组的其它酶，具有高效的转化和重组能力。一旦重组子经确定，则可转入普通的无recA、endA活性的细菌株如DH5等进行扩增。由于缺乏recA活性，DH5不能用于腺病毒的同源重组。3.2 Ad EasyTM系统中产生重组腺病毒的时程与传统系统相比，AdEasyTM系统中筛选和纯化腺病毒所需的时间大大缩短了。克隆和筛选约需1-3周，重组后需验证重组病毒质粒是否含有目的基因。重组子在DH5中扩增后转入哺乳动物细胞293A，最后将293A细胞中产生的重组病毒颗粒进行纯化和滴定。最终得到的重组腺病毒

18、只能在提供E1区功能的293A细胞中进行增殖。一般来说，用传统方法产生重组腺病毒并不需要大量工作，每天只需1小时进行细胞传代和观察空斑形成。但由于病毒空斑形成速度慢，整个过程就需要很长时间。而AdEasyTM载体系统用大肠杆菌产生重组病毒，大大缩短了所需时间。我们强烈建议初学者用QBI-Infect阳性对照进行感染力测定（见5.2.2）。进行这些测定之前，必须先扩增QBI-293A细胞（见5.5.1）。感染力测定使你能观察到病毒增殖导致的细胞表型的改变，获知你所用细胞对腺病毒的敏感性，而病毒空斑测定可让你观察到病毒空斑的形成。第四章 主要流程4.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体AdEa

19、syTM系统中有2种转移载体可供进行重组腺病毒构建：pShuttle和pShuttle-CMV，这2个载体都含有多克隆位点（MCS）供插入基因。pShuttle不含有启动子和多聚腺苷酸位点（polyA），允许插入含特定启动子和polyA位点的表达盒。pShuttle-CMV含有单拷贝CMV启动子和polyA位点供基础表达和高表达重组蛋白，你只需将目的基因插入pShuttle-CMV的多克隆位点。表1提供了各转移载体的特性。表1 AdEasyTM转移载体特性载体名称 克隆能力 启动子 polyA位点 克隆位点 线性化位点 说明pShuttle 7.5kb MCS 共转化位点PmeI（ECoRI）

20、转染位点（PacI） 将完整的表达盒装入多克隆位点（MCS）pShuttle-CMV 6.6kb CMV + MCS 共转化位点PmeI（ECoRI）转染位点（PacI） CMV启动子能在大多数哺乳动物细胞中高效表达蛋白4.1.1 克隆的一般原则AdEasyTM转移载体的特殊设计使其极易在克隆中应用，但在设计克隆策略时应考虑以下因素：1） 在BJ5183中进行共转化之前必须将转化载体线性化。确证表1中所列的线性化位点不存在于插入的基因中。注意：在pShuttle中用EcoRI线性化时，需要用RecA辅助的限制性内切酶进行酶切。如果插入基因含有所有线性化酶切位点，那么必须进行定向突变。2） 重组

21、腺病毒质粒在转染QBI-293A细胞之前也必须用PacI进行线性化。同样，插入基因中不能含有PacI位点，如果有则必须进行定向突变。3） 克隆能力是指质粒载体能够克隆并且不影响病毒增殖能力的插入基因的最大长度。各转移载体的克隆能力见表1，建议插入基因的长度最好不超过它的上限。在pShuttle和pShuttle-CMV中分别插入大于7.5kb和6.6kb的基因将大大降低整个系统的效率。尽管也可能得到重组子，但可能会发生DNA重排，生长速度也将减慢。4） 如果要插入多个表达盒，应避免以头对头方向插入相同的元件（如CMV启动子），否则同源重组时两个元件之间的部分可能会发生丢失。5） 在进行构建腺病

22、毒之前最好测定重组蛋白的暂时性表达。这里没有提供详细的操作方法，但在CMV或其它强力启动子控制下的基因很容易进行暂时性表达实验。但某些启动子控制下的蛋白表达水平在无病毒增殖时可能不足以达到检测水平。6） 载体DNA可用氯化铯溴化乙锭平衡密度梯度离心或亲和柱法进行纯化。我们不主张用小量粗制的DNA进行转化和转染实验，因为污染的DNA将大大降低菌落和空斑的形成数。4.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体构建重组AdEasyTM转移载体的一般指导如下，但我们建议对于详细的克隆技术和操作方法还需参考通用的分子生物学手册。1 若cDNA含有位置正确的粘性内切酶位点，则可将它直接克隆入转移载体。如果没

23、有，可以使用钝末端内切酶位点，也可用含合适的酶切位点的引物进行PCR或连接含有酶切位点的接头使cDNA产生新的酶切位点。PCR插入酶切位点的方法较快速，但对于长cDNA则应使用连接接头，因为在扩增过程中Taq酶可能会使序列的某些位点发生突变。2 插入基因的鉴定可以用限制性内切酶分析或PCR的方法。3 转化之前用PmeI或EcoRI将转移载体重组子线性化，消化应尽可能彻底，以减少背景信号。4 琼脂糖凝胶上观察消化产物，若消化已完全，放入65 20分钟进行灭活。5 凝胶纯化线性化载体。尽管胶纯化可能会降低转化效率，但不完全消化往往产生较高的背景，从而降低重组率。将线性化质粒去磷酸化也有助于降低背景

24、信号。6 重悬纯化的DNA，浓度至少为0.2ug/ul。每个转化实验取1ug进行，包括对照。4.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生4.2.1 共转染的一般原则1） 将线性化转移载体和pAdEasyTM-1 DNA共转化BJ5183必须要用高活性的感受态细胞。试剂盒中提供的细菌为电穿孔感受态，有很高的转化效率。如果不用电穿孔法进行转化，那么必须制备化学敏感性感受态细胞，并在应用之前试验其转化活性（108已足够）。2） DH5不可用于转化，因其不支持重组，它只是用来扩增重组病毒DNA。3） 本实验需要2ug线性化胶纯化的重组转移载体，共转化和对照各需1ug。4.2.2 共转化方法同时进行实验组

25、和对照组的转化实验：实验组共转化：1ug线性化重组转移载体（5ul）和1.0ul pAdEasyTM-1载体（100ug/ul）对照组转化：1ug（5ul）线性化重组转移载体1 将BJ5183感受态细胞和电穿孔杯置于冰上。将细胞分为2管，每管40ul。2 40ul感受态细胞中至多加入6ul DNA，且DNA必须溶于水，避免含有离子。3 将BJ5183转入2mm电穿孔杯，防止有气泡形成。4 按电穿孔供应商的使用说明转化BJ5183，Bio-Rad仪器一般使用的参数为：200 Ohms、25uF、2.5KV；BTX仪器则为：5 Ohms、2.5KV、C=0。5 用1mlLB重悬转化物。6 转入15

26、50ml离心管中，37震荡培养60分钟。7 将转化物铺35块 LB/Kan（50ug/ml）培养板，37培养24小时。建议分别铺100、300和600ul，以提高至少在一块板中得到可分离菌落的机率，应该得到40100个菌落。8 挑出24个最好的克隆，转入2ml LB/Kan（50ug/ml）培养液中培养1015个小时。不要储存BJ5183培养液，因有可能产生非目的重组子。尽快抽提重组AdEasyTM质粒。9 用传统碱裂解法小量制备质粒，取一半进行0.7%琼脂糖凝胶电泳，验证超螺旋质粒的大小。玻璃珠或树脂制备质粒的试剂盒应避免使用，但粘粒DNA抽提试剂盒可以用。重组质粒大小约40kb，由于它是低

27、拷贝质粒，所以小量制备时应相应调整具体操作。4.2.3 预期结果20%以上的菌落应含有大质粒（近40kb），这些是侯选重组子。与对照培养板生长的菌落进行对照即可大概估计线性化转移载体再连接所致的背景强弱。由于在此高效重组recA+细菌中重组转移载体会形成多聚体，因此背景将表现为一个梯度。4.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增将侯选重组子进行酶切分析，验证其结构。比如：PacI酶切后通常得到约30kb的片段和一个3.0或4.5kb的小片段。小片段的大小因重组位置在左臂还是复制子而不同。建议同时用克隆基因的内切酶进行分析，鉴定是否含有插入基因。挑选最佳阳性重组子转入DH5中进行扩增：转化DH

28、5只需1-5ul小量制备的重组子。这一步对于扩增时保持重组DNA的结构是必需的，因为AdEasyTM这样的大质粒在recA+细菌株如BJ5183中是不稳定的，会迅速出现缺失,而在DH5中能很容易地获得大量DNA。1 将DH5感受态细胞和电穿孔杯置于冰上。2 将1-5ul DNA加入40ul DH5感受态细胞中，DNA必须用水溶，避免含有离子。3 将DH5感受态细胞转入2mm电穿孔杯，防止形成气泡。4 按照说明转化DH5：Bio-Rad仪器一般使用的参数为：200 Ohms、25uF、2.5KV；BTX仪器则为：50 Ohms、2.5KV、C=0。5 将转化混合液重悬于1ml LB中。6 转入1

29、5-50ml离心管中，37振荡培养60分钟。7 培养后用LB按一定梯度稀释转化的DH5（1:10、1:100和1:1000）8 取100ul转化液铺在LB/Kan（50ug/ml）板上，37培养24小时。未用的转化液可在4保存-2周。9 每个重组子挑13个克隆转入5ml LB扩增，以备有足够量质粒。这时，用内切酶再次分析重组DNA，以确证含有插入基因，以及重组子的稳定性。10 用柱纯化试剂盒制备至少5ug高质量的重组DNA。11 取5ug质粒用PacI消化，酚/氯仿抽提一遍，乙醇沉淀后在无菌条件下溶于50ul 0.1TE溶液。具体要求参见磷酸钙技术一章中有关转染前DNA制备的内容。4.4 Ad

30、EasyTM重组子转染QBI-293A细胞注意：培养细胞前先参阅5.1章中有关QBI-293A细胞培养的内容。磷酸钙技术中的注意点：无菌在整个过程中保持所有成分的无菌是至关重要的。昆腾公司提供的试剂盒中所有成分均是无菌的，但使用者还必须保证所用其它试剂也均为无菌。DNA纯度磷酸钙转染中所用的DNA必须是高纯度的，一些DNA污染物对培养的细胞具有很强的毒性，那些成功转染的细胞往往会被污染物杀死。沉淀时间以前的资料都建议磷酸钙- DNA共沉淀颗粒在加入细胞和培养液之前至少应反应20分钟。然而与此相反，最近的研究（Jordan等，1996）显示长时间共沉淀会形成聚合沉淀块，从而降低转染效率。因此，建

31、议共沉淀成分混合后1分钟即可将沉淀加入细胞培养板。这一时间上的调整可产生小而稳定的沉淀，能更有效地被细胞摄入。4.4.1 细胞铺板每块板都用DMEM5%进行培养，这样细胞在铺板后第二天即可达到70%汇合率。由于共转染是通过细胞表面完成的，因此转染时细胞必须是分离的，而不是汇合的。1 转染前一天以7.5105 QBI-293A细胞在60mm培养皿中铺板，用DMEM5%培养，第二天的细胞数应达到1.01.5106。37 CO2孵箱中培养。CO2孵箱有助于保持合适的PH，培养皿在不进行操作时必须始终保存在CO2孵箱中。2 转染前3-4小时换成新鲜培养液，以保证在转染过程中细胞具有超常的生长力。将培养皿放回CO2孵箱中。4.4.2 磷酸钙转化技术1 每个转染都必须用5ug无菌的线性化重组腺病毒DNA。2 标记一个1.5ml离心管为编号1。用微量移液枪加入169ul无菌水和5ul 2M氯化钙溶液。上下吸打二次混匀，然后一滴一滴加入50ul AdV DNA溶液和26ul 2M氯化钙，再用移液枪慢慢吹打混匀。此时缓冲液的体积为250ul，含有0.25M氯化钙和5ug DNA。3