临床实验室中的质谱分析和质谱仪.docx

1、临床实验室中的质谱分析和质谱仪临床实验室中的质谱分析和质谱仪然后在真空的作用子下迫使离子进入分析器，这类离子源有电喷雾（Electro-spray， ESI）、大气压中化学电离（Atmospheric pressure chemical ionization，APCI）等。在固相离子源中，被分析物处于不挥发的沉积状态，这种沉积状态可由各种制备方法产生，其制备过程经常会涉及引入一种固体或非挥发性液体做为基质，被分析化合物的沉积随后经高能粒子或光子照射使沉积物表面的离子释放出来并在电场的作用下进入分析器，这类离子源有基质辅助激光解析（Matrix-assisted laser desorption

2、）、等离子体解析(Plasma desorption)离子源等。质量分析器 质量分析器可由不同的原理发展而成。大致而言它们可以分为两类，一类是以时间的尺度将不同质荷比的离子进行分离，例如四级杆质谱；另一类则是以空间的尺度将不同质荷比的离子进行分离，例如离子阱质谱。当然分类也可以用质量分析器的其他性质，比如脉冲式的或是连续式的等等。随着仪器的发展，也出现许多将不同的质量分析器联用的组合，例如四级杆-飞行时间（Quadrupole-TOF）等。当评价一台质谱仪的性能，一般会考虑到以下这些因素：可分析的质量区间、分析速度、传送能力（进入分析器与到达检测器离子的比例）、质量准确度和分辨度。表一列出了某

3、些常用质量分析器的基本特征。 两个或数个质量分析器可被串联起来使用，使得在前级质量分析器中的选定碎片在后一级质谱中得到进一步分析，这样的质谱被称为串联质谱（MS/MS或MSn）。也可以将色谱（气相或液相）连接在离子源的前端做为样品的输入装置，使得色谱的分离能力与质谱的分离鉴定能力得到叠加，被称为色质联用（GC-MS或LC-MS）,联用的质谱部分自然也可以是串联质谱。目前临床实验室中最常用的质谱就是液相色谱与串联质谱联用（LC-MS/MS）。检测器和电脑 检测器的作用在于使通过质量分析器的离子产生电信号（电流），此电流的强度与其丰度成比例。对离子的测定无非总是根据其电荷、质量或是速率。由于在每个

4、特定时间点上由质量分析器中出来的离子有限，其所形成的电流也十分有限，因此其后部都连有放大电路。检测器与质谱的其他部件一样仍处于不断发展之中以应对新的需求，例如测定质量很大的离子。 电脑在质谱分析中的基本作用与许多分析仪器基本相同，主要有三个功能：控制仪器、获取和加工分析资料集对数据进行解读，从而最后向用户输出一份分析结果的报告。这其中涉及到模数信号的转换、分析过程中的取样频率与分析质量的关系，用户也应该对所用数据库的特点有所了解，以便对电脑给出的分析结果有正确的解读。三、质谱在临床实验室中的主要应用（1）治疗药物浓度检测（TDM） 同样的药物用在不同病人身上效果往往是有差异的，这里面有遗传的因

5、素也有环境的影响，其主要的表现则为代谢上的差异。对病人用药后血药浓度的检测将大大提高用药的合理性并避免或减少副作用的出现。图二显示了血药浓度检测的基本概念。 图中的曲线显示了连续用药后血药浓度的变化：每次用药后血药浓度在较快的上升至最大浓度后逐渐下降，至一定的水平后给予第二次用药。合理的用药应该注意到两点：一是血药浓度的最高水平不得超越药物的毒性水平；二是后继用药必需在不低于该药物的最低有效水平前给予。具有下列特点的药物最应该进行血药浓度监测：毒性大而且毒性水平与有效浓度之间区间窄的药物；个体间药代动力学差异大的药物；需长期使用的药物。或是还有一条：价格昂贵的药物。 用于器官移植等病情的免疫抑

6、制剂是符合上述需要进行血药浓度监测的一个很好的例子。上世纪八十年代出现的环孢霉素（Cyclosporine）大大提高了器官移植的成功率并明显延长了接受器官移植者的生命。环孢霉素在化学结构上是一种亲脂性的多肽，溶解性差也不易吸收，其有效的血浓度范围很窄，每位病人对环孢霉素的吸收能力差异性很大，形成剂量高会造成对肾脏的毒性，剂量低则不能抑制排斥的出现，检测和控制血药浓度是必要的治疗手段。继环孢霉素之后又研发出一些有效的免疫抑制剂，如他克莫司（Tacrolimus，FK506）、西罗莫司（Sirolimus）、依维莫司（Everolimus）等，用药时也都有进行血药浓度检测的需求。 以针对某种药物的

7、抗体为基础发展起来的血药浓度检测曾是广为使用的检测技术，但近年来发展成功的液相色谱-串联质谱已经越来越成为主流的检测手段。主要的原因是：质谱可以准确地针对原药分子，而不像免疫测定难以避免的会与原药的某些代谢产物出现交叉反应；质谱法可以同时检测到多种药物的血药水平（如数种免疫抑制剂，图三）；快速简便。 表二列出除免疫抑制剂以外，其他值得用LC-MS/MS进行治疗药物浓度检测的一些例子。(2)与疾病相关体液成分的检测 体液各种成分的种类和含量与人体的健康水平密切相关，也往往反映疾病的是否存在或是病情轻重的指标。了解体液特定成分的含量或全面扫描体液中的各种成分来反映机体的健康状况是多年来医学检验界努

8、力追求的目标。质谱分析可同时检测多种靶标及其快速、准确的特点使它必然成为一种有极大潜力的医学检验技术。 质谱目前在这一领域最为广泛使用的是对新生儿遗传代谢病的筛选。新生儿遗传代谢病是指一组包含多种涉及到多种氨基酸代谢、脂肪酸代谢及有机酸代谢的隐性遗传病，由父母双方遗传给后代，遗传缺陷的所在位置分别是各种代谢环节中的催化剂-酶。其中发病率比较最高的是苯丙酮尿症（根据德国、美国、卡塔尔、日本共70多万例的筛选结果，苯丙酮尿症的发病率约为7.8/十万人，另据一份报告对中国调查的结果是大约为18000个新生儿中出现一例）。苯丙酮尿症发病的原因是由于在12号染色体长臂上编码苯丙氨酸羟化酶的基因（PAH）

9、出现畸变，导致苯丙氨酸羟化酶的功能下降，使苯丙氨酸难以代谢成酪氨酸。这将一方面使苯丙氨酸聚集造成神经系统等方面的毒性，另一方面又由于酪氨酸的缺乏使其形成神经介质及色素等方面的功能被削弱。尽早的治疗（主要是饮食控制）有可能恢复病儿的正常成长，丧失治疗时机则不免形成终身残障。图四显示了苯丙酮羟化酶的催化作用，这一催化作用的受损将是苯丙酮尿症的起因。 除了苯丙酮尿症外，还有几十种有遗传代谢病，例如在中国人中发病较多的甲基丙二酸血症等等。这些疾病虽然在发病机制中涉及的酶各不相同，但有一些共同的特点：（1）发病的早期症状类同；（2）如发病早期得不到及时的治疗，转归会十分凶险，例如发生神经系统发育障碍或生

10、命夭折；（3）大部分疾病如能得到早期诊断和治疗，会有明显的治疗效果。LC-MS/MS由于具有快速对多个靶标（约60个）同时进行检测的能力，是目前最为有效的对这组疾病的筛选检测方法。 根据美国临床实验室标准协会（CLSI）2012年发布的有关用串联质谱进行新生儿筛查的指南（ISSN 0273-3099）建议检测的疾病列于表三。 除了上述的测定外，LC-MS/MS在测定25-羟基维生素D、雌激素、睾丸激素、肌酸、溶酶体酶活力分析等方面有较为广泛地应用，这方面应用的扩展肯定会不断持续。（3）电感耦合等离子体质谱测定微量元素 电感耦合等离子体质谱的质谱部分其实与其他质谱技术是相似的，常用的有四级杆质谱

11、，其特点在于等离子体离子源，这种离子源与LC/MS或GC/MS所用的低能离子源是十分不同的。等离子体离子源有极高的温度使得任何分子结构都被破坏，因此测定的对象只有元素的离子。这项技术始发于上世纪八十年代，最早的商业化的电感耦合等离子体质谱仪出现在1983年。电感耦合等离子体质谱可以测定元素周期表中的大多数元素，灵敏度介于1ppt上下。电感耦合等离子体质谱在多个领域中都有重要的应用，也包括在生物医药中的应用。目前已有一些医院装备了电感耦合等离子体质谱，用于有害金属离子（如铅、汞）及各种微量元素的测定及治疗药物监测（如对含铂的抗肿瘤药）等方面。（4）病原微生物检测 病原微生物的检定是医学诊断中一个

12、历史悠久的项目，对正确诊断的确立和有效治疗的执行有重要的作用。多种技术途径都对微生物的检定做出贡献，形态学观察、代谢途径检测、基因组分析等都在不同的历史时期中进入这一领域，也仍然在不同条件下持续发挥着作用。从上世纪九十年代开始，利用MALDI-TOF质谱通过对微生物蛋白质指纹谱的分析来检定微生物开始进入人们的视野，并在近年有制造商推出了商业化的专用仪器。 这是一项需由质谱分析与生物信息分析及资料库紧密联系的应用项目，由于它在医学诊断与治疗、环境控制、甚至防卫措施等方面的前景，近年来产生了大量的研究报告，前景是值得期待的。但也由于培养基和培养条件、离子源中的介质、样品的制备方法等因素都会对指纹产

13、生影响，更多有关稳定重演性等方面的研究仍在积累。四结语与前景 本文介绍了质谱的基本原理及在临床实验室中应用的概况，涉及的内容较多地偏重于LC-MS/MS，因为LC-MS/MS目前在临床实验室中已经较为普及，并存在进一步发展的广阔前景。GC-MS是最早应用于临床实验室的质谱技术，目前在新生儿代谢病的诊断等方面也仍在应用，但基于GC对分析样品的局限性，其进一步扩展的余地自然会有所限制。 个性化医疗是现代医学发展的一个趋势，对特定靶标分子的检测是其中重要的内容。质谱可以同时对多个靶标分子的快速准确测定是这项技术的一个固有的优势。除了对多种药物、体液组成中小分子的测定会继续扩展外，对多种蛋白质（多肽）

14、分子测定方法也会日益成熟，用抗体对靶标分子的测定已使用多年，质谱的多重反应监测技术（Multiple reaction monitoring, MRM）由于能同时准确地检测多个靶分子，在临床实验室中会有很大的发展空间。 质谱在临床实验室中更广泛地应用，还取决于仪器的发展和人员的培训。在过去的十年中，仪器的性能已经有了很大的突破，这种趋势肯定会持续，同时也会出现更加友善的操作界面。由于认识到质谱分析将大大提高医学检验的服务内容和准确程度，医学检验界的资深科学家与有识之士纷纷大力推动质谱在这一领域的普及，一支有能力的队伍正在形成。 可以预期，在未来5-10年内，质谱在临床化学中肯定还会有长足的发展

15、。主要参考文献： 1.Clinical Application of Mass Spectrometry (Edited by U. Garg and C. A. Hammett-Stabler), Humana Press, 20102.de Hoffmann E. and V. Stroobant “Mass Spectrometry, Principle and Applications” (Third Edition), Wiley, 2007 3.Clinical and Laboratory Standard Institute Document I/LA32-A, 2012 4.

16、Adaway J.E. and Keevil B.C., “Therapeutic Drug Monitoring and LC-MS/MS”, J. Chromatography B, 883-884: 33-49, 2012 5.Giebel R. et al., “Microbial Fingerprinting using MALDI-TOF Mass Spectrometry: Applications and Challenges”, Adv. In Applied Microbiology, 71: 149-184, 2010 6.Gillett M. A. and Carr S. A., “Quantitative Analysis of Peptides and Proteins in Biomedicine by Targeted Mass Spectrometry”, Nature Methods, 10: 28-34 2013