荧光原位杂交法.docx

1、荧光原位杂交法附件3人表皮生长因子受体2基因扩增检测试剂盒（荧光原位杂交法）注册技术审查指导原则本指导原则旨在指导注册申请人对人表皮生长因子受体2基因扩增检测试剂盒（荧光原位杂交法）注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门审评注册申报资料提供参考。本指导原则是对人表皮生长因子受体2基因扩增检测试剂盒（荧光原位杂交法）的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。本指导原则是供申请人和审查人员使用的指导性文件，但不包括注册审批所涉及的行政事项，亦不作为法规强制执行，如果有能够满足

2、相关法规要求的其他方法，也可以采用，但需要提供详细的研究资料和验证资料，相关人员应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。本指导原则是在现行法规、标准体系及当前认知水平下制定的，随着法规、标准的不断完善和科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将适时进行调整。一、范围人表皮生长因子受体2（Human Epidermal growth factor Receptor 2，HER2）基因定位于染色体17q12，是表皮生长因子受体（EGFR）的成员之一，HER2基因编码分子量为185kDa的酪氨酸激酶活性跨膜糖蛋白。HER2蛋白主要通过与家族中其他成员形成异二聚体而与各自的配体结合；当异二聚体与配体结

3、合后，激活酪氨酸激酶的活性。参与细胞的增殖、凋亡调控、血管和淋巴管新生等生物学功能。HER2蛋白的过表达主要是由于HER2基因的扩增，可导致肿瘤细胞内信号通路的异常活化，与肿瘤的发生发展和侵袭转移有关。HER2基因的扩增和蛋白的过表达均可称为HER2阳性，该情况出现于部分原发性浸润性乳腺癌、胃及胃和食管交界处癌（以下统称胃癌）等患者中。对于浸润性乳腺癌适应症，HER2阳性是指免疫组织化学（Immunohistochemistry，IHC）检测结果为（3+），或原位杂交方法（In situ Hybridization，ISH）检测结果为基因扩增。而IHC检测结果为（2+）的病例为不确定，需进一步

4、应用原位杂交方法进行HER2扩增状态的检测。对于胃癌适应症，HER2阳性是指IHC检测结果为HER2（2+）的同时ISH检测结果为基因扩增，或IHC检测结果为HER2（3+）。对HER2阳性的乳腺癌和胃癌患者进行联合抗HER2靶向治疗（如抗HER2单克隆抗体、小分子酪氨酸激酶抑制剂等）使得部分患者的生存状况得到改善，但是在HER2阴性的患者中没有效果。准确地检测HER2蛋白表达和基因扩增状态是抗HER2单克隆抗体分子靶向治疗患者筛选和疗效预测的前提，对乳腺癌和胃癌的临床治疗和/或预后判断至关重要。对于浸润性乳腺癌适应症，HER2是患者重要的预后指标，也是抗HER2药物治疗的主要预测指标。对于胃

5、癌适应症，HER2是晚期胃癌的疗效预测标志物。本指导原则适用于采用荧光原位杂交方法检测手术切除样本和活检样本的组织切片中的HER2基因扩增情况，包括HER2基因平均拷贝数（单信号）、HER2基因平均拷贝数和该基因所在的第17号染色体着丝粒（CEP17）序列平均拷贝数的比值（双信号）。对于其他应用亮视野原位杂交法检测HER2基因扩增水平的方法，如显色原位杂交法（Chromogenic In Situ Hybridization，CISH）和银增强原位杂交法（Silverenhanced In Situ Hybridization，SISH），可能部分要求不完全适用或本文所述技术指标不够全面，申请

6、人可以根据产品特性对不适用部分进行修订或补充其他的评价和验证资料，但需阐述不适用的理由，并验证替代方法的科学合理性。本指导原则适用于进行首次注册申报和相关许可事项变更的产品。其他未尽事宜（包括产品风险分析资料等），应当符合体外诊断试剂注册管理办法（国家食品药品监督管理总局令第5号，以下简称办法）等相关法规要求。二、注册申报资料要求（一）综述资料综述资料的撰写应符合关于公布体外诊断试剂注册申报资料要求和批准证明文件格式的公告（国家食品药品监督管理总局公告2014年第44号）（以下简称2014年第44号公告）的相关要求。内容主要包括产品预期用途、产品描述、有关生物安全性的说明、有关产品主要研究结果

7、的总结和评价以及同类产品在国内外批准上市的情况介绍等内容。重点内容要求如下：1.预期用途：HER2基因及其家族简介，在相关适应症中的表达情况，与组织病理学特征的关系，其扩增情况与乳腺癌和胃癌治疗方案制定以及预后判断的关系等。2.产品描述：荧光原位杂交法（Fluorescence In Situ Hybridization，FISH）的技术原理，目标基因的座位区域，探针的设计原则以及标记的荧光染料，细胞核复染方式，以及结果判读标准和统计方式等。3.同类产品上市情况：与相同或相似方法学（如IHC、其他原位杂交方法等）的产品在性能、上市情况和结果判读等方面的比较。（二）主要原材料研究资料申请人应验证

8、主要原材料的性能指标符合产品研发、生产和检验要求，以确定设计要求或者外购厂家，并制定主要原材料的质量标准。1.探针：根据不同用途，分为基因特异性探针（HER2）和着丝粒探针（CEP17）两种类型。探针可选择细菌人工染色体（BAC）克隆或者聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）等方法进行制备。下述内容是对于探针制备通用要求的举例，如有其他替代方法，应详细阐述其科学合理性。1.1基因特异性探针1.1.1探针序列的确定：包括探针所在基因的位置区域，人类基因组文库的筛选、比对和特征确认过程。1.1.2人类基因组文库克隆的鉴定：一般检测与基因区域相关的序列标记位点（S

9、TS）的存在情况，包括引物的设计，PCR过程和产物的电泳图谱。1.1.3探针的标记：一般为酶促反应或者化学合成方法，应详述标记方式的选择、反应体系和过程、产物的纯化方式等。1.2着丝粒探针：包括微卫星重复单元的序列，PCR引物的设计和选择，荧光染料标记的反应体系、过程和产物的纯化方式等。1.3探针的质量控制：性能指标一般包括浓度、纯度、Tm值（如适用）、杂交效率、特异性等，可使用测定260nm处紫外吸收峰值、测定260nm与280nm处紫外吸收峰值的比值、琼脂糖凝胶电泳、染色体分散良好的中期相分裂细胞杂交验证等方式。2.荧光染料：技术指标包括最大发射/吸收峰，与目的核酸片段的结合能力，持续被激

10、发光源照射时的抗淬灭能力等。3.杂交缓冲液：应描述组成配方，说明各成分的作用。质量标准应包括pH值、盐离子浓度、甲酰胺浓度、硫酸葡聚糖浓度等。4.人Cot-1 DNA（如适用）：是由大量人类基因组重复序列组成的高浓度DNA，能封闭样品中的DNA重复序列，降低检测背景。要求能有效封闭背景信号，避免由于非特异性杂交而影响检测结果的判读。应评价人Cot-1 DNA对样本检测背景信号的封闭效果，方法可选择通过观察背景强度以及非特异杂交的强度而确定人 Cot-1 DNA的用量。如有其他清除背景信号的方法，应充分说明其科学合理性。5.二脒基苯基吲哚（DAPI）复染剂：评价指标包括对细胞核的染色能力以及抗淬

11、灭能力等。6.企业参考品：应包含阴性参考品、阳性参考品和特异性参考品，并详细说明参考品的来源、组成、制备和保存情况。阳性参考品可选择经已上市产品确认HER2基因扩增的乳腺浸润癌/胃癌组织，或者人乳腺癌/胃癌细胞株。阴性参考品可选择经已上市产品确认HER2基因无扩增的肿瘤组织，或者肿瘤细胞株。特异性参考品可选择健康人外周血培养细胞，应含有较多染色体分散良好的中期分裂相淋巴细胞。7.质控片（如有）：可作为试剂盒的组分或者单独配置，包含阴性质控片、临界值质控片和/或阳性质控片。可选择临床组织样本或者HER2扩增状态确定的细胞株。（三）主要生产工艺及反应体系的研究资料申请人应描述主要生产工艺及确定依据

12、，详述工序流程以及各个步骤的质量关键控制点。申请人应建立适当的反应体系，以平衡最佳检测信号和背景强度的关系。反应过程包括样本预处理和杂交检测两个步骤，其中样本预处理过程一般包括样本脱蜡、样本预处理、蛋白酶处理三个环节，杂交检测过程一般包括变性、杂交、杂交后洗涤、DAPI复染四个环节。另外，应合理控制样本的质量并明确要求。1.样本的采集、固定、制片、保存和运输：应对采样部位及方法、样本中肿瘤组织的含量、离体到固定的温度及时间、固定温度及时间、保存和运输的条件和时间进行研究或者验证，结合组织形态及病理学特征，保证样本的准确性以及其中DNA的完整性。另外，切片质量对检测结果的判读十分重要，应对切片厚

13、度进行研究或者验证，要求计数区域的细胞胞核边界完整、DAPI染色均一、细胞核无重叠、荧光信号清晰。不同类型的样本应分别验证。具体可参考国际或国内相关标准操作规程；如与标准操作规程有差异，应进行充分研究。2.样本预处理：应对脱蜡条件、预处理温度及时间、特定盐溶液的离子强度、蛋白酶的消化条件进行充分研究，以避免处理过程中组织和DNA的损失造成检测结果出现假阴性。如其中预处理过程可选择多个温度/时间的组合，蛋白酶消化过程可选择多个持续时间进行研究。温度/时间的组合是指首先在同一时期的几个不同温度下进行，然后在优化温度条件下的几个不同持续时间进行。3.样本变性条件：应对样本变性处理的温度、持续时间的组

14、合进行充分研究，以保证样本中DNA双链的充分解链，有利于后续探针和样本的结合，提高杂交效率以及保证杂交的特异性。如选择多个温度/时间的组合进行研究。4.样本杂交条件：应对样本杂交步骤的温度、持续时间的组合进行充分研究，以达到探针和样本的最佳结合效率。如选择多个温度/时间的组合进行研究。5.杂交后洗涤条件：应对缓冲液的盐浓度和去垢剂成分，以及清洗温度、时间、次数的组合进行充分研究，以达到最佳的杂交严格度。要求尽可能去除样本中的核蛋白等干扰物质，避免非特异性杂交，降低背景干扰，并且增加目标信号的强度。如选择多个缓冲液浓度以及多个清洗条件的组合进行研究。（四）分析性能评估资料申请人应使用多批产品进行

15、研究，建立稳定可靠的性能指标。需提交在产品研制和成品验证阶段对试剂盒进行的所有性能评价的研究资料，包括方案设计、研究方法、材料和设备、验收标准、试验数据（包括代表性彩色图片）和结果统计分析等详细资料。建议着重对以下性能指标进行研究：1.灵敏度主要反映产品检测时探针与目标基因位点的结合效率，也称为杂交效率。由于组织固定时蛋白质和核酸产生的分子间交联等对靶核酸具有屏蔽作用，探针穿透细胞的能力不同，导致产品对于不同类型样本的杂交效率存在性能差异；应使用临床应用环境中所有可能的样本类型中具有代表性的类型进行评估。方法可选择20个乳腺浸润癌/胃癌病例的组织样本，以及20个癌旁正常组织或者良性疾病组织样本

16、；对同样数量的细胞随机进行分析计数。每例组织样本应至少检测20个细胞，分析统计HER2基因荧光信号数量，或者同时显示HER2基因位点标记和第17号染色体着丝粒（CEP17）位点标记的荧光信号的细胞占全部细胞的比例。2.特异性主要反映HER2和CEP17探针对目标序列识别的特异性。建议使用中期分裂相的外周血淋巴细胞进行涂片分析。选择5份以上正常人的外周血培养细胞涂片样本，每例样本应至少检测20个染色体分散良好的中期分裂相细胞，对至少200个靶位点进行分析计数；结合染色体G显带分析，统计细胞核染色体上正确位点的杂交信号占全部杂交信号的比例。应使用标准的细胞遗传学技术识别信号位点，例如染色体形态学分

17、析、染色体区段染色、反向DAPI条带等技术；考察在HER2基因位点（17q11.2-q12）和/或第17号染色体着丝粒位点（17q11.2-q11.1）的特定荧光信号占全部荧光信号的比例。3.阴、阳性符合率主要反映产品对不同类型样本中HER2基因的检出能力和准确性。应使用临床应用环境中所有可能的样本类型中具有代表性的组织类型进行评价，并提供样本来源、唯一可溯源编号、病理组织类型，以及明确的HER2基因扩增状态。对于适应症为乳腺癌的情况，用于评价的样本类型应包括乳腺浸润性癌非特殊类型、乳腺浸润性小叶癌、小管癌、粘液癌，良性疾病（如腺病及纤维腺瘤）以及正常乳腺组织等。对于适应症为胃癌的情况，用于评

18、价的样本类型应包括肠型、弥漫型、混合型（Lauren分型）胃癌，良性疾病（如胃粘膜慢性炎症）以及正常胃组织等。每种组织类型设置2至3例样本进行评价。建议着重评价申报产品对IHC检测结果为HER2（2+）样本的HER2基因扩增状态的检测能力。4.精密度申请人应充分考虑到配套检测系统以及使用环境的因素：包括荧光显微镜的特征、激发光源及过滤器的性能参数、物镜放大倍数等，以及不同时间、地点、操作人员、检测次数对结果判读的影响；对可能导致检测之间差异的主要变量进行验证。用于精密度评价的参考品应选择HER2扩增、HER2无扩增以及临界值的连续切片组织样本。其中临界值样本和成簇扩增的样本应分别设置验收标准（

19、标准差以及变异系数的范围）。建议参考下述方法进行各个指标的评价：4.1批内精密度：由同一操作人员使用同一批次产品进行检测，每例样本重复检测多次，对结果判读的一致性进行统计分析。4.2批间精密度：由同一操作人员使用多个批次产品进行检测，每例样本重复检测多次，对结果判读的一致性进行分析统计。4.3日间精密度：在多个不同日期，由同一操作人员使用同一批次产品进行检测，对结果判读的一致性进行统计分析。4.4人员间精密度：由数位操作人员使用同一批次产品进行检测，每份样本由数位阅片人员进行独立结果判读。对不同操作人员/阅片人员对同一例组织样本检验方法以及结果判读的一致性进行分析统计。4.5室间精密度：建议申

20、请人选择不同的实验室进行检测间一致性的评价。（五）阳性判断值确定资料HER2检测结果的判读标准不断进行着更新，申请人应参考最新版临床指南性文件建立阳性判断值。应提交申报产品判读规则以及预设阳性判断值所依据的文献资料，并采用具有统计学意义数量的样本对判读规则以及预设阳性判断值进行验证。应包含HER2扩增、HER2无扩增以及一定数量的临界值（阳性判断值附近）组织样本，包括HER2/CEP17荧光信号总数比值在2附近（1.82.2），或者每个细胞的平均HER2拷贝数在46附近的样本。首先设定检测结果重复性较好的目标，即HER2平均拷贝数或者HER2平均拷贝数/CEP17平均拷贝数的标准差/变异系数范

21、围验收标准，确定初始统计细胞区域和数量，并在结果不确定时纳入更多区域或数量进行统计。然后建议参照组织病理学特征或者IHC结果确定可能存在扩增的浸润性乳腺癌/胃癌区域，选择细胞核大小一致、胞核边界完整、DAPI染色均一、细胞核无重叠、荧光信号清晰的细胞，随机计数2个区域中的至少20个细胞，并对结果进行统计分析。（六）稳定性研究资料根据本产品特性，申请人应分别从实时稳定性、运输稳定性、开瓶/冻融稳定性，以及使用过程中的杂交后信号稳定性、探针的光照稳定性等方面对产品的稳定性进行研究，充分考虑在实际的运输、保存和使用条件下对产品性能的影响。其中使用过程稳定性应评价在实际使用的实验室环境条件下，不同的光

22、照条件对荧光标记探针以及杂交后样本荧光信号强度的影响，注意应覆盖检测的全过程。评价指标应至少包括灵敏度、特异性以及荧光信号强度。样本中核酸的完整性对于结果的正确判读也十分关键。申请人应充分考虑临床样本采集、处理、运输、储存与切片制备等各个阶段的条件，如温度、湿度对样本质量的影响，全面评价临床样本、质控品和企业参考品的稳定性。样本稳定性应分别评价石蜡包埋组织块与组织切片的稳定性，评价指标应至少包括储存温度及时间。（七）临床评价资料临床试验总体要求及临床试验资料的内容应符合办法、2014年第44号公告和体外诊断试剂临床试验技术指导原则的规定，以下仅结合人表皮生长因子受体2基因扩增检测试剂盒（荧光原

23、位杂交法）的具体特点对其临床试验中应重点关注的内容进行阐述。1.临床试验机构及人员的要求申请人应当选定不少于3家（含3家）已备案的医疗器械临床试验机构，按照有关规定开展临床试验。申请人应根据产品特点及其预期用途，综合不同地区人种、流行病学背景等因素选择临床试验机构。临床试验机构必须具有与申报试剂相适应的专业技术人员及仪器设备，并能够确保该项试验的实施。2.试验方案2.1各临床试验机构的方案设置应基本一致，且保证在整个临床试验过程中遵循预定的方案实施，不可随意改动。整个试验过程应在临床试验机构的实验室内并由本实验室的技术人员操作完成，需强调组织标本的标准采样、及时在10%中性缓冲福尔马林溶液中充

24、分固定及其他标准操作程序。申报单位的技术人员除进行必要的技术指导外，不得随意干涉试验进程，尤其是数据收集过程。2.2以图表的形式对试验总体设计及工作流程进行描述，图表中应包括连续切片的数量及用途分配等。各临床试验机构选用的对比试剂应保持一致，以便进行合理的统计学分析。2.3试验方案中应确定严格的病例纳入/排除选择标准，任何已经入选的病例再被排除出临床试验都应记录在案，并明确说明原因。2.4试验方案中应明确阅片者、操作者的选择标准。阅片者应选择在免疫组织化学、荧光原位杂交技术应用和乳腺癌/胃癌病理诊断中有丰富经验的医学工作者。2.5在试验操作过程中和判定检测结果时应采用盲法以保证试验结果的客观性

25、。临床试验研究方案中应详述盲法的具体操作流程。2.6临床试验前申请人应对临床试验机构参与人员进行相关技术培训，并采用统一判读标准，保持各临床试验机构的判读一致性。注意判读方法与说明书要求一致。2.7在整个试验中，试验用体外诊断试剂和对比试剂都应处于有效的质量控制下，最大限度保证试验数据的准确性及可重复性。临床试验研究方案中应明确质控方法及配合用质控试剂的详细信息。3.试验方法3.1“已有同品种批准上市”产品应选择已批准上市，且已经充分联合药物进行临床评价的伴随诊断试剂作为对比试剂，证明本品与已上市产品等效。3.2新产品用于胃癌等其他用途的此类检测试剂，如无已上市同类产品，应选择临床试验机构已建

26、立的参考方法（应可报告肿瘤细胞HER2基因平均拷贝数和肿瘤细胞CEP17平均拷贝数）为参比方法，进行检测结果的一致性研究。该参考方法应已经充分联合药物进行临床评价。3.3对于预期用途中已明确配合具体治疗药物名称的检测试剂，应采用联合药物评价临床试验的形式，同时评价检测结果与接受靶向治疗药物后疗效的相关性和试验用体外诊断试剂检测的准确性。3.4临床试验用样本的选择和样本量临床试验应选择经10%中性缓冲福尔马林固定的石蜡包埋组织样本或组织芯片。应根据设定的符合率接受标准和选定的统计学方法分别计算总样本例数及IHC检测结果为HER2（2+）的样本例数。但总样本例数不低于1000例。其中IHC检测结果

27、为HER2（2+）的样本不少于400例。如申报试剂声称可以用于检测两种或两种以上肿瘤类型，则应在一种类型满足上述要求的基础上，对每种新增的肿瘤类型进行不少于300例样本的临床验证，IHC检测结果为HER2（2+）的样本不少于120例。样本的选择应包含临床预期使用人群和特异性样本，注意包含临床相关的各种病理组织类型。对于适应症为浸润性乳腺癌的情况，样本应包含临床常见的各种浸润性乳腺癌病理组织类型，如乳腺浸润性癌非特殊类型、乳腺浸润性小叶癌、小管癌、粘液癌。特异性样本应包含腺病及纤维腺瘤。对于适应症为胃癌的情况，样本应包含临床常见的各种腺癌病理组织类型，如肠型、弥漫型、混合型（Lauren分型）。

28、特异性样本应包含胃粘膜慢性炎。4.统计学分析4.1对临床试验结果的统计应选择合适的统计方法。4.1.1对于本类试剂，常以配对列联表的形式总结两种试剂的定性检测结果，分别计算全部样本的阳性符合率、阴性符合率和总符合率以及IHC检测结果为HER2（2+）样本的阳性符合率、阴性符合率和总符合率。应选择合适的统计学检验或推断方法（如95%置信区间），给出不确定样本占全部样本的比例，并评价其对符合率的影响，以检验两种试剂检测结果的一致性。4.1.2由于此类试剂在临床结果的报告中同时报告肿瘤细胞HER2基因平均拷贝数、肿瘤细胞CEP17平均拷贝数（双探针适用）和两者的比值（双探针适用），因此还应对拷贝数的

29、准确性进行评价。可采用试验用体外诊断试剂（考核试剂）与对比试剂或参考方法检测结果的肿瘤细胞HER2基因平均拷贝数和肿瘤细胞CEP17平均拷贝数（双探针适用）做散点图的方法，配合适当的统计分析方法，如以线性回归为基础的分析方法或Bland-Altman方法等，评价考核试剂与对比试剂对于肿瘤细胞HER2基因平均拷贝数和肿瘤细胞CEP17平均拷贝数（双探针适用）检测结果的一致性。4.2对临床试验中人群基本特征进行分析，包括：年龄、性别、病理组织类型、癌症分期情况、免疫组织化学检测结果等（见表1）。表1 人群基本特征统计表因素类别所占总数比例考核试剂阳性例数对比试剂阳性例数性别男性女性年龄50岁以下5

30、059岁6069岁69岁以上组织类型乳腺浸润性导管癌乳腺浸润性小叶癌.临床分期IIIIIaIIIbIVIHC检测结果3+2+1+，04.3联合药物评价临床试验部分可采用前瞻性或回顾性研究方法，结合接受药物治疗后的临床试验数据等，分析检测结果。此部分研究通常使用Kaplan Meier曲线等生存数据分析方法，选取适当的统计方法检验客观有效率，评价检测结果与用药后临床结局之间的相关性。样本数量应符合统计学要求。5.结果差异样本的验证在数据收集过程中，对两种试剂检测结果不一致的样本，应采用第三方试剂或其他合理的方法进行复核，同时结合组织病理学特征、免疫组织化学检测结果等对差异产生原因进行分析。6.质

31、量控制由于检测前预处理步骤较多，导致判读结果可能会在试验人员间、实验室间产生差异。为了客观单一评价试剂性能，尽量减少这种人为差异对最终结果造成的影响，临床试验开始前，各临床试验机构应统一操作方法，进行判读一致性训练及统一的质量控制，确保同样的样本在不同机构之间的判读结果保持一致。注意应包含IHC以及FISH检测结果为阴性、阳性和不确定的样本。该预评估内容、实现方法、结果等应在临床试验报告中体现。7.原始数据7.1提交病例报告表（Case Report Form，CRF），内容应至少包括：性别、年龄、标本的采集部位、标本类型、病理诊断结果（包含分级）、HE染色结果、免疫组织化学检测结果、考核试剂

32、检测结果、对比试剂检测结果、第三方复核结果。所有采用原位杂交法的检测结果均应包含评估的细胞数量、HER2基因/CEP17荧光信号比值（双探针适用）、每个细胞的平均HER2拷贝数、每个细胞的平均CEP17拷贝数（双探针适用）和定性判读结果。7.2提交入选样本结果的代表性彩色图片。8.临床试验总结报告撰写根据体外诊断试剂临床试验技术指导原则的要求，临床试验报告应对试验的整体设计及各个关键点给予清晰、完整的阐述，应对整个临床试验实施过程、结果分析、结论等进行条理分明的描述，并应包括必要的基础数据和统计分析方法。建议在临床试验总结报告中对以下内容进行详述：8.1临床试验总体设计及方案描述8.1.1临床试验的整体管理情况、临床试