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1、Regular Meeting Report 2013.02.23Plasmids IdentificationLrp6+DNMT1/DNMT3BLrp6+Cell ProliferationLrp6-FL-6mycLrp6-FL-pcsLrp6-FL-mishaLrp6E1-2pcsLrp6E3-4pcsLrp6-SLDL-pcsLrp6E1-4pcsLrp6-N-pcsLrp6-C-vsvgLrp6-FL-vsvgLrp6E1-2pcsLrp6-L-pcsLrp6E3-4pcsLrp6E1-4pcsEP2-TopoLrp6E1-2+SLDLpcsLrp6E3-4+SLDLpcswithou

2、t 4SDS bufferwith 4SDS bufferwith 4SDS bufferEffects of Lrp6 on DNA MethylationDLD-1DNMT1DNMT3BLS-174T DNMT1DNMT3BHT-29DNMT1DNMT3BPGE2WT(V)（+）-Lrp6-FL+-Lrp6-N+-Lrp6-C+-Catenin+-A AWesternblotWesternblot摸一下PGE2刺激浓度及刺激时间，稳定地观察到Lrp6的N端能够明显地下调DNMT1的表达B BBSPBSP在A的基础（最佳条件）上用BSP方法予以证实A A检测一下HT-29/LS-174T细胞

3、内Lrp6及Catenin的表达水平B BWesternblotWesternblot稳定地观察到敲除Lrp6和加入DKK后DNMT1表达水平相较WT上调C CBSPBSP在B的基础（最佳条件）上用BSP方法予以证实PGE2WT(+)-si Lrp6+-DKK+-Catenin+-PGE2WT(+)-EP4inhibitor+-稳定地观察到加入稳定地观察到加入EP4EP4受体抑制剂之后，受体抑制剂之后，DNMT1DNMT1表达水平下降表达水平下降进一步探究进一步探究Lrp6Lrp6和和EP4EP4蛋白相互作用的一些情况蛋白相互作用的一些情况（IPIP）Effects of Lrp6 on Pr

4、oliferationCultured in serum free before stimulated by PGE23 ConditionsHT-29serum conditioncultured timestimulated timeLS-174T0/0.1/0.5/2/10/2048/7224/36/48/72DLD-1%hh1转染后在无血清的条件下培养48/72h后PGE2给药刺激48/72h2使用Promega公司的CellTiter观察细胞增殖状况（ATP）转入转入Lrp6之后能够强烈地促进细胞增殖之后能够强烈地促进细胞增殖结论结论抛开PGE2本身导致细胞增殖的现象不谈，以上结果特

5、别是Lrp6诸片段该结果部分地证实了Catenin在结直肠肿瘤细胞增殖中的作用，即当Catenin升高时，与对照组相较，明显促进了增殖。由于Lrp6蛋白的膜内片段能够激活下游的Catenin，致其表达升高。结合上述结果可以得出只要有Lrp6蛋白C端存在时，就能明显地促进结直肠肿瘤细胞的增殖。未来方向未来方向在摸索出PGE2能够明显地促进结直肠肿瘤细胞增殖现象的基础上，不再谋求绕过Catenin，仅需探索出Lrp6的膜外片段能够与受体EP2结合从而抑制了该通路的激活，此时，在PGE2刺激存在时，与对照组相较Lrp6膜外片段能够使得结直肠肿瘤细胞的增殖现象得到明显抑制。PGE2PGE2促进结直肠肿

6、瘤细胞促进结直肠肿瘤细胞增殖现象层面的一些计划增殖现象层面的一些计划未来计划未来计划1在文献的无血清培养24h小时后再行PGE2（1M）刺激24小时的基础上，放宽各个条件，用Promega公司的CellTiter继续摸索一下现象。2考虑到数篇文献上提到的BrdU分析法，放宽各种条件后，首先尝试一下与之原理相近的MTT比色法，再根据结果决定是否采用BrdU分析法，毕竟机器检测要靠谱与人的肉眼的计数。3无血清培养24h后采用不同浓度PGE2蛋白连续刺激5天，肉眼计数（拍照/蛋白浓度比较）5-Bromo-2-deoxy Uridine5-溴脱氧尿嘧啶核苷实验原理实验原理细胞增殖周期包括G1、S、G2

7、、M 4个时期，其中S期是DNA合成期，细胞内DNA进行半保留复制，各种构成DNA的原料掺入到DNA中。BrdU作为一种胸腺嘧啶核苷的类似物（其化学结构特点是胸腺嘧啶的碱基嘧啶环上与5位C原子连接的甲基被溴代替），像胸腺嘧啶核苷一样可掺入到细胞合成的DNA中。当细胞处于DNA合成期而同时又有BrdU存在时,就会有BrdU掺入新合成的DNA中，只要细胞不消亡，这种BrdU就在胞核的DNA中长期存留。掺入到DNA的BrdU可通过抗BrdU单克隆抗体在组织切片或细胞爬片上显示。该方法能对细胞周期进行迅速而稳定的测量,而且标记BrdU的细胞只要不受到紫外线照射，对细胞本身没有功能损害。该技术可应用到跟

8、踪检测移植细胞的存活、分化和功能状态。BrdUBrdU标记法标记法MTT3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide，3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐商品名：噻唑蓝。实验原理实验原理活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。MTTMTT比色法

9、比色法Lrp6Lrp6膜外片段在膜外片段在PGE2PGE2介导的促进结直肠肿介导的促进结直肠肿瘤细胞增殖现象中作用的一些研究计划瘤细胞增殖现象中作用的一些研究计划PGE2WT(+)-Lrp6-C+-Catenin+-PGE2Control(+)-si Lrp6+-siCatenin+-1 1观察到观察到LrpLrp膜外片段能够明显地降低膜外片段能够明显地降低PGE2PGE2介导的细胞增殖现象介导的细胞增殖现象2 2敲除敲除Lrp6Lrp6后，与对照组相较，此时后，与对照组相较，此时PGE2PGE2介导的增殖现象无明显介导的增殖现象无明显抑制，敲除抑制，敲除CateninCatenin之后，增殖现象得到明显抑制。之后，增殖现象得到明显抑制。PGE2WT(+)-EP2inhibitor+-稳定地观察到加入EP2受体抑制剂之后，PGE2介导的增殖现象明显受到抑制进一步探索Lrp6和EP2蛋白相互作用的一些情况（IP等手段）谢谢