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1、最新基因工程笔记总结成功秘诀：好市口个性经营第二章 Enzymes第四节 DNA连接酶Ligase一、DNA连接酶的发现二. 连接条件必须是两条双链DNA。DNA3端有游离的-OH，5端有一个磷酸基团（P）。需要能量。三、连接反应的机理1、ATP（NAD+)提供激活的AMP。2、ATP与连接酶形成共价“连接酶-AMP”复合物，并释放出焦磷酸PPi。3、AMP与连接酶的赖氨酸 -氨基相连。4、AMP随后从连接酶的赖氨酸 -氨基转移到DNA一条链的5端P上，形成“DNA-腺苷酸”复合物。5、 3-OH对磷原子作亲核攻击，形成磷酸二脂键，释放出AMP。Ligase：只连“Nick切口”，不连“Gap

2、缺口”四. 两种 DNA连接酶1. E. Coli DNA ligase来源：E.coli 适用：粘性末端（PEG与高浓度一价阳离子存在可连平末端）2. T4 ligase来源：T4 phage 适用：粘性末端 及 平末端T4 vs. E.coliT4 DNA ligase制备容易，价格便宜，能进行各种类型连接反应，应用更广泛！五.Ligase的反应温度最佳温度：界于酶作用速率和末端结合速率之间，一般认为是4-15比较合适。六. DNA分子连接的四种形式1. 粘性末端；2. 平末端；3. 平末端加尾；4. 平末端加衔接物(linker)或接头(adaptor)(1)Digestion and

3、Ligation1粘性末端连接Problem: (自我环化作用)解决方法：a、双酶切（两种内切酶）b、去磷酸2.平末端连接粘性末端连接效率高于平末端约100倍！解决方法：化平末端为粘性末端 3. 平末端连接-同聚物加尾法（1）末端脱氧核苷酸转移酶功能：5至 3单链聚合作用特点：单链；无模版作用机理：a: 用5-特异的核酸外切酶处理DNA分子，以便移去少数几个末端核苷酸, 获得3-OH的单链延伸末端。b: 加入dATP/dTTP和末端脱氧核苷酸转移酶组成的反应混合物中，DNA分子的3-OH末端将会出现单纯由poly(dA)和poly(dT)组成的DNA单链延伸。c: 获得poly(dA)和pol

4、y(dT)尾巴，就会彼此连接起来。缺点：当poly(dA)，Poly(dT)不严格等长时,重组DNA分子会有缺口。需要用DNA聚合酶I填补，然后用DNA连接酶连接最后的缺口。4. 平末端连接-衔接物连接法与接头连接法 (1) 平末端的衔接物连接法衔接物的5末端和待克隆的DNA片段的5 -末端，用多核苷酸激酶处理使之磷酸化。通过T4 DNA连接酶的作用使两者连接起来。用适当的限制酶消化具衔接物的DNA分子和克隆载体分子。(2) 平末端的接头连接法将具有某种限制性酶(BamHI)粘性末端的典型DNA接头分子与平末端的DNA片段连接后，后者变成具有粘性末端的DNA分子。七.热稳定的DNA连接酶来自嗜

5、热高温放线菌热稳定的DNA连接酶的应用：寡核苷酸连接测定法（oligonucleotide ligation assay, OLA）连接酶链式反应（ligation chain reaction, LCR）寡核苷酸连接测定法的作用检测突变寡核苷酸连接测定法的作用：检测突变。1. 寡核苷酸连接测定法（1）原理:两条寡聚核苷酸探针分子，同一种与之互补变性的靶DNA之间的杂交作用,这两条寡聚核苷酸探针分子在靶DNA分子上的位置是彼此相邻的。当他们同靶DNA链是完全碱基配对时，便可以被连接酶连接起来。结合点或靠近结合点处存在和靶DNA错配的碱基两个探针之间不能形成磷酸二脂键。第五节 DNA聚合酶DNA

6、 Polymerase常用的DNA聚合酶：1、大肠杆菌DNA聚合酶2、大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow大片段酶3、T4 DNA聚合酶4、T7 DNA聚合酶5、反转录酶等。一、大肠杆菌DNA聚合酶DNA聚合酶特点活性： 5 3聚合 低 5 3外切 有 3 5外切 低DNA聚合酶的应用放射性探针的标记(1)DNA聚合酶的两种特殊反应：切口转移与链取代(2) 切口转移法制备放射性DNA分子杂交探针二、Klenow片段1、DNA聚合酶的Klenow片段活性： 5 3聚合 低 5 3外切 无！ 3 5外切 低2. Klenow片段的应用末端补平末端标记及随机引物标记cDNA第二链合成（见cDNA文库构

7、建）DNA测序三. T4 DNA聚合酶1. T4 DNA聚合酶特点活性： 5 3聚合 低 5 3外切 无 3 5外切 高！2.T4 DNA聚合酶活性的条件模版、引物、原料dNTP3. T4 DNA 聚合酶的“取代合成”法末端标记四. T7 DNA聚合酶1. T7 DNA聚合酶特点活性： 5 3聚合 高！ 5 3外切 无 3 5外切 高2. T7 DNA聚合酶的应用合成：高活性，几kb，不受DNA二级结构的影响标记：类似T4 （取代合成）末端补平：类似T4第六节核酸修饰酶一. 修饰的 T7 DNA聚合酶活性： 5 3聚合 更高(*3)！ 5 3外切 无 3 5外切 无！修饰的T7 DNA聚合酶的

8、应用：合成能力：更高、更快、更强！标记：重在“掺”与末端补平：二.激酶(kinase) & 磷酸酶(phosphotase)T4 多核苷酸激酶(1)特点来源：T4噬菌体pseT基因编码；活性：5-OH 加磷酸；(2)T4 kinase 5末端标记的机理用酸性磷酸酶处理使其脱磷酸，使5OH基国暴露，同多核苷酸激酶从r-P ATP分子中转移来的r-P基团键合，实现末端标记。(3) T4 多核苷酸激酶的应用a: 5末端标记b: 5末端磷酸化磷酸酶(1)特点来源：细菌碱性磷酸酶（Bacterial Alkaline Phosphotase，BAP)，E.coli；小牛肠碱性磷酸酶（Calf intes

9、tinal Alkaline Phosphotase, CIAP)，小牛肠。活性： 5-P 去磷酸(2) 磷酸酶作用机理催化核酸分子脱掉5P，使DNA分子5P转化成5OH脱磷酸作用。这样产生的5OH末端，为随后在r-PATP和T4多核苷酸激酶的作用下，可以加上放射性的标记。(3) 磷酸酶的应用末端标记前处理防止DNA分子自身环化(4) BAP与CIAP比较热稳定性（65） BAP：active CIAP：30min失活第七节 核酸外切酶 1. 核酸外（Exonucleases）切酶定义:一类从多核苷酸链的一端开始按序催化降解核苷酸的酶。分类：单链的核酸外切酶 双链的核酸外切酶第八节 核酸内切酶

10、1. S1核酸酶(1) 特点：活性：降解单链核酸（DNA或RNA）为单核苷酸；降解双链核酸的单链区(2) S1核酸酶的应用-RNA分子的定位2. Bal31核酸酶Bal31核酸酶的三种活性：（1）单链核酸内切（2）双链核酸外切（3）双链切口对应链Bal31核酸酶主要用途：（1）诱发DNA发生缺失突变（2）定位测定DNA片断中限制性位点的分布（3）研究超盘旋DNA分子的二级结构3. 其他核酸酶外切核酸酶（Exonuclease ）：3至5外切RNA酶(RNase)：切割DNA-RNA杂合链中的RNA其他核酸酶:外切核酸酶（Exonuclease ）：3至5外切DNA酶（DNase ）：随机切割s

11、s & dsDNARNA酶(RNase )：切割DNA-RNA杂合链中的RNA第三章 Techniques基因工程技术Outline1、电泳2、分子杂交3、转化与转染4、核酸测序5、DNA扩增-PCR6、核酸-蛋白相互作用第一节 电泳原理：通过电场的作用使带电的大分子在电泳介质中运动。目的：根据带电分子的分子量、电荷及构型分离不同的分子（依据不同的凝胶体系）。电泳的分类：琼脂糖凝胶电泳（agarose gel electrophoresis），聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）琼脂糖凝胶电泳（agarose gel electr

12、ophoresis）ds-DNA目 的：分离不同长度的DNA片段a.确定DNA片段的长度b.确定DNA的有无与多少c.分析酶切产物凝胶电泳的原理: 略电泳步骤第一步：制胶第二步：样品制备第三步：点样第四步：跑电泳第五步：紫外灯下检测，拍照第六步：数据处理 缓冲体系：TAE, pH 8.0, 50 mM - Tris, Acetate, EDTATBE, pH 8.0, 50 mM - Tris, Borate, EDTA影响迁移率的因素：凝胶的孔径电压DNA片段长度及结构EB的影响分辨率影响因素：琼脂糖浓度缓冲液或样品的盐离子浓度核酸上样量电压聚丙烯酰胺凝胶电泳（poly-acrylamide

13、 gel electrophoresis，PAGE ）范围：短片段 分辨率：1bp类型：变性胶（长度）、非变性胶（长度、构型）变性胶：1、含尿素；2、DNA样品经甲酰胺与热处理；3、电泳保持温度。Agarose与 PAGE的不同：分辨率操作应用：RFLP, AFLP, DD-PCR, sequencing, primer extension, S1 mapping, RNase protection assay第二节 分子杂交一. 分子杂交概述(1) 定义分子杂交（molecularhybridization）：不同来源的核酸单链之间或蛋白质亚基之间由于结构互补而发生的非共价键的结合。根据这一

14、原理发展起来的各种技术统称为分子杂交技术。 (2) 用途形成DNADNA(DNARNA)杂种分子，可以用来a.检测特定生物体之间的亲缘关系。b.揭示核酸片段中某一特定基因的位置。c.对目的基因进行相对定量。d.对特定蛋白质进行定性及定量分析(3) 杂交的基本步骤以核酸分子杂交为例：凝胶电泳分离的DNA/RNA吸印,转膜 (通过毛细管作用或电导作用)探针标记杂交检测(4). 种类Southern: DNA-DNANorthern: DNA-RNAWestern: Pr-Pr二. Southern blotting 1. Southern Blotting(1)目的：检测特定DNA序列。(2)原理

15、：电泳分离DNA，并将之转至尼龙膜上，以标记好的探针（DNA）与之杂交。(3) 步骤 Protocolsa.基因组DNA制备b.DNA酶切消化c.琼脂糖凝胶电泳分离DNA片断d.碱变性，中和 e.转移DNA到固相支持物(如，尼龙膜)f.杂交反应g.放射自显影h.数据分析2. Other DNA analyses（1）斑点杂交 (dot blotting)与狭线杂交 (slot blotting)（2）菌落与噬菌斑杂交(1) Dot blotting, slot blottlng:将样品直接有规律地排列成点阵或线阵，然后进行杂交检测。多用于病原体基因检测，如微生物的基因 。(2) 菌落与噬菌斑杂

16、交（过程略）三. Northern blotting 1. Northern Blotting(1)目的：检测特定序列的RNA的长度与丰度。(2)原理：电泳分离RNA，并将之转至尼龙膜上（blot)，以标记好的探针（DNA）与之杂交。实验过程基本上同Southern Southern blot 和Northern blot区别：1）RNA分子较小，不需进行限制性内切酶切割； 2）在进样前用甲基氧化汞、乙二醛或甲醛使RNA变性，而不用NaOH，因为它会水解RNA的2-羟基基团； 3）在转印后不能用低盐缓冲液洗膜，否则RNA会被洗脱； 4）在胶中不能加EB，因它为影响RNA与硝酸纤维素膜的结合；5

17、）操作均应避免RNase的污染。(2) Ribonuclease protection assay过程：RNA 和探针在液体混合物中杂交.未杂交上的RNA和探针被核酸酶降解，这种核酸酶只识别单链RNA。杂交后的探针和RNA复合体通过琼脂糖凝胶电泳分离。转膜，放射自显影。 RPA有Northern Blot无法比拟的优势：过量的探针与目的基因的杂交在液相环境完成，反应更加完全 。RPA比Northern Blot灵敏15150倍，适合检测各种表达水平之基因 。RPA通量高，同时检测多个基因，可评价他们在同一情况下的差异表达。 一次RPA就能完成10 多次Northern Blot的工作，加快研究

18、速度。 主要缺点：RNA探针的制备麻烦。核酸酶消化时，酶量的控制困难，容易消化过头，X片上什么都没有。(3) Reverse Northern blotting四. Western blotting 1. Western Blotting(1)目的：检测特异性蛋白质有无及表达量。(2)理论依据：抗原-抗体特异性相互作用。(3)原理：电泳分离蛋白质，并将之转至膜上（blot)，以标记好的抗体（antibody）与之杂交。“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗(4)免疫应答:略Western Blot显色的主要方法：a.底物化学发光ECLb.放射自显影c.底物荧光 ECFd.底物DAB（二氨基联苯胺

19、）呈色底物化学发光ECL二抗用HRP标记，反应底物为过氧化物+鲁米诺，底物遇到HRP发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。Western analysis2.分子杂交技术与细胞学的结合(1)原位杂交（in situ hybridization）与荧光原位杂交（Fluorescent in situ hybridization, FISH）原理：标记的探针与在细胞原位的DNA分子杂交，通过显色反应其相应DNA在细胞染色体中的具体位置。(2)免疫组织化学（immunohistochemistry）第三节外源核酸导入细胞的方法一.概述二.大肠杆菌的转化 三.植物的转化一.概述1. 转化/转染（1）转化(

20、Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。 (2)基因转移的目的扩增重组DNA功能表达(3) 转化与转染转染（Transfection)：当细菌的转化过程中吸收的外源DNA是病毒DNA时就应该称此过程为转染。 对于真核生物，转染就是原核生物中转化的同义词，而转化指正常细胞转变为癌下表过程。2.外源基因导入的方法(1) 热休克法（heat-shock)影响热休克法转化效率的因素DNA：构型、纯度、浓度受体菌：R/M体系缺陷型；生理状态及成活率环境：温度、pH、离子浓度(2) 电穿孔法

21、(Electroporation)转化的原理与技术：高压电脉冲作用使细胞膜上出现小孔。电穿孔法影响因素：电压脉冲持续时间细胞类型(3)微弹轰击法(gene-gun)用压缩气体（氦氮）动力，产生一种冷的气体冲击波进入轰击室，将包裹在金属颗粒表面的外源DNA随金属颗粒穿过细胞壁，细胞膜，细胞质等，层层到达细胞核。(4)显微注射(Microinjection)用微吸管吸取供体溶液，在显微镜下准确地插入受体细胞核中的直接转移方法。 (5)脂质体（Lipofectin）由人工合成磷脂类双分子层的脂质体包埋DNA，然后进行脂质体与细胞膜的融合（内吞），将外源DNA导入细胞。(6)反转录病毒具有感染性的病毒

22、颗粒，可以介导目的基因转染到分裂细胞。二.大肠杆菌的转化1. 成功转化的必要条件(1)感受态（competence）： a: 细菌能够获取外源DNA的状态。 b: 特定蛋白与DNA结合形成可以抵御核酸酶的复合物。(2) 复制子（replicon）外源DNA稳定存在。(3) 外源DNA的功能表达。2.感受态大肠杆菌的制备 3. 大肠杆菌的转化-以pGLO质粒为例三. 植物的转化1.应用2.转化的方法3.农杆菌介导的转化1.应用a.提高植物的农业价值和园艺价值b.生物反应器（蛋白/次生代谢产物）c.研究基因在发育、代谢途径中的作用2.转化的方法植物遗传转化技术可分为两大类：一类是直接基因转移技术，

23、包括基因枪法、原生质体法、脂质体法、花粉管通道法、电激转化法、PEG介导转化方法等，其中基因枪转化法是代表。另一类是生物介导的转化方法，主要有农杆菌介导和病毒介导两种转化方法，其中农杆菌介导的转化方法操作简便、成本低、转化率高，广泛应用于双子叶植物的遗传转化。3. 农杆菌介导的转化(一)农杆菌的Ti质粒与T-DNA的整合机制酚类-（启动）-Ti质料上的Vir基因-（表达）-Vir基因产物-（切断）-质料上的T-DNA单链；切下来的单链T-DNA与操纵子基因产物形成复合物，转化植物根部细胞。T-DNA上有三套基因，其中两套基因分别控制合成植物生长素与分裂素，促使植物创伤组织无限制地生长与分裂，形

24、成冠瘿瘤。第三套基因合成冠瘿碱，是农杆菌生长必需的物质。（二）Ti质粒转化植物细胞的战略为利用农杆菌的Ti质粒，发展了共整合系统和双元载体系统，避免了在大的Ti质粒上进行分子重组操作的困难。共整合系统原理:部分T-DNA片段克隆在大肠杆菌质粒上，含有E.coli的选择标记和植物选择标记Kmr(卡那霉素抗性)。在E.coli中, 将外源基因和带有部分T-DNA片断的质粒重组，筛选重组子；将重组质粒转化到农杆菌中，质粒与Ti质粒上的同源序列发生同源重组，将外源基因整合到Ti质粒上，侵染植物细胞。 植物细胞转化的双元系统主要包括两个部分：卸甲Ti质粒，由于缺失了T-DNA 区域，丧失了致瘤作用，主要

25、是提供Vir基因功能，激活处于反式位置上的T-DNA的转移。微型Ti质粒(Mini-Ti plasmid)，它在TDNA左右边界序列之间提供植株选择标记如NPTII基因以及大肠杆菌选择标记Lac Z基因等。双元载体系统的构建的原理：是Ti质粒上的Vir基因可以反式激活TDNA 的转移。穿梭质粒定义：一类人工构建的具有两种不同复制起点和选择标记，可以在两种不同类群中存在复制。第四节 基因扩增技术-PCR PCR的定义 PCR技术的发明PCR的原理PCR的反应体系和方法PCR的类型和应用1. PCR的定义PCR技术是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,为最常用的分子生物学技术之一。2. PCR的

26、发明Mullis由此获得1993年诺贝尔化学奖。3. PCR技术的原理在微量离心管中,加入适量的缓冲液, 微量的模板DNA,四种脱氧单核苷酸,耐热性多聚酶,一对合成的DNA引物。通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环。每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍。 4. PCR技术的特点高度的灵敏性特异性操作简便易行用途广泛5. 引物设计长度结构（避免内部形成二级结构&有互补序列）GC含量6. PCR反应的条件及过程(1) 具备的条件 总体积 25-100 ml Buffer 缓冲液 dNTP 原料 Primer 引物 DNA分子 模

27、板 Taq酶 DNA聚合酶(2) 反应过程变性：退火：延伸： (3) PCR产物检测7. 影响 PCR的因素（）Taq DNA polymerase（）模板的浓度（）dNTP（）Mg2+浓度（）变性的时间（）退火的温度与时间（）延伸的温度与时间8. PCR技术的分类传统PCR只扩增两个引物质之间的已知序列（）反向PCR 把线性DNA模板转变成环形分子。 选择一个在已知序列中没有，而其两侧都存在的限制性内切酶位点。用相应的限制性内切酶酶解后，将酶切的片段在连接酶的作用下环化，使得已知序列位于环状分子上。根据已知序列的两端序列设计两个引物，以环状分子为模板进行PCR，就可以扩增出已知序列两侧的未知

28、序列。（）反转录PCR（RT-PCR) 以RNA为模板, 经逆转录获得与RNA互补的DNA链(即cDNA)，然后以cDNA链为模板进行的PCR反应。（）梯度 PCR (gradient PCR )（）实时荧光定量PCRCt值：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。Ct值与起始模板每个模板的Ct值与其起始拷贝数的对数是线性关系;SYBR荧光染料内嵌染料(Sybr-Greenl)： Sybr-Greenl，能与双链DNA特异结合，而不与单链DNA结合。未与双链DNA结合时荧光信号强度较低，而当SG与双链DNA结合，荧光信号强度极大的增强。TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对

29、引物的同时加入一个特异性的荧光探针；探针两端分别标记报告荧光基团和淬灭荧光基团；第五节 DNA测序与合成一. DNA测序目的： 基因组序列测定 检查基因多态性 确定新克隆的 DNAs序列 证实需要确认的突变Sanger测序法Sanger1977年发明, 1980年Nobel Prize化学奖1. 原理（1）在PCR反应中，以DNA一条链为模板，按碱基互补配对的原则，复制链在引物3端以5-3方向延伸。（2）底物是 2-脱氧dNTP和一定量2, 3 双脱氧ddNTP(脱氧核糖的3位置缺少一个羟基)。（3）2，3双脱氧ddNTP会使复制反应终止。（4）链延伸将与偶然发生但却十分特异的链终止竞争，使产物是一系列的核苷酸链。（5）在4组独立酶反应中分别采用4种不同的ddNTP，结果将产生4组寡核苷酸，它们将分别终止于模板链的A、C、G或T位置。2. 过程a. 引物进行放射性标记。b. 四种合成反应分别在不同的管中进行，依次分别加入ddGTP，ddATP, ddCTP, ddTTP。c. 在第一个管中，DNA分子的合成过程中会有G掺入，每一个模板C点对应的位点都有几率插入ddGTP， 只要插入ddGTP， DNA分子延伸就会停止，而且这一反应是随机发生的。因此就会形成一系列末端是d