紫外吸收法测定蛋白质DNA浓度用户指导书Finaldocx.docx

1、紫外吸收法测定蛋白质DNA浓度用户指导书Finaldocx紫外吸收法测定蛋白质/DNA浓度用户指导书北京普析通用仪器有限责任公司应用技术部2004年7月前言: 11.蛋白质/DNA浓度测定的意义 12.紫外吸收法测定蛋白质/DNA浓度的原理 12.1紫外吸收法测定蛋白质浓度的基本原理 12.2紫外吸收法测定DNA浓度的基本原理 23.紫外吸收法测定蛋白质/DNA浓度的方法 23.1纯蛋白质浓度的测定方法 23.2纯DNA浓度的测定方法 43.3蛋白质/DNA混合溶液浓度的测定方法 54.UVWin5.0软件包测定蛋白质/DNA浓度的使用方法 74.1.启动DNA蛋白质测定功能 74.2.设置测

2、量参数 84.3.处理测量结果 95.影响紫外吸收法测定蛋白质/DNA浓度的因素 96测定蛋白质/DNA浓度的其他应用方法简介 11前言:本书将主要介绍紫外吸收法测定蛋白质/DNA浓度的原理、方 法以及在测定过程中的一些影响因素，并对其他一些使用化学试剂测 定蛋口质/DNA的方法进行了讨论，旨在对用户测定蛋白质/DNA时 有一定的指导意义。1.蛋白质/DNA浓度测定的意义“21世纪是生物科学的世纪”！随着克隆羊的成功，随着人类基因组计划的实施和推进，生命 科学研究已进入了后基因组时代。在这个时代，生命科学的主要研究 对象是功能基因组学，包括结构基因组研究和蛋白质组研究等，而基 因组学、蛋口质组

3、学的最基木的研究单位就是蛋口质和DNAo因此, 蛋白质和DNA浓度的测定方法，成为生物化学研究中最常用、最基 本的分析方法之一。紫外吸收法是在不引入化学试剂的情况下，直接利用待测物质 在紫外区的吸收性质，来测定其浓度的方法。该方法因测量简单、快 速，不需要试剂，更为重要的是它不破坏待测样品，因此越来越受到 重视，并被广泛应用。2.紫外吸收法测定蛋白质/DNA浓度的原理2.1紫外吸收法测定蛋白质浓度的基本原理蛋白质为生物大分子，所产生的紫外吸收往往是其分子内的小 基团所引起的，例如酪氨酸、苯丙氨酸，色氨酸和肽键等等。1.在蛋白质分子中，酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）和色氨 酸（Trp）残基

4、的苯环含有共轨双键，该共辘双键对紫外光有吸收（其 屮最大吸收Tyr在274nm； Phe在257nm； Trp在280nm）,从而导致 该蛋白质对紫外光有吸收，且其吸光度值与这三种氨基酸的浓度相 关，从而与蛋白质的浓度相关。2.肽键对紫外光有吸收（其最大吸收在238nm）,因此蛋白质 溶液在238nm的光吸收值与其肽键含量成止比，从而与蛋白质溶液 的浓度相关。2.2紫外吸收法测定DNA浓度的基本原理DNA也为生物大分了，所产生的紫外吸收也是其分了内的小基 团所引起的，例如卩票吟碱、卩密呢碱等等。卩票吟碱、唏噪碱以及由它们参与组成的核昔、核昔酸及核酸 （DNA&RNA）对紫外光都有强烈的吸收作用

5、。它们吸收紫外光的共 同特点是在260nm处为最人吸收值。3.紫外吸收法测定蛋白质/DNA浓度的方法3.1纯蛋白质浓度的测定方法1.280nm下的光吸收法这是最常用的测定蛋白质浓度的紫外吸收法。方法依据：蛋白质分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在280nm 附近具有最大吸收，而且各种蛋口质的这三种氨基酸的含量差别不 大,所以很多蛋口的浓度与A280成正比。测定方法：测定蛋白质标准溶液在280nm处的吸收值A,以A 对蛋白质标准溶液浓度作标准曲线，然后再测定待测样品在280nm 处的吸收值A,通过标准曲线法计算出样品浓度。方法的缺点：（1） 干扰物质较多，高浓度的盐（如NaCI）、含有共轨双键的

6、有机溶剂、核酸都会对测量结果产生干扰。因此本方法一般只适用于 纯蛋白溶液（不含其他盐类或其他盐类浓度非常低）。（2） 目标蛋白与标准蛋白中所含上述三种氨基酸的含量差别较 犬时，测量结果将会产生大的偏差。值得注意的是，目前该方法的应用已经非常广泛，很多蛋白在 一定浓度和一定波长下的吸光度A值都有文献数据可查，因此将所 测吸光度A值结合文献数据即可以计算出相应的蛋白质浓度。2.肽键测定法（A238法）蛋白质溶液在238nm处的光吸收的强弱，与肽键的多少成正比, 故此法称为A238法。（有吋也可以使用A230法取代）测定方法：测定蛋白质标准溶液在238nm处的吸收值A,以A 对蛋白质标准溶液浓度作标

7、准曲线，然后再测定待测样品在238nm 处的吸收值A,通过标准曲线法计算出样品浓度。A238法比A280法灵敏，但多种有机物，如醇、酮、醛、醯、有 机酸、酰胺类和过氧化物等都有干扰作用。所以最好用无机盐、无机 碱或水溶液进行测定。若含有有机溶剂，可先将样品蒸干，或用其他 方法除去干扰物质，然后用水、稀酸或稀碱溶解后再作测定。3.215nm和225nm下的光吸收差法：本方法为一个经验公式。蛋白质的稀溶液由于含量低而不能使用280nm的光吸收测定 时，可用215nm与225nm下的光吸收值之差，通过标准曲线法来测 定蛋口质稀溶液的浓度。吸收差A= A215 A225测定方法:测定蛋白质标准溶液在2

8、15nm和225nm处的吸收值, 计算出吸收差,以对蛋白质标准溶液浓度作标准曲线，然后再测 定待测样品在215nm和225nm处的吸收值，计算出吸收差,通过 标准曲线法计算出样品浓度。在蛋白质浓度20lOOyg/ml范围内，蛋白质浓度与吸光度差值 成正比，其中NaCl、(NH4) 2SO4以及0.1M磷酸、硼酸和Tris等缓 冲液，都无显著干扰作用，但是O.INNaOH, 0.1M乙酸、琥珀酸、邻 苯二甲酸、巴比妥等缓冲液的215nm光吸收值较大，必须将其浓度 降到0.005M以下才无显著影响。3.2纯DNA浓度的测定方法DNA在260nm下有最大吸收，且A260值与DNA的浓度成正比 例关系

9、。因此，可以根据DNA溶液的A260值来计算DNA溶液的浓 度。测定方法：测定DNA标准溶液在260nm处的吸收值A,以A 对DNA标准溶液浓度作标准曲线，然后再测立待测样品在260nm处 的吸收值A,通过标准曲线法计算出样品浓度。缺乏DNA标准溶液时，可以利用下面的经验公式来计算：C = 50 X A26o (ug/mL)DNA浓度较低时(20200 ug/mL),上述经验公式线性相关性 较好。同时，如果存在高浓度的盐、带共觇双键的有机溶剂和蛋白质, 都会对测量结果产乞影响。3.3蛋白质/DNA混合溶液浓度的测定方法蛋白质和核酸(DNA&RNA)是生物体内故重要的两种物质， 绝大多数生物体内

10、都含有大量的蛋白质和核酸，而且两者紧密相关， 互为依存。从生物体内提取蛋片质时，通常混有核酸；从生物体内提 取核酸时，又通常混有蛋口质，而两者在紫外区乂都有吸收，所以在 测定其浓度时，如果采用上述纯溶液的测定方法，都会对对方有干扰。 因此，针对这种情况，形成了一些专门测定蛋白质/DNA混合溶液浓 度的方法。1. 280nm和260nm下的光吸收差法核酸对紫外光有很强的吸收，在280nm处的吸收比蛋口质强10 倍,在260nm处的吸收更强，核酸260nm处的消光系数是280nm处 的2倍。而蛋白质则相反，280nm紫外吸收值大于260nm的吸收值。依照蛋白质和核酸分别在260nm和280nm处吸

11、光度的差异，可 以依据A28o/A26o判断蛋白质和核酸的比例，如下：纯蛋口质的光吸收比值：A280/A260 1.8蛋白质核酸混合溶液： A28O/A26O 1.80.5纯核酸的光吸收比值：A28o/A26o0.5测定方法：对于蛋白质和核酸（以DNA为代表）的混合溶液, 宜接在260nm和280nm下测定其吸光度值，由下面的经验公式，即 可分别算出蛋白质和核酸（DNA）的浓度：蛋 H 质浓度 =1552 X A280757.3XA260 （ug/ml）DNA 浓度 =62.9X A26o-36.OX A280 （ug/ml）注意：（1）该公式为一系列蛋白与核酸的混合溶液通过统计归 纳出的经验

12、公式，上述四个系数针对不同的情况还需要修止；（2）该方法受很多干扰物质的影响，前文所述纯溶液测定方法 的干扰物质都会对本方法产生干扰，如高浓度的盐（如NaCI）和含 有共轨双键的有机溶剂等等。2. 230nm和260nm下的光吸收差法依前文所述，蛋白质中肽键在238nm下有最大吸收值，可以取 A230作为其一个近似值，同时核酸在230nm附近也有较强吸收，因此, 对于蛋白质和核酸（以DNA为代表）的混合溶液，可分别测定其A230 和人260。测定方法：直接在230nm和260nm下测定其吸光度值，由下面 的经验公式，即可分别算出蛋白质和核酸（DNA）的浓度：蛋白质浓度=183.0XA230-7

13、5.8XA260 （ug/ml）DNA 浓度 =49.1XA2603.48 XA230 （ug/ml）与A280/A260光吸收差法类似，该公式也是为一系列蛋口与核酸 的混合溶液通过统计归纳出的经验公式，上述四个系数针对不同的情 况也需要修正。与a280/a260光吸收差法相比，此方法具有更高的精确度，同时 干扰物质也更多，除了高浓度盐、带共辄双键的有机物之外，一些醇、 有机酸和过氧化物也会产生干扰。4. UVWin5.0软件包测定蛋白质/DNA浓度的使用方法由于紫外吸收法测量蛋口质/DNA浓度被广泛应用，北京普析 通用仪器有限责任公司在紫外可见分光光度计专用软件U VWin5.0上 专门为其

14、设计了一个软件包，该软件包综合了上述所有的紫外吸收法 测定蛋白质浓度的方法，其屮将最常用的测定蛋白质/DNA混合溶液 的方法形成两个专用方法，分别为方法1（uA23O/A26o法”）和方法2 （A280/A260法”），同吋还预留了个自定义模块供用户根据实际情 况和需求，自己设计检测波长和进行差值运算的系数。另外，基于蛋口质/DNA在320nm之上均没有光吸收的原理， 该软件还设计了一个“波长320nm背景校正”的可选功能，以方便 用户能够更好地选择合适的测定方法。总的来说，UVWE5.0蛋口质/DNA测定专用软件包基本上涵盖 了所有的可以根据紫外吸收来测定蛋白质/DNA浓度的方法。软件的 具

15、体操作方法如下：4.1.启动DNA蛋白质测定功能启动UVWin5.0软件之后，如果您需要进行DNA蛋白质分析, 选择【应用】菜单下的DNA/蛋白质分析】子菜单，系统会打开DNA 蛋口质测量窗口。如图所示。窗口将分为两个部分，位于中间部分的 为显示窗口，显示当前的测量结果。位于下方的是控制台，您可以通 过点击控制台上的按钮来开启相应的功能。图1 DNA蛋白质测定窗口42设置测量参数在控制台按钮中，有一个名为【设置】的按钮，点击此按钮即可打开参数设置窗口。如图所示。谙选择方法：方法1方法2目定义|260, 00(280.00Dfttl,A2)|62, 9036.00Pf(AbA2)|757, 30

16、|1552, 00P 320nm背静校正 校正系数TosT确定取消图2DNA蛋白质参数设置WL (Al, A2)：表示DNA蛋白质的两个测是波长。Df (Al, A2)：表示DNA的两个系数。Pf (Al, A2)：表示蛋白质的两个系数。如果您要进行320nm的背景校正，点击【320nm背景校正】选 择框，然后输入相应的校正系数即可。DNA蛋白质的计算方法如下：不进彳亍320nm校正DNA 浓度=Dfl XAl-Df2XA2蛋白质浓度=Pf2XA2-PflXAl进行320nm校正(Al = A1-A320, A2 = A2-A320)DNA 浓度=DflXAl-Df2XA2蛋白质浓度=Pf2X

17、A2-PflXAl另外，在控制台按钮中，还有一个名为【仪器】的按钮，点击 此按钮即可打开仪器参数设置窗口，如光谱带宽等。4.3.处理测量结果DNA蛋口质的测量是非常简单的，您只需要将样品放入样品 池，然后点击控制台上的【测量】按钮即可完成测量。如果您要对测 量结果进行打印输出，点击控制台上的【打印】按钮。如果您要导出 测量结果，点击【导出】按钮。5.影响紫外吸收法测定蛋白质/DNA浓度的因素紫外吸收法测定蛋口质/DNA浓度的最大特点就是操作简单、 测量迅速，而且不需要引入试剂；但是它也面临着很多问题，诸如测 量准确性的问题。木节将讨论影响测定的一些主要因素。(1)蛋白质的不同对测定结果的影响。

18、由于蛋白质是生物大分子，而紫外吸收往往是其分子内的小基 团所引起的，例如酪氨酸、苯丙氨酸，色氨酸和肽键等等。因此当蛋 口质不同，其包含的上述小基团含量发生变化吋，就会影响蛋口质含 量的测定。然而蛋白质种类繁多，结构复杂，很难对其进行有效的归 类。例如人体内含蛋白质的种类约有10万种，整个生物界的蛋白质 种类估计有100亿种。建议：测量过程中如果条件允许，应尽量使用相近的蛋白质做 标准曲线，修正测量参数，以便得到更为准确的数值。（2） 溶液中干扰物质的影响。由于蛋白质所包括的具有紫外吸收的小基团为常见基团，其产 生紫外吸收的特异性并不强，很多具有类似结构的有机溶剂都会有类 似的紫外吸收，如醇、酮

19、、醛、醞、有机酸、酰胺类，这些混入蛋白 质溶液都会对测量产半干扰。另外，一些高浓度的无机化合物也会对 蛋白质的含量测定产生干扰，例如NaOH、NaCI等等。建议：测量时应尽量排除干扰物质，同时选择合适的参比溶液。（3） 溶剂吸收的影响。如果以一些在紫外区有吸收的物质做溶剂（例如醇、酮类），会 对测量结果产牛很大的影响。建议：测量时尽量不要使用此类溶剂，或者在测量时选择合适 的参比。（4） PH对测定的影响。PH变化时对蛋白质含量测定的影响非常大，例如：下图为Tyr 的吸收谱线与PH的关系。由图可以发现，PH=6和PH=13时，光吸 收度已经有了非常大的差异。建议：测定样品时不要使溶液处于过酸或

20、者过碱的状态，同时 样品的PH值要与标准品的PH值尽量保持一致。(5)环境极性、蛋白质构象、蛋白质折叠与变性都会对蛋白含量的 测定产生影响。6.测定蛋白质/DNA浓度的其他应用方法简介紫外吸收法测定蛋白质/DNA浓度的方法虽然因其操作简单、 快速的特点已经被广泛应用，但是因其准确度较差，测量过程中干扰 物质较多，不能满足用户精确测量的需求。本节将介绍一些使用化学 试剂来测定蛋白质/DNA浓度的应用方法。(1)考马斯亮兰法(Bradford法)测定蛋白质浓度这是目前最常用的使用化学试剂测量蛋白质浓度的方法。考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋口质结合，溶液的 颜色市棕黑色变为兰色，同时使染

21、料的最大吸收峰的位置由465nm 变为595nmo冃前普遍认为，G250染料主要是与蛋白质中的碱性氨 基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合而变色。因此，在 595nm下测定溶液的吸光度值A595,该吸光度值与蛋白质浓度成正比。Bradford法的突出优点是：1灵敏度高。本方法灵敏度可达lug/mLo这是因为蛋白质与染 料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质-染料复合物有非常高的消光 系数。2测定快速、简便。本方法只需加一种试剂考马斯亮蓝G-250, 而且染料与蛋白质结合非常快，大约只要2分钟即可完成，其颜色又 口J以在1小时内保持稳定，其中在5分钟至20分钟之间，颜色的稳 定性最好。测量时

22、，将染料与样品混合摇匀，测定其A595值即可，完 成一个样品的测定，只需要1分钟左右。3干扰物质相对较少。主要的干扰物质有：去污剂、Triton X-100十二烷基硫酸钠(SDS)和0.1 N的NaOH等。值得注意的是，该法也有一些缺陷：1由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，该 法用于不同蛋白质测定时有较大的偏湼，因此，在制作标准曲线时通 常选用g-球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。2标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计 算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。(2)微量凯氏(Kjeldahl)定氮法测定蛋白质浓度这是一种经典方法。蛋白质样品与浓硫酸共

23、热，含氮有机物即分解产生氨(消化), 氨乂与硫酸作用，变成硫酸氨；经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽 将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之含氮量。该方法灵敏度较低(02lmg/mL),操作复杂，比较费吋(约8 10小时)，不过干扰物质非常少。该方法目前已经很少使用。(3)双缩服法(Biuret法)测定蛋白质浓度双缩服(NH2-CO-NH-CO-NH2)是两个分子麻(NH2-CO-NH2) 经180C左右加热，放岀一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中, 双缩腺与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩服反应。凡具有两个酰 胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这 类

24、化合物都有双缩豚反应。蛋白质可以和CuSO4发生双缩麻反应，形成的紫色络合物的颜 色深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关， 故可用来测定蛋白质含量。此法的优点是较快速，干扰物质少(主要干扰物质有硫酸鞍、 Tris缓冲液和某些氨基酸等)，不受蛋白质差异的影响；主要的缺点 是灵敏度差(l10mg/mL)。因此双缩腺法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋口质 测定。(4)Folin酚试剂法(Lowry法)测定蛋白质浓度Folim酚试剂法的显色原理与双缩腺方法是相同的，只是加入了 第二种试剂，即Folim酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白 质的灵敏度。这两种显色反应产牛深蓝

25、色的原因都是:在碱性条件下, 蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。Folin 酚试剂中的磷钮酸盐- 磷钩酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深蓝色（鋁 蓝和钩蓝的混合物）。在一定的条件下，蓝色深度与蛋白的量成正比。该法的优点是灵敏度高（5ug/mL）,比双缩腺法灵敏得多，缺点 是时间较长（大约2小时），要精确控制操作时间，标准曲线也不是 严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。对双缩月尿反应发生 干扰的离了，也会干扰Lowry反应，而且对后者的影响还要大得多。 例如酚类、柠檬酸、硫酸鞍、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类甘油等均 有T扰作用。浓度较低的尿素（0.5%）,硫酸纳（1%）,硝

26、酸纳（1%）, 三氯乙酸（0.5%）,乙醇（5%）,乙讎（5%）,丙酮（0.5%）等溶液 对显色无影响，但这些物质浓度高时，必须作校正曲线。含硫酸鞍的 溶液，只须加浓碳酸钠氢氧化钠溶液，即可显色测定。若样品酸度 较高，显色后会色浅，则必须提高碳酸钠一氢氧化钠溶液的浓度12 倍。依干扰物质的不同，本方法常作为考马斯亮蓝法的备选方法， 交替使用。（5） BCA （Bicinchoninc acid）法测定蛋白质浓度BCA法与Lowry法相似，主要差別在碱性溶液中，蛋白质使铜 离子由二价转变成一价后，进一步的以BCA取代Folim酚与一价铜 离子结合产生很深的紫色，在波长562nm有很强的吸光度，该

27、吸光 度值与蛋白质浓度成正比。本法的优点在于碱性溶液中BCA比Folim酚稳定，因此BCA 与碱性铜离子溶液结合的呈色反应只需一步骤即完成。本法的灵敏度 与Lowry法相似，以微量分析（microassay）灵敏度可测至约0.5-10 g/mlo本方法对于阴离子、非离子性及二性离子的清洁剂、盐酸弧 和尿素较具容忍度，不易受干扰，但也会受原糖以及EDTA的干扰。BCA法和Folin酚法一样，通常作为考马斯亮蓝法的备选方法, 交替使用。（6）琼脂糖凝胶电泳法测定DNA浓度从生物体中提取的总DNA浓度一般是通过紫外吸收法（A260 法）来测定，当需要测定某些特定DNA浓度时，通常先进行琼脂糖 凝胶电泳分离DNA,然后用漠化乙锭进行染色（漠化乙锭能够插入 到DNA的双链上，而且在紫外灯的照射下又会产生荧光），再用凝 胶成像系统进行分析，最后可以得出各个特定DNA的浓度。此方法灵敏度很高，可以ng级的DNA,干扰物质少；不过操 作较为复杂，时间也比较长（约2小时），而且澳化乙锭毒性较大。 因此一般不用来测定总DNA的浓度。结束语：普析通用本着用户为本、服务至上的原则，不断完善我们的服 务体系和服务内容，用户指导书就是基于这样的原则新鲜推出的。希 望该指导书能对大家的分析工作有一定的帮助，也希望大家能提供宝 贵的建议和意见，以便我们更好地掌握用户的需求，完善我们的工作。