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1、完整版弗氏柠檬酸杆菌TPL基因的体外扩增毕业设计 常州工程职业技术学院 毕业设计报告（论文） 系 别： 制药与生物工程技术系 课题名称： 弗氏柠檬酸杆菌TPL基因的体外扩增 指导教师： 班 级： 生物制药1021 学生姓名： 摘 要聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，简称PCR)是最常用的分子生物学技术之一，通过变性、退火和延伸的循环来完成核酸分子的大量扩增。本实验是以基因组 DNA 为模板，利用PCR 技术从弗氏柠檬酸杆菌( Ci trobacter f reundii ) 中扩增得到含有酪氨酸酚解酶（the Tyrosine Phenol Lyase，简称T

2、PL）基因的有效DNA 片段，得到大量的有效基因。PCR技术产生时间虽不长，却以惊人的速度广泛应用于分子生物学各领域。PCR技术能够快速特异地扩增任何目的基因或DNA片段，它不仅可以用于基因分离、克隆和核酸序列分析，还可用于突变体和重组体的构建、基因表达调控的研究、基因多态性的分析、遗传病和传染病的诊断、肿瘤机制探查、法医鉴定等诸多方面。PCR技术已成为方法学上的一次革命，它必将大大推动分子生物学各学科和研究进展。关键词：弗氏柠檬酸杆菌 TPL 基因 PCR 扩增AbstractPolymerase Chain Reaction (PCR) is one of the common techn

3、iques in molecular biology, which can amplify nucleic acids through the cycle of denaturation， annealing and extension. Tyrosine phenol lyase gene-containing DNA fragment was amplified from Citrobacter freundii, get a lot of effective gene using PCR technology. PCR technology generation time is not

4、long, but it is widely used in various fields of molecular biology at an alarming rate. PCR technology can quickly and specifically any desired gene or DNA fragment was amplified, It not only can be used for gene isolation, cloning and DNA sequencing analysis can also be used for the construction of

5、 mutant and recombinant, the study of the regulation of gene expression, gene polymorphism analysis, genetic disease and infectious disease diagnosis, tumor mechanism explorationThe forensic identification, and many other aspects. PCR technology has become a revolution on the methodology, it will gr

6、eatly promote the various disciplines of molecular biology and research progress.Key words：citrobacter freundii gene PCR TPL amplification目录1 前言 21.1络氨酸酚裂解酶 31.2. PCR技术 31.3 立题依据和研究内容 41.3.1 立题依据.41.3.2 研究内容.42实验原理 52.1 SDS法制备基因组DNA 52.2 琼脂糖凝胶电泳原理 52.3 PCR反应原理 63实验器材与步骤 83.1实验材料 83.1.2实验试剂 83.2实验仪器

7、93.3实验步骤 93.3.1菌种培养.9.3.3.2 SDS法制备细菌基因组DNA 103.3.3电泳检测 113.3.4 PCR 124 实验结果和注意事项 134.1实验结果 134.2分析及注意事项.155结论 16致谢 16参考文献 161前言1.1 酪氨酸酚裂解酶左旋多巴又称L-多巴，为酪氨酸的羟化物，在体内是左旋酪氨酸合成儿茶酚胺的中间产物。左旋多巴一直是帕金森病治疗的金标淮。在帕金森症状的治疗中,左旋多巴比其他所有药物都更有效,这可能是由于其产物（多巴胺）是一种能同时作用于纹状体内两种多巴胺受体的生理性神经递质,而许多激动剂仅仅激活D2受体。引起异动和症状波动虽与应用左旋多巴有

8、关,但其根本原因是黑质的严重破坏。未来左旋多巴新给药方法的思路包括应用药物的新剂型,如经皮钻贴剂、鼻腔喷雾剂、咀嚼片以及缓释剂等1。 L-DOPA的衍生物多巴胺是一种重要的神经递质，由于多巴胺不能透过血脑屏障进入脑组织，所以不能通过补充多巴胺来治疗帕金森氏病，而L-DOPA可以通过血脑屏障，并在脑组织中脱羧形成多巴胺，从而使脑组织中多巴胺含量增加而达到治疗的目的。Birkmayer于1961年用左旋多巴治疗PD获得明显疗效2。L-DOPA及复方左旋多巴（如美多芭）已成为治疗常见老年病帕金森氏病的主要药物3,4。 1.2 L-DOPA生产的国内外研究进展 1911 年，Casimir Funk

9、在实验室中第一次成功合成 D,L-DOPA。1913，MarcusGuggenheim从蚕豆的豆荚中第一次分离提取到天然存在于植物体内的 L-DOPA2。综合国内外研究状况，目前，L-DOPA 主要通过从植物中提取、化学法合成以及微生物酶法转化等方法生产获得。上世纪70年代初，国外化学法合成L-DOPA的年产量已达150吨，但由化学法所合成出来的产物是D-型和L-型的混合物，而D-DOPA会引起人体毒性反应5，因此应用于医学临床之前必须通过控制旋光度的方法来减少D-DOPA的影响。解决此问题的最好办法是使D-型和L-型多巴完全分开，但D-型和L-型多巴的拆分非常困难。所以越来越多的研究者开始寻

10、求新的L-DOPA获得途径。 1.3 生物合成L-DOPA 上世纪 60 年代，国外许多学者开始致力于微生物酶法合成L-DOPA的研究。Larway 和Evans首次在嗜酪氨酸微螺菌（Microspiratyrasinatica）中发现了与L-DOPA形成有关的酪氨酸酶6。随后，John等在蜡状芽孢杆菌（Bucillus cereus）中也发现酪氨酸酶，并用来生产L-DOPA。为了提高L-DOPA产量和底物转化率，研究者们对微生物酶法合成L-DOPA的工艺方法进行了大量研究。酪氨酸酚裂解酶，又名-酪氨酸酶，以磷酸吡哆醛为辅酶，TPL可以催化L-酪氨酸发生-消去反应生成苯酚、丙酮酸和氨。由于这个

11、反应是可逆的，将邻苯二酚代替苯酚后，可由邻苯二酚、丙酮酸和氨可在TPL催化下生成L-DOPA。近年来，随着分子生物学技术的发展，一些学者开始运用基因工程的手段从含有TPL基因的野生菌株染色体DNA中克隆得到TPL基因片段，将其连接到不同的载体上构建重组质粒，然后转入宿主细胞中进行表达。1.2 PCR技术聚合酶链式反应（polymeras chain reaction，简称PCR）是近十几年发展和普及最迅速的分子生物学新技术之一，是一项在短时间内大量扩增特定的DNA片段的分子生物学实验技术。它具有强大的扩增能力，并且可与其他分子生物学方法和免疫学方法相结合应用，使其敏感性和特异性都大大增强。由于

12、PCR对世界生物医学研究的巨大推动作用，其发明者Saiki因而获得1992年诺贝尔医学奖。随着生命科学和经济的不断发展，人们对医药水平的要求在不断的提高。PCR技术以惊人的速度广泛应用于分子生物学各领域。PCR技术能够快速特异地扩增任何目的基因或DNA片段，并很容易使得微微克（pg）水平的起始物达到毫微克（ng）水平的量。它不仅可以用于基因分离、克隆和核酸序列分析，还可用于突变体和重组体的构建、基因表达调控的研究、基因多态性的分析、遗传病和传染病的诊断、肿瘤机制探查、法医鉴定等诸多方面。PCR技术已成为方法学上的一次革命，它必将大大推动分子生物学各学科和研究进展。 PCR可以由体外酶促合特异D

13、NA片段，通过高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的基因得以迅速扩增。其主要步骤是：待扩增DNA于高温下解链成为单链模板；人工合成的两个寡核苷酸引物在低温条件下分别与目的片段两侧的两条链互补结合；DNA聚合酶在72将单核苷酸从引物3端开始掺入，沿模板53方向延伸，合成DNA 新股。由于每一周期所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，所以PCR产物以指数方式增加，经过25-30次周期之后，理论上可增加109倍，实际上至少可扩增1.3本课题的立题依据和研究内容1.3.1 立题依据酪氨酸酚裂解酶（Tyrosine Phenol-lyase，TPL，EC 4.1.99.2

14、）也称-酪氨酸酶，在生物体内催化L-酪氨酸裂解生成苯酚、丙酮酸和氨，但在生物体外可将苯酚、丙酮酸和氨转化为L-酪氨酸，而L-酪氨酸常作为营养补充剂、苯丙酮尿症患者的必需氨基酸，是L-多巴的重要制备原料。此外，该酶在磷酸吡哆醛的作用下，能够催化一系列的、消除反应、取代反应以及、消除反应和消旋反应的逆转。因此TPL是一种广泛应用于医药行业的酶类，解决它的大规模工业化生产是一个迫在眉睫的问题。本课题应用分子生物学手段，通过PCR体外扩增技术，体外合成目的基因，并扩大培养，得到目标产物，简化了生产过程，为生物制剂的大规模工业生产提供了一定的借鉴。1.3.2研究内容（1）弗氏柠檬酸杆菌的培养（2）目的基

15、因的构建与体外扩增（3）表达产物的鉴别2 实验原理2.1 SDS法制备基因组DNA的原理细菌基因组DNA （染色体DNA）的提取一般是先用溶菌酶处理，破坏细菌细胞壁，然后再加入SDS和/或蛋白酶K，使细菌细胞裂解，同时解离与核酸结合的蛋白质，再利用有机溶剂使蛋白质彻底变性。通过离心，细胞碎片及变性蛋白质复合物被沉淀下来，而DNA择留在上清液中，利用乙醇或异丙醇沉淀溶液中的DNA。用无DNA酶的RNA酶水解溶液中的RNA，最终获得纯度较高的细菌DNA。溶菌酶（lysozyme）是一种能水解粘多糖的碱性酶，它通过破坏细菌细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之间的-1,4糖苷键，使细胞壁不溶

16、性粘多糖分解成可溶性糖肽，从而使细菌细胞壁破裂。SDS是一种强阴离子去污剂，其主要作用是：结合膜蛋白而破坏细胞膜、核膜；是核蛋白体（DNP）中的蛋白质与DNA分离；与蛋白质结合，使蛋白质变性而沉淀。蛋白酶K能在SDS和EDTA存在的情况下保持较高的活性，可将与DNA结合的蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分离出来。EDTA也具有降低细胞膜稳定性，并抑制DNase活性的作用。Tris-HCl（8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏。高浓度的NaCl可使蛋白质、多糖等杂质沉淀。上清液用酚/氯仿/异戊醇反复抽提除去蛋白质，再用乙醇或异丙醇沉淀中的DNA。2.2 琼脂糖凝胶电泳原理DNA分

17、子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷在电场中向正极移动。由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此他们能以相同的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。DNA分子的迁移速度与相对分子质量对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可以分离不同相对分子质量的DNA， 也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。 2.3 PCR反应原理聚合酶链反应（polymerase chain re

18、action， PCR）是体外酶促合成特异 DNA片段的一种技术。利用PCR技术可在数小时之内大量扩增目的基因或DNA片段，从而免除基因重组和分子克隆等一系列繁琐操作。由于这种方法操作简单、实用性强、灵敏度高并可自动化，因而在分子生物学、基因工程研究以及对遗传病、传染病和恶性肿瘤等基因诊断和研究中得到广泛应用2.3.1引物设计的基本原则PCR反应中有两条引物，即5端引物和3引物。设计引物时以一条DNA单链为基准（常以信息链为基准），5端引物与位于待扩增片段5端上的一小段DNA序列相同；3端引物与位于待扩增片段3端的一小段DNA序列互补。引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。引物碱基：G

19、+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。引物内部不应出现互补序列。两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3 端的互补重叠。引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%，引物3末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。引物3端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，最佳选择是G和C。引物的5 端可以修饰。如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地高辛标记，加入其它短序列，包括起始密码子、终止密码子等2.3.2 PCR 反应参数1.

20、变性：在第一轮循环前,在94下变性5-10min 非常重要,它可使模板DNA 完全解链,然后加入Taq DNA聚合酶(hot start),这样可减少聚合酶在低温下仍有活性从而延伸非特异性配对的引物与模板复合物所造成的错误。变性不完全,往往使PCR 失败,因为未变性完全的DNA 双链会很快复性,减少DNA 产量.一般变性温度与时间为94 1min。在变性温度下,双链DNA 解链只需几秒钟即可完全,所耗时间主要是为使反应体系完全达到适当的温度。对于富含GC 的序列,可适当提高变性温度.但变性温度过高或时间过长都会导致酶活性的损失。2. 退火：这是PCR 的一个关键参数。在理想状态下，退火温度足够

21、低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从55到70。退火温度一般设定比引物的Tm 低5, 当产物中包含有影响实验的非可异性扩增带时,以2为增量，逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。如果两个引物Tm 不同，将退火温度设定为比最低的Tm 低5。或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm 设计的退火温度先进行5 个循环，然后在根据较低Tm 设计的退火温度进行剩余的循环。这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。退火温度越高,所得产物的特异性越高。有些反应甚至可将退火与延伸两步合并,只用两种温度(例如用60和94)完

22、成整个扩增循环, 既省时间又提高了特异性。退火一般仅需数秒钟即可完成,反应中所需时间主要是为使整个反应体系达到合适的温度。3. 延伸：延伸反应通常为72,接近于Taq DNA 聚合酶的最适反应温度75.实际上,引物延伸在退火时即已开始,因为Taq DNA 聚合酶的作用温度范围可从20-85.延伸反应时间的长短取决于目的序列的长度和浓度.在一般反应体系中,Taq DNA聚合酶每分钟约可合成1kb 长的DNA。延伸时间过长会导致产物非特异性增加.但对很低浓度的目的序列, 则可适当增加延伸反应的时间。一般在扩增反应完成后,都需要一步较长时间(10-30min)的延伸反应,以获得尽可能完整的产物, 这

23、对以后进行克隆或测序反应尤为重要。4. 循环次数：当其它参数确定之后, 循环次数主要取决于DNA 浓度。一般而言25-30轮循环已经足够。循环次数过多,会使PCR 产物中非特异性产物大量增加。通常经25-30 轮循环扩增后, 反应中Taq DNA 聚合酶已经不足, 如果此时产物量仍不够, 需要进一步扩增,可将扩增的增效率有关,扩增产物的量可用下列公式表示:CCo(1+P)n 。其中：C 为扩增产物量, Co为起始DNA 量, P 为增效率, n 为循环次数。在扩增后期,由于产物积累,使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线,产物不再随循环数而明显上升,这称为平台效应。平台期会使原先由于错配而产生的

24、低浓度非特异性产物继续大量扩增，达到较高水平。因此，应适当调节循环次数，在平台期前结束反应，减少非特异性产物。2.3.3 PCR扩增的理论模式PCR扩增为指数扩增，每一扩增周期后产物的量可以下式表达：Yn=Yn-1(1+E)=Yn-2(1+E)2=X(1+E)n0E1其中E表示扩增效率，Yn表示在n个周期后PCR产物的分子数量，Yn-1为n-1个周期后PCR产物的分子数量。等式仅在限定的扩增周期数（通常为20或30）内成立。超过此周期数，扩增过程即由指数扩增降低至稳定的扩增速率，最终达到平台，不再扩增.2.3.4影响PCR的因素PCR 是非常直接、简单又具有强大威力的技术。诚如一位当年参与 P

25、CR 诞生的资深研究员 Henry Erlich 所言 ” 在分子生物学的领域中，只要拥有它，你便可以无照营业 ”。也因此，活用及慎用 PCR 是确保一定品质的必要条件。 PCR 本身虽然是一个单纯的实验技术，但是一个好的 PCR 反应及其产物则是受到很多因素的影响。这些因素色括反应中各种原料的浓度 (Taq. Polymerase, primers, dNTPs, MgCl2) ，也包括整个反应中各步骤的温度与时间的设定。当然 DNA 模板 (Template) 与 引信 (Primers) 本身条件也占有一定的重要性。近来的观念中，共溶剂诸如 Dimethyl sulfoxide (DSM

26、O) 、 glycerol 、 Foramide and Tetramethylammonium chloride (TMAC) 也对整个反应产生若干重要的影响。3实验器材与步骤3.1 实验材料（1）菌株 弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter freundii）349-14和弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter freundii）351-14，均由常州工程职业技术学院江苏省应用酶工程技术研究开发中心提供。 （2）试剂Tris、EB、EDTA、SDS、乙酸钠、氯化钠、苯酚、氯仿、无水乙醇、氯化钠、胰化蛋白胨、酵母抽提物、氯化镁、石蜡油、硼酸、琼脂糖等，均为分析纯。（3）酶及其他材料溶菌酶、R

27、NA水解酶、蛋白酶K、Taq酶、dNTP、引物、DNA marker 等，均由常州工程职业技术学院江苏省应用酶工程技术研究开发中心提供。3.2实验仪器（1）设备洁净工作台（SW-CJ-IF）上海博迅实业有限公司医疗设备厂（2）仪器电子天平1（FA1104）上海良平仪器有限公司电子天平2（MP5002）上海舜宇恒平科学仪器有限公司恒温气浴摇床（HZ-8811K）常州市博宏高科试验设备有限公司手提式不锈钢压力蒸汽灭菌器（SYQ.DSX-280B）上海申安医疗器械厂隔水式恒温培养箱（GSP-9080MBE）上海博迅实业有限公司医疗设备厂数显恒温水浴锅（HH-4）国华电器有限公司基因扩增热循环仪（DT

28、C）西安天隆科技有限公司电泳仪（DYY-4C）北京市六一仪器厂漩涡混合器（QT-1）上海琪特分析仪器有限公司热磁力搅拌器（SH-3）台式高速离心机（RJ-TGL16B）无锡市瑞江分析仪器有限公司冰箱（BCD-155TD-GA）青岛海尔股份有限公司可见紫外检测仪（ZF-401）上海市顾村电光仪器厂3.3实验步骤3.3.1菌种培养（1）配制LB培养基(g/L)：培养基在锥形瓶中配制完成并溶解。液体培养基50mL（胰蛋白胨10%，酵母粉5%，NaCl10%；pH 7.2）。固体LB培养基100 mL（液体培养基添加1.5的琼脂）。（2）灭菌：将平板2块与装有培养基的锥形瓶分别包扎，移液枪枪头与1.5

29、 mL的离心管置于密封容器中，用高压蒸汽灭菌锅灭菌。（3）倒平板：待培养基冷却至50左右时在酒精灯火焰附近操作进行。其过程是：在酒精灯火焰旁右手拿锥形瓶，左手拔出棉塞；使锥形瓶的瓶口迅速通过火焰，目的是消灭瓶口的杂菌，防止杂菌感染培养基；左手将培养皿打开一条缝隙，右手将培养基倒入培养皿后，立刻盖上皿盖。 （4）菌种活化：待平板冷却凝固后，划平板，接柠檬酸杆菌349-14和柠檬酸杆菌351-14的菌种，放置片刻，将平板倒置，防止培养基冷却过程中形成的水滴落到培养基表面。最后放入恒温培养箱，37过夜培养，第二天，观察菌种活化情况，情况较好可放入冰箱4保存。（5）扩大培养：1.将培养好的培养皿（不要

30、打开皿盖）用75%的酒精擦拭，放进无菌超净台中，2.用酒精灯灼烧接种环，3. 待接种环冷却，用接种环挑取培养皿上的菌落，4.将接种环伸入经过灭菌的液体培养基，摇晃接种环，使菌种均匀分散到培养液中，然后包扎封口锥形瓶，5.将接种后的锥形瓶放入37 、200r/min摇床过夜培养。（培养时间不能太长，否则细菌老化，代谢产物太多。影响质粒质量。6.培养皿继续放入冰箱4保存。 3.3.2 SDS法制备细菌基因组DNA（1）菌体收集：取已经培养过夜的弗氏柠檬酸杆菌菌悬液（349-14或351-14）1.5mL于1.5mL离心管中，12000r/min离心1min，弃上清，收集菌体（注意吸干多余的水分）。

31、（2）辅助裂解：阳性菌破壁裂解比较困难，可以先用溶菌酶处理。加入100ug/mL溶菌酶50uL ，37处理1h。（3）裂解：向每管加入200uL裂解缓冲液（40mmol/L Tris-HCl pH8.0，20mmol/L乙酸钠，1mmol/L EDTA,1%SDS），用枪头反复吹打以悬浮和裂解细菌细胞。（4）接着向每管加入66uL 5mol/L NaCl，充分混匀后，12000r/min离心10min，除去蛋白质复合物及细胞壁等残渣。（5）将上清液转移到新离心管中，加入等体积的用Tris饱和的苯酚，充分混匀后，12000r/min 离心5min，进一步沉淀蛋白质。（6）取离心后的水层，加等体积的氯仿，充分混匀后，12000r/min离心5min，去除苯酚。