PCR的退火温度选择.docx

1、PCR的退火温度选择熔解温度( Tm)是引物的一个重要参数。这是当 的引物和互补序列表现为双链 A分 子时的温度.Tm对于设定PCR退火温度是必需的。在理想状态下，退火温度足够低，以保证 引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从 到7 。退火温度一般设定比引物的 Tm低 。设定 Tm有几种公式。有的是来源 于高盐溶液中的杂交，适用于小于 18碱基的引物。有的 是根据 GC含量估算 Tm。确定引物 m最可信的方法是近邻分析法。这种方法从序列一级结构 和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。大部分计算 机程序使用近邻分析法。 根据所使用的公式及引物序列的不同，Tm

2、会差异很大。因为大部分公式提供一个估算的 m 值，所有退火温度只是一个起始点。可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异 性。开始低于估算的 ，以 2为增量，逐步提高退 火温度。较高的退火 温度会减少引 物二聚体和非特异性产物的形成。为获得最佳结果，两个引物应具有近似的 Tm值。引物对的 m差异如果超过 ，就会引物 在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。如果两个引 物 Tm不同，将退火温 度设定为比最低的 Tm低或者为了提高特异性，可以在根据 较高 Tm设计的退火温度先进行 个循环，然后在根据 较 低 Tm设计的退火温度进行剩余的循环。这使得在较 为严紧的条件下可以获得目的模

3、板的部 分拷贝。当引物长度低于20个bp可以根据Tm=3GC+2AT对,于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为：Na+ + 0.41 (%GC) 600/size公式中， Size = 引物长度。退火温度取 决于引物长 度及序列， GC含量越 高退火温度 越高，引物的 值 减去 5-8 度即是 引物 的退火温 度，引物的 值一般都会 在引物合成 单上体现，如果没有的 话可以在网 上搜 个引物 退 火温度计 算器输入序 列 就可以了 。退火时间一 般 都是 秒 。试试下载一 个 o6.0 ，这个软件挺 不错的，在计算出来 的 退火温度 基 础上上下 幅 度一点 是没有什么 问 题的2.6 更专业 软

4、件很小很 方 便 更能还挺强 大我们刚做了 PCR实验，当引物长度 小于 2 p时，退火温度通 过（Tm-5）计算， Tm=4（G+C）+2（ A+T）增加 的特异性：n这是最重要 的一步。理想的，只同目的序 列两侧的单 一序列而非 其 他序列退 火的引物要 符合下面 的 一些条件a. 足够长 ,18-24bp, 以保证特异 性. 当然不是说 越长越好 , 太长的引物 同样会降低 特异性, 并且降 低产 量b. GC% 40%60% c. 5 端和中间序 列 要多 , 以增加稳定 性d. 避免 3端 GC rich, 最后 3个 ASE不要有GC,或者最后 个有3个不要是 GCe. 避免 3

5、端的互补 , 否则容易造 成 R f. 避免 3 端的错配 g. 避免内部 形成 二级结构h.附加序列 nce）加到 5 端, 在算 Tm值时不算, 但在检测互 补和二级结 构 是要加上 它们i.使用兼并引 物时, 要参考密码 子使用表 ,注意生物的 偏好性,不要在 3 端使用兼并 引物,并使 用 较高的引物 浓 度 （1uM-3uM）j.最好学会使 用 一种n et al.* 引物的另一 个重要参数 是熔解温度 （Tm）。这是当 的引物和互 补序列表现 为双链 A 分 子时的温度.Tm对于设定PCR退火温度是必 需的。在理想状态 下，退火温度足 够低，以保证引物 同 目的序列 有效退火， 同

6、时还要足 够高，以减少非特 异 性结合。合理的退火 温度从 到 7 。 退火温度一 般 设定比引 物 的 Tm低 。设定 Tm有几种公式。有的是来源 于高盐溶液 中的杂交，适用于小于 18碱基的 引物。有的是根据 GC含量估 算 Tm。确定引物 m最可信的 方法是近邻 分 析法。这种方法从 序列一级 结构 和 相邻碱基的 特性预测引 物的杂交稳 定性。大部分计算 机程序使用 近邻分析法 。 根据所使用 的公式及引 物序列的不 同，Tm会差异 很 大。因为大部分 公式提供一 个估算的 m值， 所有退火温 度只是一个 起始点。可以通过分 析几个逐步 提 高退火温 度的反应以 提高特异性 。 开始

7、低于估 算的 ，以 2为增量， 逐步提高退 火温度。 较高的退火 温度会减少 引 物二聚体 和非特异性 产 物的形成 。为获得最佳 结 果，两个引物应 具 有近似的 Tm值。引物对的 m差异如果 超过 ， 就会引物在 循环中使用 较低的退火 温度而表现 出明显的错 误起始。如果两个引 物 Tm不同 ，将退火温度 设定为 比最 低 的 Tm低 或者为了提 高特异性，可以在根据 较高 Tm设计的退火温 度先进行 个循环，然后在根据 较 低 Tm 设计 的退火温 度进行剩余 的循环。这使得在较 为严紧的条 件下可以获 得目的模板 的 部分拷贝 。2 rs定制引物的 标准纯度对 于大多数 CR 应用是

8、 足够的。引物产量受 合 成化学的 效 率及纯化 方 法的影响 。 定制引物以 干 粉形式运 输 。最好在 重溶引物， 使其最终浓 度为 M。TE比去离 子水好，因为水的 H经常偏酸 ，会引起寡核 苷 的水解。 引 物的稳定 性依赖于储 存条件。应将干粉和 溶解的引物 储存在-2 。以大于 M浓度溶于 TE的 引物在 -2 可以稳定保 存6个月，但在室温（ 到 ）仅能保存不 到 1周。干粉引物可 以 在-2 保存至少 年 ，在室温（ 到 ）最多可以保 存 2 个月。i onsiom ionsMg离子的作用主要是 dNTP-Mg 与核酸骨架 相互作用 并能影响 rase 的活性，一般的情 况下

9、Mg的浓度在0.5-5mM之间调整，同样要记住 的是在调整了 s的浓度后要相应的调 整Mg 离子的浓度，对实时定量 PCR，使用 3到 mM带有荧 光探针的镁 离子溶液b. 其他的离子NH4+ K+都会影响 CR，增加 K+的浓度后 , 会因为中和 了核酸骨架 上磷酸基团 的 负电荷而 影响退 火的温度,从而降低了 PCR的 严谨性 ） ，NH4+也有相同的 作用. MBI公司的 TAQ酶就提供了两 种 ER, 一种是加 g的一种是 已经混合了 （ NH4）2SO4的，当然 , 过高的阳离 子浓度 （KCL0.2M）时, DNA在 4度根本不 会发生变性, 当然也就无 从谈起 R了.不同公司的

10、 酶效有所不 同, 需要 自己掌握适 合 的酶的浓 度，一些高保真 没的效率要 远远 低于 ,所以可能需 要的酶的量 也要大一些 . 另外, 一般的 情况下 , 变性的rase 的活性温度可以使用 092度, 变性的时间也可以缩短 , 从而保证ateMgDNA 0.1ug-1ugaDNA 0.5ng-5ngi d DNA 0.1ng-10ngreon常规是 度 5分钟, GC Rich 的摸板是 度 5分钟除了 GC Rich 外, 常规的 可以将这部分时间缩短到 1到 2分钟, 或者在 CLE 1时给予较长的时间 ,而取消开始的 i onl ing重点到了：一般情况下 , 是从 55度开始.

11、根据情况配合以Mg离子浓度进行调整. 有条件的可以 做 g pcr. 退火的时间在 30-60S, 时间短一些可以得到更好的效果 . 因 为 在 l ing temp. 时也会有一些活性 . 所以在 A.T. 的时间过长 , 会极 大的增加非特异性扩增的风险，另外,在对于一些困难户, 比如从 NA里扩增大片段, 还可使 用 wo step PCR.down PCR原理很简单 , 但的确是一个很有用的方法。举个例子，LING TEMP. 55度94 5min72 2es 9430s59 30s72 2722es94 30s722 es 94 30s 5030s72 2 l es 72 5minP

12、CR热启动 R是除了好的引物设计之外，提高 特异性最重要的方法之一。尽管 DNA 聚合酶的最佳延伸温度在 72，聚合酶在室温仍然有活性。因此，在进行 R反应配制过程中，以及在热循环刚开始，保温温度低于退火温度时会产生非特异性的产物。这些非特异性产物一旦形 成，就会被有效扩增。在用于引物设计的位点因为遗传元件的定位而受限时，如 - t ed 突变、表达克隆或用于 工程的遗传元件的构建和操作，热启动 R尤为有效。限制 DNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制 CR反应液，并将其置于预热的 R仪。这种方法 简单便宜，但并不能完成抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特异性产物的扩增。热启动通过抑制一种基本

13、成分延迟 DNA合成，直到 仪达到变性温度。包括延缓加入 Taq DNA聚合 酶，在反应体系达到 90 度时， ，将温度保持在 70 度以上，手工加入r ase，但这个方法 过于烦琐， 尤其是对高通量应用，并容易造成 污染。其他的热启动 方法使用 蜡防护层将 一种基本 成分， 入镁离子或 酶，包裹起来， 或者将反应 成分，如模板和缓 冲因蜡熔化而 把各种成分 释 放出来并 混合在一起 。有很多公司 提液，物理地隔离 开 。在热循环时 ， 供这样的 酶。)ga).象手动热启 动 方法一样 ， 蜡防护层法 比 较烦琐，易于污染，不适用于于 高 通量应用 。还有一种方 法是使用 被抗体抑制 失 活，

14、当变性温度 超过 70度时，抗体也变性 了，这样 se又被激 活了。7 er PCR我们知道 i c DNA 大约在 10 5 幂个模板 分 子 , 这样的模板 分子数目可 以 是引物与 模板很好的 结合. 当模板的浓 度过低,比如低于 00个分子时, 引物和模板 之间就很 难发生反应. 引物容易自 身进行反应形成二聚体 .这样就有来 了个 er PCR 我一直找不 到合适的词 来 翻译这个 er.具体是这样 的. 开始几个 保持 mer 的低浓度, 保证 ate 的 在10 7 10 8. 以确保开始 扩增的准确 性.然后 r 的浓度到正常的水平8. 循环数和长 度确定循环数 的基本原理 是

15、: 产物能够保 证你进一步 分析操作的 最小循环数 . 因为过多的 循环 数容易造 成 RS和非特异性产物的积累 产物的量不 够, 优化的方法 有:1. 增加2. 增加循环数如何确定循 环 数 , 有一个方法 .做一个 R体系,40 循环,50ul, 分别在 2 , 25,30,35 循环时 从体系中取 5ul, 一起跑电泳 分 析. 从而确定最 佳 的循环数另一个会影 响 PCR特异 性的是 ng时在两 个温度间变 化的速率 ng rate). 当然是越高 越好.不过咱们大 部分条件有 限,就那么几台 PCR仪,也没有多少 挑选的余地rPCR仪的因素我们经 常容易忽视.长时间的使 用后需要调

16、 整PCR仪,以保证其能 够到达正确 的温度 . 现在的 R仪基本上 都有自检功 能 - osis).i ves附加物或者 说 ncer 实在 是多种多 样. 基本上包括 几类 , 能够增加反 应退火效率 的化学因子 , DNA结合蛋白和一些 商业试剂. 基本的原理 不外是增加 引物退火特 异性,减少错配, 增加产物的长度和产量 .在GC Rich 情况中 i ve可以造成配对碱基间的的不稳定,从而提高扩增的效率.而在另一种情况下 i ve由于造成错配的 - ate 复合物的极大的不稳定, 而提高了扩增的忠实性.要注意的是 ,没有万能的 cer 全部通用,需要你根据自己的情况 ,最好结合ntp

17、cr 选择最优条件 .x ide(DMSO) up to10%mideat 5%200.1-2.5%l (PEG)60005-15%r ol10-15%i ns2i n 1nMi n 5uM7-)with50uM dGTP)-n)要注意的是 ROL等会抑制 se的活性 ,所以需要 ng出最适的浓度提取 时的试剂会抑制 反应的顺利进行. 因此需要对S(0.01%) 的情况下就能强烈抑制 PCR的进行. 可以加入一些2 d PCR简单点说 设计两对引物, 一对是长的 , 一对是包含在长引物内的, 用长引物扩增的产 物作为第二次扩增的模板,这样可以增加产物的量 . 而且可以减少非特异性带和错配的情况

18、.增加 的保真性 高保真酶高温 是以单链 NA或 A为模板，在 和一些阳离子的存在情况下，在特定的引物指导下按 3-5 方向合成 NA.包括 3种类型a.5-3 方向的 A合成能力 ,没有 3-5 方向的外切酶特性.如Taq及其突变体.这类酶的 合成能力强,因为他不纠 正合成中出 现的突变b.与a类似,有合成活性 ,没有 3-5的外切活 性.但他们能以 RNA为模板,合成 . 如c.有DNA聚合活性,没有逆转录 活性,但有 3-5 方向的外 切酶活性.如. 可以提高忠 实性。但是这些聚 合 酶的产量 比 Taq DNA聚合 酶低。酶的混合物将Taq DNA聚合酶同带有 到5外切核酸酶 活性第二

19、种聚合酶混合 在一起可以 获得比单 独Taq DNA聚合 酶高的忠实 性，并可以得到 高 产量及扩 增长模板。其他因素除了酶，高浓度的 NTP或镁离子会降低 忠实性。将 的浓度从 200M降低到 25-50 M可以 增加精确 度如果四种 核苷的浓度 不同，忠实性会受 影响。进行较少的 PCR循环 也会有助于 增 加忠实性 ，因为增加循 环 数目和产 物 长度就会 增 加突变可 能性。1简介寡聚核苷酸 引物的选择 ，通常是整个 扩增反应成 功 的关键。所选的引物 序列将决定 PCR产 物的 大小、位置、以及扩增区 域的 Tm值这个和扩增 物产量有关 的重要物理 参数。好的引物设 计可 以避免 背

20、景和非特 异产物的产 生，甚至在 A-PCR中也 能识别 NA或基因 组模板。引物设计也 极 大的影响 扩增产量：若使用设计 粗糙的引物 ，产物将很少 甚至没有；而使用正确 设 计的引物 得到 的产物 量可接近于 反应指数期 的产量理论 值 。当然，即使有了好 的引物，依然需要进 行 反应条件 的 优化，比如调整 g2+浓度，使用特殊的 共溶剂如二 甲 基亚砜、甲酰胺和甘 油。计算机辅助 引物设计比 人工设计或 随机选取更 有效。一些影响 CR反应中引物作用的 因素 诸如溶 解温度、引物间可能 的同源性等 ，易于在计算 机软件中被 编 码和限定 。计算机的高 速度可 完成对引物位置、长度以及适

21、 应用户特殊 条件的其他 有关引物的变换可能性的大量计算 。通过对 成千种组合的检测，调整各项参 数，可提出适合 用户特殊实验的引物。因此通过计 算机软件选择 的引物的 总体“质量”（由用户在程 序参数中设 定）保证优于通 过 人工导出 的引物。需要指出的 是，引物不必与 模 板完全同 源，因此可包含 启动子序列 、限制酶识别 位点或 端的各种修 饰，这种对引物 的 修饰不会 妨 碍 反应，而会在以后 使用扩增子 时发挥作用 。2基本 引 物设计参 数引物设计的 目的是在两 个目标间取 得 平衡：扩增特异性 和扩增效率 。特异性是指 发生错误 引发的频率。特异性不好 或劣等的引 物会产生额 外

22、无关和不 想要的 R扩增子， 在 EB染色的琼脂 糖凝胶上可见到；引物效率是 指在每一 CR循环中一对引物扩增的产物与 理论上成倍 增长量的接 近程度。1引物长度；特异性一般 通过引物长 度和退火温 度控制。如果 的退火温度 设 置在近于 引物 Tm值( 引物/ 模板双链体 的解链温度 )几度的范围 内，18 到 2 个碱基的寡 核苷酸链是 有很好的序 列特异性 的。 引物越长，扩增退火时 被引发的模 板越少。为优化 R反应，使用确保溶 解温度不低 于 的最短的引 物，可获得最好 的 效率和特 异 性。总的来说，最好在特异 性允许的范 围 内寻求安 全 性。每增加一个 核苷酸，引物特异性 提

23、高 4 倍；这样，大多数应用 的最短引物 长度为 个核苷酸。引物设计时 使合成的寡 核 苷酸链( 18 24 聚物)适用于多种 实验条件仍 不失为明智 之 举。2引物的二级 结 构包括引物自 身二聚体、发卡结构、引物间二聚 体 等。这些因素会 影响引物和 模板的结合 从 而影响引 物效率。对于引物的 末端形成的 二聚体，应控制其 G大于- / mol或少于三个连续 的碱基互补 ，因为此种情 形 的引物二 聚体有进一 步形成更稳 定结构的可 能性，引物中间 或 端的要求可 适当放宽。 引物自身形 成的发卡结 构，也以 端或近 端对引物 - 模板结合影 响更大；影响发卡结 构的稳定性 的 因素除了

24、 碱基互补配 对的键能之 外，与茎环结构 形式亦有很 大 的关系。应尽量避免 末端有发卡 结构的引物 。3引物 GC含 量和 Tm值PCR引物应该保持合 理的GC含量。含有50的G+C的20个碱基的寡核 苷酸链的 m值大概 在56 2 范围内，这可为有效 退火提供足 够热度。一对引物的 GC含量和Tm值应该 协调。协调性 差的 引物对的效 率和特异性 都较差，因为降低了 Tm值导致 特异性的丧 失。这种情况下 引物 Tm值越 高，其错误引发 的机率也越大。若采用太高 的退火温度 ，Tm值低的引物对可能 完全不发挥作用。 在从一批在 特定序列范 围内已合成 好的寡核苷 酸中选择一 对新的引物 时

25、，这种 GC含量 和 Tm值 的 协调非常 关键。一般来说， 一对引物的 Tm值相差 尽量不超过 23 摄氏度， 同时引物和 产物的 值 也不要相 差太大，20摄氏度范围内较好 。4引物的额外 序 列与退火 温度若有额外的 序列信息要 加到引物中 ，例如 7 NA聚合酶 结合位点、限制酶切位 点或者 发 夹结构可 以使用加长 的 引物。一般说来，引物 端添加无关 序 列不会影 响 引物特异 序 列的退火 。 有时候，引物中添加 了大量与模 板不配对的 碱基，可以在较低 退火温度的 条件下进行 4到 5个扩增 循环； 然后在假定 引物 端序列已经 加入到模板 中，计算得出的 退火温度下 进行其余

26、的 循环。在引物上添 加限制酶位 点 时一个重 要的考虑是 大多数限制 酶的有效切 割要求在它 们的识 别序列的 端有 2至 个非特异的额外碱基，这样就会增 加引物的非 模板特异序 列的长度。长引 物序列 的另一个缺 点是影响溶 解温度的精 确 计算，而这对于确 定 PCR反应时的退火 温度又是必 须 的。对于低于 20个碱基的 引物， Tm值可以 根据Tm=4(G+C)+2(A+T)计算。而对于较长 的引物， Tm 值需要 考虑动力学 参数、从“最近邻位”的计算方式 得到，现有的 R引物设计 软 件大多数 都采 用这种 方 式。5引物的 末端核苷酸 组 成引物 末端和模板 的碱基完全 配对对

27、于获 得 好的结果 是非常重要 的，而引物 末端最 后 到 6 个核苷 酸的错配应 尽可能的少 。如果 末端的错配 过 多，通过降低反 应 的退火温 度来补 偿这种错配不会有什么效果，反应几乎注 定要失败。引物 末端的另一 个问题是防 止 一对引物 内的同源性 。应特别注意 引物不能互 补，尤其 是在 末端。引物间的互 补将导致不 想要的引物 双链体的出 现，这样获得的 PCR产物 其实是引物 自身的扩增 。这将会在引 物双链体产 物和天然模 板之间产生 竞 争 状态，从而影响扩 增成功。引物 末端的稳定 性 由引物 末端的碱基 组 成决定，一般考虑末 端 5 个碱基 的 G。此 值的大小 对

28、扩增有较 大 的影响，负值大，则 末端稳定性 高 ，扩增效率更 高 ，同时也更易 于 异 位引发 。需要注意的 是，引物 末端应尽量 避免 T。实验证明，以 T 结尾的 引物即使与 T, G或 C 错配 仍可有效延 伸 。6产物 的长度及在 耙 序列内的 位置所有的计算 机程序都提 供对 产物长度范 围的选择。一般说来，PCR产物长度对扩增效率有影响 。 特定的应用 情况下， PCR产物 长度部分取 决于模板材 料。预期产物的 特定长度经 常取决于应 用的需要。若目的是建 立测定特异 DNA片段 的临床检验 方法， 120 的小 扩增产物可 能是最好的 。产物应具有 好的特异性 和 高的产生

29、效率，并含有能用于 探针捕捉 杂交实验的 足够信息。这一长度范 围的产物可 以通过采用 两步扩增循 环方法得到 ， 从而减少扩 增 时间。其他 方法有不同 的最佳产物 长度。例如，通过定量的 RNA-PCR检测 基因表达时 ，产物应 该足 够大以便构 成竞争性模 板，这样，产物和竞争 物都能够在 凝胶上很容 易的分辨出 来。这些产 物一般在 2 7 范围内。7补充说明若在 A 序列内找 寻 PCR引物 ，需特别注意 两点：首先， 尽力将引物 和产物保持 在 的编码区域 内，因为这是生 成蛋白质的 独特序列，不像 末端非编码 区 域与许多 其他 A 有同 源性；第二，尽力把引物 放在不同的 外显

30、子上，以便使 A特异的 CR产物与 从污染 A中产生 的产 物在大小 上 相区别。若 PCR的目的是克隆 一个基因或 cDNA的特 异序列，产物的大小 是根据具体 应 用预选的 。在这 里，计算机程序 可 以提供关 于期望区域 侧翼选择引 物对的信息 。在选择用来 扩增来自不 同物种 A 的引物时 ，应避开 NA的 和 末端非翻译 区序列， 因为它们可 能 没有任何 的 同源性。3简并引物设 计1设计简并引 物时，一定要检查 靶扩增区域 选定氨基酸 遗 传密码的 简并度。很显然，我们期望选 择 简并度最 低的氨基酸 ， 达到提高特 异 性的目的 。2充分注意物 种对于密码 子的偏好性 ，选择该

31、物种 使用频率高 的密码子， 以降低引物 的简并性。3应努力避免 末端的简并 ， 对于大多数 氨 基酸残基 来 说，意味着引物 末端不要位 于 密码子 的第 三位。4在一些多义 位置使用脱 氧次黄嘌呤 （dI ）代替简并碱 基。4 测序引物设 计当然，测序引物的 设计一般都 由测序公司 来完成，如果需要自 己设计的话 ； 那么除了按 照 上面所提 到的引物设 计通用标准 外 ，还需要注意 两 点：1测序引物的 特异性的标 准掌握应该 更严格一些 ， 也就是说设 计时更优先 考虑特异性 。因为在测 序反 应中，如果引物与 模板在非预 期位置退火 并引发链延 伸，会对结果对 来很大的干 扰甚至造成 结 果无法识 读。2测序引物的 Tm值适当 高 一些。现在大部分 测序反应均 选用耐热的 测序级 A聚合酶来 催化，并 采用 R 的热循环 程序。选用的测序 引物的 值 稍高一些 ，有助于使反 应 顺利跨过 待 测模板的 二 级结构区 ，也有助于降 低 非特异反 应 。5 探针的设计探针的设计 ，根据不同的 用途