分子生物学复习资料要点.docx

1、分子生物学复习资料要点2013-2014分子生物学复习资料一、中心法则DNA RNA 蛋白质二、DNA复制(一) DNA复制的特点1、半保留复制DNA复制时分别以两条亲代链作为模板链通过酶催化各形成一条子代链，亲代链分开处即子代链合成处成为复制叉。2、半不连续复制DNA亲代链5到3方向的复制时，是以小片段的形式从5到3不连续的复制形成冈崎片段，再经DNA连接酶连接形成一条链。3、RNA的引导RNA的引导保证DNA复制的高忠实性。（二） DNA复制所需要的酶1、原核中：（）DNA解旋酶：利用ATP水解的能量解开双链（）DNA旋转酶（型拓扑异构酶）：引入负超螺旋从而释放正超螺旋。（3）DNA聚合酶

2、：延伸前导链和后随链中的引物。（4）DNA聚合酶：切除引物。（5）DNA连接酶：连接冈崎片段形成子代链。2、真核中：（）DNA聚合酶：前导链和后随链的每个片段都是利用其引发酶活性从RNA引物开始。（）DNA聚合酶：在前导链上替代前一种酶继续延伸。（）DNA聚合酶：在后随链上完成DNA的复制。（三） DNA聚合酶1、真核中：真核细胞有5种DNA聚合酶，分别为DNA聚合酶（定位于胞核，参与复制引发具53外切酶活性），（定位于核内，参与修复，具53外切酶活性），（定位于线粒体，参与线粒体复制具53和35外切活性），（定位核，参与复制，具有35和53外切活性），（定位于核，参与损伤修复，具有35和53

3、外切活性）。2、原核中：原核细胞有3种DNA聚合酶，都与DNA链的延长有关。DNA聚合酶I是单链多肽，可催化单链或双链DNA 的延长；DNA聚合酶II则与低分子脱氧核苷酸链的延长有关；DNA聚合酶III在细胞中存在的数目不多，是促进DNA链延长的主要酶。功能polpolpol聚合作用53外切酶活性35内切酶活性53焦磷酸解和焦磷酸交换作用完整的DNA双链带引物的长单链DNA带缺口的双链DNA双链而有间障的DNA分子量（）109120140（四）DNA的损伤与修复1、诱变（1）突变1) 点突变：一个单一碱基的改变转换：嘌呤与嘌呤之间或是嘧啶与嘧啶之间颠换：嘌呤与嘧啶之间或是嘧啶与嘌呤之间2) 沉

4、默突变：突变发生在的非编码区、非调节区或密码子的第三个碱基位置，不影响掺进蛋白质中的氨基酸3) 错义突变：突变改变了基因产物的一个氨基酸4) 移码突变：插入或缺失涉及一个或多个碱基的增加或丢失（）物理诱变：高能离子化辐射，如射线、射线、紫外线（嘧啶二聚体是常见的一种产物）（）化学诱变：碱基类似物（直接诱变）、亚硝酸、烷化剂等、损伤（）氧化性损伤（）烷基化（如、）（）聚化加合物、修复（）光复活：在可见光下，光解酶可将环丁烷嘧啶二聚体再分解为单体（）烷基转移酶（）切除修复：核苷酸切除修复和碱基切除修复（）错配修复（）遗传性修复（五）的克隆、的制备（）质粒DNA的制备碱裂解法：从染色体及大部分其他细

5、胞成分中纯化酚抽提法：采用酚或酚氯仿混合物进行抽提乙醇沉淀：氯化铯梯度法：（）噬菌体DNA的制备2、载体（1）质粒载体1) 插入失活原理：pBR322及其衍生物包含两个抗生素抗性基因，ampr和tetr，当目的基因插入其中一个时，会导致该基因失活。2) 蓝白斑筛选：在质粒中含有LacZ基因（编码-半乳糖苷酶，受Lac启动子的调控）的-肽的序列，当无外源DNA片段插入时，质粒表达-肽，它与宿主菌的Lac ZM15基因的产物互补，产生有活性的-半乳糖苷酶，在含有指示剂X-gal和诱导剂IPTG存在的情况下，菌落呈蓝色（质粒自身环化）；外源基因插入后，肽基因阅读框架被破坏，细菌内无半乳糖苷酶活性存在

6、，菌落呈白色（阳性克隆）。（2）噬菌体载体噬菌体颗粒将其线性DNA注入细胞，进而DNA连成环状，其后该DNA被复制组装成噬菌体颗粒，经裂解细胞释放到胞外，造成细胞死亡，或通过特异位点将其DNA整合到宿主基因组，而获得长期插入。（3）其他载体黏粒载体：利用噬菌体cos位点YAC：酵母人工染色体BAC：细菌人工染色体（六）基因文库1、基因组文库（DNA来自基因组DNA）文库的大小，p代表给定概率，f是插入片段大小占总基因大小的比例。2、cDNA文库（DNA来自群体mRNA的拷贝）cDNA第二条链的合成：a) 自身引物合成法：cDNA/mRNA杂合体用碱处理后获得单链cDNA，随即在3端形成一个短小

7、的发夹结构，次发夹结构可以作为引物合成第二条链。最后用SI核酸酶处理除去末端发夹结构，但5端部分序列会因此而失去。b) 置换合成法：RNaseH在mRNA上产生缺口（内切作用）残存的可以作为合成第二条链的引物，最后用连接酶连接修复缺口。通过这种方法可以获得近乎全长的dscDNA。c) 引导合成法：NaoH降解杂交链中的mRNA，然后用末端转移酶在cDNA端加聚尾巴，以Oligo（dG）为引物合成第二条链，这种方法可获得全长的dscDNA。(七)DNA测序1、双脱氧链终止法测序的原理DNA聚合酶能利用单链为模板，离体合成其互补链，当反应液中，双脱氧核苷三磷酸（），它可以像脱氧核苷三磷酸（）那样直

8、接掺入新合成的链中，但因端不具，所以寡核苷酸链不再继续延长，即链合成终止。在个反应管中同时加入同一种合成的被标记的引物和待测序的模板、聚合酶、种脱氧核苷三磷酸（、），并在这个管中分别加入种不同的，双脱氧核苷三磷酸。反应将产生不同长度的DNA片段混合物，他们都带有ddNTP的3末端。将这些混合物进行变性凝胶电泳分离，就可以获得一系列不同长度的DNA普带。再通过放射自显影术，检测单链DNA片段的放射性带。最后可以在放射性光底片上，直接读出序列。2、化学降解法：首先放射性标记待测序的一端，并将其分为份，分别用不同的化，学试剂进行种裂解反应，每种反应之断裂某一种或某一类碱基，结果可产生种起始于放射性标

9、记末端的不同长度的标记分子，经变性凝胶电泳分离各组不同大小长的片段，并进行放射自显影，可根据光片上所显现的相应普带，读出的核苷酸序列。3、 的自动测序：基于双脱氧链终止法测序原理，也是通过个酶学反应利用产生一系列一端固定、另一端终止于不同、碱基位点的DNA片段。三、RNA转录乳糖操纵子1、乳糖操纵子的组成：大肠杆菌乳糖操纵子含Z、Y、A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和半乳糖苷乙酰转移酶，此外还有一个操纵序列O，一个启动子P和一个调节基因I。2、阻遏蛋白的负性调节：没有乳糖存在时，I基因编码的阻遏蛋白结合于操纵序列O处，乳糖操纵子处于阻遏状态，不能合成分解乳糖的三种酶；有乳糖存在时，乳糖

10、作为诱导物诱导阻遏蛋白变构，不能结合于操纵序列，乳糖操纵子被诱导开放合成分解乳糖的三种酶。所以，乳糖操纵子的这种调控机制为可诱导的负调控。3、CAP（受体蛋白）的正性调节：在启动子上游有CAP结合位点，当大肠杆菌从以葡萄糖为碳源的环境转变为以乳糖为碳源的环境时，cAMP浓度升高，与CAP结合，使CAP发生变构，CAP结合于乳糖操纵子启动序列附近的CAP结合位点，激活RNA聚合酶活性，促进结构基因转录，调节蛋白结合于操纵子后促进结构基因的转录，对乳糖操纵子实行正调控，加速合成分解乳糖的三种酶。4、协调调节：乳糖操纵子中的I基因编码的阻遏蛋白的负调控与CAP的正调控两种机制，互相协调、互相制约。四

11、、蛋白质翻译顺式调控元件与反式作用因子关系：顺式作用元件：真核生物中没有操纵子，调节基因中调控序列有许多能结合动中调控蛋白的元件叫顺式作用元件，它们往往与结构基因保持一定的距离。反式作用因子：指和顺式作用元件结合的可扩散性蛋白，包括基础因子，上游因子，诱导因子。摆动假说解释遗传密码简并性的假说，克里克（F.H.C.Crick）于1966年提出。对氨基酸专一的密码子的头两个碱基与相应转移RNA上反密码子的第2个和第3个碱基互补配对，而密码子的第3个碱基（3端）与反密码子5端碱基的配对专一性相对较差，被称为摆动配对（wobble pairing）。在反密码子的5位置上常发现次黄嘌呤（）或与之相似，

12、仅能形成2个氢键的嘧啶。GU-AG法则多数细胞核mRNA前体中内含子的5边界序列为GU，3边界序列为AG。因此，GU表示供体衔接点的5端，AG表示接纳体衔接点的3端。把这种保守序列模式称为GU-AG法则，又称为Chambon法则。ORF开放阅读框open reading frame，ORF 是结构基因的正常核苷酸序列，从起始密码子到终止密码子的阅读框可编码完整的多肽链，其间不存在使翻译中断的终止密码子。B型DNA（1） DNA双螺旋 两条反向平行的互补双螺旋链，一条方向为53，另一条方向为35，围绕同一中心纵轴，从右向上盘旋。 双螺旋磷酸-脱氧核糖主链在外，位于内的碱基平面与中心轴垂直。 每个

13、碱基相聚0.34nm，同条链相邻碱基夹角36度，每10个碱基形成螺旋1周，螺距3.4nm。 露于螺旋外的磷原子离中心轴1.0nm，易与阳离子接近。 两条链相互碱基互补配对，即AT/GC，分别以2个和3个氢键相连。 两条单链之间由小沟，两个双链之间有大沟，他们在DNA双螺旋外交替出现。（2） B型DNA被认为是最稳定的结构，有特殊的螺旋重复（每砸），几乎与螺旋轴垂直，有一条主沟和一条小沟。（3） 其他类型的型和型一样为右旋，但较宽，结构更加紧密，碱基对倾斜于螺旋轴线，且偏离细线，重复每砸为。型是左旋，有一个字形的外观，每砸碱基对。poly(A) tail的作用有助于稳定整个分子；和poly(A)

14、 结合起抵抗外切核苷酸酶攻击的作用；有助于细胞质中成熟的翻译氨酰tRNA合成酶a) 氨酰-TRNA合成酶使氨基酸结合到特定的RNA上：每一个氨酰-TRNA合成酶可识别一个特定的氨基酸和与此氨基酸对应的TRNA的特定部位。b) 氨酰-TRNA合成酶的辨认位点：大肠杆菌TRNAALA氨基酸臂是酶的辨认位点。Tm值DNA的解链温度（Tm）是引物的一个重要参数，它是当50的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度，一种DNA分子的Tm值大小与其所含碱基中的GC比例相关，GC比例越高，Tm值越高。Tm=4（G+C）+2（A+T）tRNA的结构a) tRNA的一级结构：四种常见的修饰碱基，分别是胸腺嘧啶

15、核糖核苷（T）、假尿嘧啶核苷（）、二氢尿苷（D）、肌苷（I）。b) tRNA的二级结构：来自不同生物的tRNA，尽管一级序列不同，但都具有三叶草样的二级结构。氨基酸臂：是tRNA分子的5端和3端附近的碱基配对形成的臂。一个成熟的tRNA分子的3端的核苷酸序列总是CCA（3），一个特异的氨基酸通过它的羧基与tRNA的3端的腺苷酸残基的2或3羟基形成的共价键连接在tRNA分子上。另外所有tRNA分子5端的核苷酸都是磷酸化的，而且大多数tRNA分子5端的核苷酸残基为鸟苷酸残基（pG）。反密码环：位于氨基酸臂对面的单链环（anticodon loop），该环含有由三个核苷酸残基组成的反密码子（anti

16、codon），反密码子与mRNA中的互补密码结合。反密码臂（anticodon arm）：含有反密码子的臂。TC臂：含有胸腺嘧啶核苷酸（T）（在RNA中很少见到）、假尿嘧啶核苷酸（）和胞嘧啶核苷酸（C）残基的臂。D臂（D arm）：含有二氢尿嘧啶核苷酸残基的臂，不同tRNA的D臂稍有不同。可变臂（variable arm）：在反密码臂和TC臂之间，大约由3到21个核苷酸组成。c) tRNA的三级结构：在三维空间（tRNA的三级结构），tRNA分子折叠成倒L型（右图），氨基酸臂位于L型分子的一端，反密码环则处于相反的一端。这样的结构更为紧凑、稳定，这与D、TC和可变臂中的核苷酸之间的氢键有关。t

17、RNA分子中的大多数核苷酸都处于两个成直角的、堆积的螺旋中。碱基之间堆积的相互作用就象稳定DNA双螺旋那样对tRNA的稳定性具有重要的贡献。蛋白质的三步合成起始：核糖体在mRNA分子上的组装延伸：氨基酸廷加的重复循环终止：新生蛋白（多肽）链的释放具体如下：1. 起始蛋白质合成起始涉及到起始复合体在mRNA的阅读框架处的组装。起始复合体由核糖体亚基、模板mRNA、起始tRNA和一些起始因子组成。1) 起始密码子：在几乎所有的mRNA中，翻译的起始密码都是AUG。少数情形下起始密码为GUG。2) 30S亚基与SD序列的相互作用：在原核生物中，起始密码的选择不仅取决于tRNA的反密码子和mRNA密码

18、子的相互作用，也取决于核糖体的小亚基与mRNA模板的相互作用。30S亚基是在紧靠起始密码的上游的一个富含嘌呤碱基的区域与mRNA结合。这个被称为SD序列（Shine-Dalgarno siquence）的区域与16Sr RNA的3端的一个富含嘧啶片段互补。在形成起始复合体时，互补的核苷酸对形成一个双链结构，使得mRNA结合到核糖体上。mRNA与16SrRNA的这一非翻译片段之间的配对将起始密码定位在P部位，确立了正确的阅读框架。因为SD序列只出现在起始密码的上游，起始复合体就只能在起始密码处组装，而不可能在内部的蛋氨酸密码处组装。3) 特殊的起始tRNA：在每个细胞内至少存在着两个不同的识别A

19、UG密码的蛋氨酰-tRNAMet分子，一个只在起始密码处用，称为起始tRNA，另一个只识别内部的蛋氨酸密码。4) 起始复合物形成的三个步骤：起始复合物的形成取决于几个起始因子的作用。在原核生物中，存在着三个起始因子（Initiation Factor 缩写为IF）IF1，IF2和IF3。a) IF1结合在30S核糖体亚基上，促进IF2和IF3发挥作用。IF3的一个作用是通过结合在30S的小亚基上，使小亚基维持在游离的状态，IF3与30S的结合可以防止30S和50S亚基形成排斥mRNA的不成熟的70S复合物。它对mRNA上的转录起始位置具有很高的亲和性。b) 结合了GTP的IF-2-GTP复合物

20、可以特异识别起始tRNA，就是说，能够从细胞中的氨酰化的tRNA分子库中挑选出fMet- tRNAfMet。IF-2-GTP结合在30S亚基上，通过形成的30S复合物识别mRNA模板上的SD序列和起始密码，与mRNA相互作用，形成了一个由fMet- tRNAfMet、IF-2-GTP以及mRNA组成的前起始复合物。c) 一旦形成前起始复合物，50S亚基就与30S亚基结合，同时结合在IF2上的GTP水解生成IF-2-GDP和Pi，然后结合在前起始复合体上的起始因子IF1和IF3解离，最后形成由30S与50S组成的起始复合物，fMet- tRNAfMet被定位在P位。IF-2-GDP 中的GDP与

21、GTP交换重新生成IF-2-GTP。2. 延伸当蛋白质合成启动后，第二个密码被定位准备接收第二个氨酰-tRNA。起始氨酰-tRNA占据P位，A位被用来接收一个氨酰-tRNA，这是肽链延伸反应的第一步。在肽链延伸阶段，需要将每一个按照密码要求的氨基酸接到生长着的肽链上，每连接一个氨基酸都要重复进行一轮延伸循环反应。a) 将正确的氨酰-tRNA定位在A位b) 形成肽键c) 使mRNA相对于核糖体移动一个密码（移位）。d) 释放卸载的tRNA在每一轮延伸循环的开始，核糖体的A位是空的，而P位被一个氨酰化的tRNA占据。P位的tRNA作为延伸的肽链的连接点，每进行一轮延伸循环，连接在P位tRNA分子上

22、的氨基酸残基数都增加一个。连接着延伸肽链的tRNA称为肽酰-tRNA。3. 终止蛋白质合成的最后一个阶段是多肽链延伸的终止。多肽链的最后一个肽键形成后，携带新合成多肽链的肽酰-tRNA从A位转移至P位，终止密码（UAA、UAG或UGA）进入A位，在正常的细胞中没有和终止信号互补的tRNA。在E.Coli中，有三种释放因子RF1、RF2和RF3（RF：Release Factor）能够识别终止密码。释放因子RF1可以与UAA和UAG结合，而RF2能与UAA和UGA结合，RF3与RF1或RF2结合形成异二聚体。RF3也结合GTP。当异二聚体在A位与mRNA结合后，改变了肽酰转移酶的活性，使得该酶能

23、够水解肽酰-tRNA酯。伴随着GTP的水解和释放因子从核糖体的解离，最后的多肽产物从核糖体释放出来。70S核糖体解离为30S和50S亚基，为合成另一个多肽分子作准备。【总结】遗传密码几乎是通用的，由64个密码组成，每个密码由3个核苷酸残基构成。64个密码中有61是编码氨基酸的，其余的UAA、UAG和UGA 3个密码为终止密码。读码的起点确定了一个基因的读码框架。读码起点的漂移有时会改变整个遗传信息。密码中碱基突变有时会改变密码的意义，一个核苷酸的取代可能会使一个错误的氨基酸整合到合成的蛋白质中。遗传密码有几个显著特点，一是密码具有简并性，即许多密码编码同一个氨基酸，而且处于密码头两个位置的核苷

24、酸足以指定一个氨基酸，所以处于第三个位置的核苷酸即使发生突变也不会改变密码的意义。另外具有类似核苷酸序列的密码往往指定化学性质相近的氨基酸。tRNA分子是mRNA和蛋白质之间的桥梁，它携带有激活的氨基酸，在核糖体处通过互补碱基配对与mRNA相互作用将氨基酸转移给生长着的肽链。所有的tRNA分子都含有一些确定的结构特征，tRNA分子中往往都含有许多保守和许多共价修饰的核苷酸，其中一些核苷酸对tRNA分子的二级和三级结构有稳定作用。tRNA分子的二级结构为三叶草型，含有4个臂（碱基配对区）和3个环。氨基酸臂共价连接着氨基酸残基，反密码环上的反密码通过碱基配对与mRNA中的密码相互作用。tRNA分子

25、的三级结构为倒L型。反密码与mRNA中的密码相互作用在5位有一定的柔性（摆动性），即在该位置容许非标准碱基配对，结合同一个氨基酸但具有不同反密码的tRNA（同工tRNA）可以与同一个密码通过碱基配对相互作用。一个氨基酸在氨酰-tRNA合成酶的催化下共价连接在tRNA分子3末端的A残基上。每一种氨酰-tRNA合成酶对一种氨基酸和相应的tRNA分子是高度特异的。某些氨酰-tRNA合成酶还具有校正活性，使已经形成的不正确的氨酰-腺苷酸水解。核糖体是由一个大亚基和一个小亚基组成的。在E.coli中，小亚基是30S亚基，含有21种蛋白质和一分子的16SrRNA；而大亚基是50S亚基，含有31种蛋白质和5

26、S、23S两种rRNA分子。在蛋白质合成期间，两个亚基结合形成一个70S核糖体。真核生物的核糖体比原核生物的大（由40S和60S亚基组成的80S核糖体）和含有更多的蛋白质。真核生物核糖体的大亚基含有3分子rRNA（28S、5S和5.8S）。 核糖体中肽链的合成包括三个阶段：起始、延伸和终止。在原核生物的起始阶段，首先形成一个包含mRNA、30S亚基、一个氨酰化的起始tRNA（fMet- tRNA fMet）和50S亚基的起始复合体。起始因子促进复合体成员之间的结合，同时需要一分子GTP。通过起始密码和氨酰化的起始tRNA的相互作用选择正确的密码，这种相互作用由于16SrRNA和位于mRNA起始

27、密码上游的互补SD序列之间碱基配进一步得到了加强。在蛋白质合成的延伸阶段，一个氨酰-tRNA结合在A位，而相邻的P位为肽酰-tRNA位置，一个肽键的形成伴随着一个新的肽酰-tRNA由A位转移到P位和游离的tRNA从E位被弹出过程。这个过程需要3个延伸因子和消耗两分子GTP。蛋白质合成的终止发生在特殊的终止密码处，同时需要释放因子参与和消耗一分子的GTP。蛋白质合成的不同阶段都会受到抗生素的抑制。许多蛋白质在合成期间和翻译之后会受到共价修饰。某些修饰(如：乙酰化、羟基化、磷酸化、甲基化、糖基化和核苷的添加)影响蛋白质向不同细胞部位的转运。一个向细胞外分泌或插入到膜中的蛋白质的N末端常常含有一个由

28、1630个残基组成的疏水性信号肽【名词解释】Melting temperature ：解链温度即双链核酸分子变性打开双链成单链的温度Tm值，一般DNA分子变性的Tm与G和C的含量成正相关。Cis-acting elements ：顺式作用元件，是基因转录中的一系列调控基因转录的基因序列片段。在原核生物中，大多数基因表达通过操纵子模型进行调控，其顺式作用元件主要由启动基因、操纵基因和调节基因组成。在真核生物中，与基因表达调控有关的顺式作用元件主要有启动子、增强子和沉默子。Wobble：摇摆，主要是指在基因密码中，编码一个氨基酸的密码子的第三个核苷酸碱基有可能与反密码子的第一个碱基形成非沃森-克里

29、克的碱基配对方式，从而允许tRNA解读更多密码子的现象。ORF：开放阅读框，是基因序列中一段从起始密码子开始编码某一蛋白质的到终止密码子结束的碱基序列。Base stacking force：碱基堆积力，是一种在DNA双螺旋结构中，碱基对平面垂直于中心轴，层叠于双螺旋的内侧，相邻疏水性碱基在旋进中彼此堆积在一起相互吸引形成的作用力。这种力与氢键共同维系着DNA的双螺旋结构的稳定性。Transcription ：转录，是指生物中遗传信息由DNA流向RNA的过程，其中主要是指以DNA为模板在RNA聚合酶的作用下合成前体RNA的过程。Silent mutation ：沉默突变，即同义突变。由于基因编

30、码的简并性原则，在基因突变中，虽然某碱基改变了，但最后在翻译的蛋白质序列中氨基酸并未发生改变，仍保持野生型功能。Intron ：是真核生物基因中阻断基因线性表达，分开相邻外显子的一段非编码DNA片段。Hyperchromic effect：增色效应，由于DNA变性由双链变为单链引起的光吸收增加称增色效应,也就是变性后 DNA 溶液的紫外吸收作用增强的效应。Hypochromicity effect：减色效应，单一的核苷酸的光吸收值比RNA和单链的DNA的吸收值都大，单链DNA又比双链DNA大。这种双链DNA相对于单链DNA吸收值减少的现象就叫做减色效应。Supercoiling：超螺旋，是DNA绕轴线的再次螺旋，若以Lk0表示松弛闭环DNA的连接数，Lk0的改变将导致超螺旋。一般天然的DNA呈负超螺旋，即DNA变形的方向同双螺旋解旋的方向相反。Telomerase:端粒酶，是一种由RNA和蛋白质组成的核糖核蛋白复合体，属于反转录酶。它以自身的RNA作为端粒DNA复制的模板，合