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1、菠萝凋萎相关病毒实时荧光定量RTPCR检测方法的建立园 艺 学 报 2014，41（6）：12571266 http: / www. ahs. ac. cn Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao 收稿日期：20140127；修回日期：20140327 基金项目：公益性行业（农业）科研专项经费项目（201203021）；海南省重大科技项目（ZDZX2013020-3）；海南省科学事业费项目（琼财预2013131号）；海南省重点科技计划应用研究及产业化项目（ZDXM20130031） * 通信作者 Author for corresponde

2、nce（E-mail：hefanhn） 菠萝凋萎相关病毒2实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立 胡加谊1,2，罗志文2，范鸿雁2，李向宏2，刘志昕3，何 凡2,* （1海南大学环境与植物保护学院，海口 570228；2海南省农业科学院热带果树研究所，农业部海口热带果树科学观测实验站，海口 571100；3中国热带农业科学院热带生物技术研究所，海口 571101） 摘 要：菠萝凋萎相关病毒（Pineapple mealybug wilt associated virus-2，PMWaV-2）是引起的菠萝凋萎病（Mealybug wilt of pineapple，MWP）的重要病原。本研究中根

3、据PMWaV-2外壳蛋白基因序列设计特异性引物和探针，建立基于TaqMan探针的实时荧光定量RT-PCR检测方法。该方法能高灵敏检测出阳性样品，对阴性样品及空白对照均无荧光反应；灵敏度比普通PCR高100倍；重复性试验表明批内和批间变异系数均在1.85%以内，表明本方法是一种操作简便、特异性强、灵敏度高、重复性较好的PMWaV-2定量检测方法。 关键词：菠萝；菠萝凋萎病毒2（PMWaV-2）；TaqMan探针；实时荧光定量RT-PCR；检测 中图分类号：S 668.3；S 432 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2014）06-1257-10 Development of a R

4、eal-time Fluorescent Quantitative RT-PCR Method for the Detection of Pineapple mealybug wilt associated virus-2 HU Jia-yi1,2，LUO Zhi-wen2，FAN Hong-yan2，LI Xiang-hong2，LIU Zhi-xin3，and HE Fan2,* （1 College of Environment and Plant Protection，Hainan University，Haikou 570228，China；2 Institute of Tropic

5、al Fruit Trees，Hainan Academy of Agricultural Sciences/Haikou Investigation Station of Tropical Fruit Trees，Ministry of Agriculture，Haikou 571100，China；3Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，Haikou 571101，China） Abstract：Pineapple mealyb

6、ug wilt associated virus-2（PMWaV-2）is an important pathogen that causes Mealybug wilt of pineapple（MWP）. This study established a real-time quantitative RT-PCR method with TaqMan probe based on specific primers of conserved nucleotide sequence of PMWaV-2 coat protein gene. The results showed that th

7、e method is highly sensitive to positive sample，but has no fluorescence signal to health sample and water control. The sensitivity of real-time quantitative RT-PCR is about 100 times higher than regular PCR. Three-time repeats revealed that the coefficients of variation between the intra- and inter-

8、assay were both within 1.85%，indicating a simple，specificity，high sensitivity，and reliable reproducibility detection method to PMWaV-2. Key words：pineapple；PMWaV-2；TaqMan probe；real-time quantitative RT-PCR；detction 1258 园 艺 学 报 41卷 菠萝凋萎病（Mealybug wilt of pineapple wilt，MWP）是世界各菠萝主产区的重要病害之一，对经济栽培造成严

9、重影响（Carter，1934，1942，1945）。菠萝凋萎病的发生被认为是菠萝凋萎病毒（Pineapple mealybug wilt associated virus）和粉蚧共同危害的结果，全世界已报道了5种菠萝凋萎病毒，即PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3、PMWaV-4和PMWaV-5（Gambley et al.，2008）和两种传毒粉蚧，即菠萝洁白粉蚧（Dysmicoccus brevipes）和新菠萝灰粉蚧（D. neobrevipes）。目前，在中国已见报道的菠萝凋萎病毒有PMWaV-1、PMWaV-2和PMWaV-3（吴丽亭 等，2009，2010；李运合 等，

10、2010）。夏威夷大学的学者经研究首次提出PMWaV-2为菠萝凋萎病的重要病原之一（Sether et al.，1998，Sether & Hu，2002）。国内有学者报道，PMWaV-2和菠萝粉蚧共同作用是引起菠萝凋萎病的最重要原因，其发病率可高达60%，可造成25% 30%的经济损失（龚标勋，2002）。病毒病的防治目前还没有疗效明显的药剂，对发病植株做到提前检测和及早诊断，及时作出病害防治措施，对减少田间损失就显得尤为重要。目前用于菠萝凋萎病毒的检测方法主要有免疫电镜检测（Gunasinghe & German，1989）、酶联免疫吸附（Hu et al.，1996）、组织免疫印记（Hu

11、 et al.，1997）和反转录聚合酶链反应（Reverse transcription-polymerse chain reaction，RT-PCR）（Walkman et al.，1995；Sether et al.，2001，2005）等技术，但这些方法都存在较大的限制因素，诸如免疫电镜成本太高，血清学方法病毒粒子提纯困难，组织免疫印迹容易出现假阳性，RT-PCR的后期处理易交叉污染等。实时荧光定量PCR技术（Real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，FQ PCR）是1996年由美国Applied Bio

12、systems公司研发的一种在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该方法具有可定量、高特异性、高敏感性、高通量等优点，非常适合于植株体内病毒的定量检测（徐小刚和刘雅婷，2009），目前国际上尚无应用重组质粒作为标准品构建标准曲线达到对PMWaV-2定量检测的报道，国内也无关于PMWaV-2实时荧光定量RT-PCR检测的报道。鉴于菠萝凋萎病对中国菠萝产业造成较大的损失，急需建立一种高灵敏度的检测方法。20132014年作者根据PMWaV-2外壳蛋白（coat protein，CP）基因的保守序列设计引物和TaqMan

13、探针，通过制备重组质粒标准品构建标准曲线，建立起一套基于TaqMan探针PMWaV-2的实时荧光定量RT-PCR检测体系。 1 材料与方法 1.1 材料 本试验于20132014年在海南省海口市中国热带农业科学院热带生物技术研究所进行。菠萝植株样品及PMWaV-2阳性样品均为海南省农业科学院热带果树研究所提供。RNA提取试剂盒为Bioteke公司的多糖多酚植物总RNA提取试剂盒；反转录酶为TransGen公司的Transscriptfiret-strand cDNA synthesis supermix；Trans5 Cell购自TransGen公司；pMD18-T载体、Taq DNA聚合酶、

14、DNA Marker DL2000、Real Master Mix（Prob）均购自TaKaRa公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒与质粒提取试剂盒均购自AXYGEN公司；TaKaRa TP600 PCR仪；Stratagene公司的MX3005荧光PCR仪；美国Thermo公司NanoDrop ND-2000C微量紫外分光光度计。 1.2 引物和探针的设计合成 根据NCBI报道的PMWaV-2外壳蛋白基因（HE983618、EU769116、JN995534、JX645775、JN995535、JN995533、DQ225114）的保守序列设计特异性TaqMan探针和引物（表1），探针5标记荧光基团F

15、AM，3标记淬灭基团TAMRA，预计扩增片段大小168 bp。 6期 胡加谊等：菠萝凋萎相关病毒2实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立 1259 表1 PMWaV-2实时荧光定量RT-PCR引物和探针 Table 1 The primers and probe designed for real-time fluorescent quantitative RT-PCR of PMWaV-2 引物名称 Primer 引物探针序列（53） Sequence 退火温度/ Annealing temperature PMWaV-2-F CGTGAGTGAGGTGGTTGAG 59 PMWaV-2-R

16、 GCAAAGAACTGCTTGGGT 55 Probe FAM-TGGCTCATCACGGAGTACCCAAGC-TAMRA 66 1.3 菠萝总RNA提取和RT-PCR 称取0.1 g的菠萝叶片基部白色组织，用Bioteke公司的多糖多酚植物总RNA快速提取试剂盒（离心柱型）提取菠萝叶片总RNA，取5 L RNA于1.5%琼脂糖凝胶电泳检测；用ND-2000C紫外分光光度计测定其浓度，并将叶片总RNA置80 冰箱中备用。 以提取的菠萝叶片总RNA为模板，按康为世纪有限公司TransScript Reverse Transcriptase说明书反转录合成第一链cDNA。20 L反转录体系为P

17、rimer Mix 2 L、2.5 mmol L-1 dNTP Mix 4 L、RNase-free H2O 3.5 L、5 RT Buffer 4 L、Ribonuclease Inhibitor 0.5 L、Super RT 1 L和RNA模板5 L。混合溶液于42 水浴1 h，85 孵育5 min结束反应。 以反转录合成的cDNA为模板进行PCR扩增，20 L扩增体系包括Taq（5 U L-1）0.2 L，10 PCR buffer（含Mg2+）2 L，dNTP Mixture（2.5 mmol L-1）1 L，PMWaV-2-F（10 mol L-1）0.5 L，PMWaV-2-R（1

18、0 mol L-1）0.5 L，cDNA 1 L和ddH2O 14.8 L。PCR反应条件为：94 预变性3 min；94 30 s，55 30 s，72 20 s，循环35次；72 10 min，4 停止。PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，拍照并比对序列。 1.4 质粒标准品的制备 以总RNA反转录合成的第一链cDNA为模板，以特异性引物PMWaV-2-F/PMWaV-2-R扩增获得其特异性目的片段，将获得的目的片段克隆到pMD18-T载体上，转化大肠杆菌感受态，挑取阳性克隆于LB液体培养基中，37 200 r min-1振荡培养6 h以上。提取质粒，经菌液PCR、测序确定目标序列。

19、核酸蛋白测定仪测定阳性质粒的浓度，并按照公式C = A/B 6.02 1014（其中C为copies L-1，A为以OD260分析得到的浓度ng L-1，B为质粒DNA分子量）计算质粒浓度拷贝数，20 保存作为标准品备用。 1.5 探针适用性验证 以菠萝凋萎病显症叶片总RNA反转录合成的第一链cDNA为模板，质粒DNA为阳性模板，健康菠萝叶片总RNA反转录合成的cDNA为阴性对照，水为空白对照进行实时荧光定量PCR反应，即25 L反应体系包括Premix Ex Taq（probe qPCR）（2）12.5 L，PMWaV-2-F（10 mol L-1）0.5 L，PMWaV-2-R（10 mo

20、l L-1）0.5 L，ROX reference Dye（50）0.5 L，Probe（10 mol L-1）1 L，模板1 L，ddH2O 9 L。反应程序为：95 预变性3 min；95 变性30 s，55 退火30 s，72 延伸20 s，40个循环。 1.6 标准曲线的建立 以10倍梯度稀释的质粒标准品为模板，取终浓度为6.16 108 6.16 103 copies L-1的6个质粒样品，按1.5中的实时荧光定量反应体系在Mx3005荧光定量PCR仪上检测，得出各自的荧光扩增曲线，仪器软件自动生成标准曲线。 1260 园 艺 学 报 41卷 图 1 RT-PCR检测PMWaV-2

21、M：Marker DL2000；1：CP基因片段扩增； 2：CP基因片段重复扩增；CK-：阴性对照。 Fig. 1 Detection of PMWaV-2 by RT-PCR M：Marker DL2000；1：Fragment of CP gene amplification； 2：Fragment of CP gene repeat amplification； CK-：Negative control. 1.7 特异性试验 以含PMWaV-2 CP基因目的片段的重组质粒为阳性模板，分别对含有PMWaV-1和PMWaV-3等病毒的cDNA模板进行实时荧光定量RT-PCR扩增，同时设置阴性

22、对照。 1.8 灵敏度试验 将质粒标准品按10倍梯度稀释，取终浓度为6.16 6.16 109 copies L-1等10个浓度的质粒标准品作为模板，按1.5中的实时荧光定量反应体系在Mx3005荧光定量PCR仪上检测，得出荧光定量PCR所能检出的最低模板拷贝数。同时按照1.3中PCR反应体系进行普通PCR的灵敏度测试实验，与所建立的荧光定量PCR的灵敏度进行比较。 1.9 重复性试验 将质粒标准品按10倍梯度稀释，取6.16 102 6.16 106 copies L-1等5个稀释浓度的样品为模板进行实时荧光定量PCR反应。将以上不同浓度的质粒DNA模板每天进行1次实时荧光定量PCR反应，连

23、续3 d即3次重复，考察不同试验的批次差异性。根据获得的Ct值计算平均Ct值、标准差和变异系数。 1.10 田间样品检测 应用已建立的方法对采自田间的11份菠萝样品进行实时荧光定量RT-PCR检测。 2 结果与分析 2.1 菠萝叶片总RNA提取与RT-PCR检测结果 健康和染病菠萝叶片中提取的总RNA经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，18S和28S RNA条带清晰可见，无弥散，经紫外分光光度计测定，其OD260/OD280比值为2.05，符合下一步试验要求。 以反转录生成的第一链cDNA为模板扩增PMWaV-2 CP基因目的片段，所设计的引物在常规PCR体系和程序下能够清晰、敏捷地扩增出与预测片段

24、大小一致的片段（图1），经测序分析及Blast比对，确定所获得的序列为PMWaV-2 CP基因目的片段。 2.2 探针适用性检测 以含有PMWaV-2目的片段的重组质粒为阳性模板，经实时荧光定量RT-PCR检测，可观察到明显荧光信号强度的增长，而健康（阴性）对照和空白对照荧光吸收值均没有变化（图2），表明所设计的引物和探针适用于PMWaV-2的实时荧光定量RT-PCR检测。 6期 胡加谊等：菠萝凋萎相关病毒2实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立 1261 图 2 实时荧光定量RT-PCR探针适用性试验 Fig. 2 Probe applicability of real-time fluor

25、escent quantitative RT-PCR for PMWaV-2 2.3 标准曲线的建立 以10倍梯度稀释的阳性质粒为标准模板进行PMWaV-2实时荧光定量RT-PCR反应。其扩增曲线随着阳性质粒模板浓度的稀释倍数增大，Ct值呈现递增趋势如图3所示，在6.16 108 6.16 103 copies L-1浓度范围内，标准品浓度与Ct值之间具有良好的线性关系，曲线斜率为3.267，决定系数R2 = 0.997，直线方程为Y =3.267log（X）+ 43.33，扩增效率为102.3%，由此建立的标准曲线可以用于PMWaV-2的检测。 图 3 PMWaV-2实时荧光定量RT-PCR

26、标准品动力曲线图 Fig. 3 Strand curve of real-time fluorescent quantitative RT-PCR for PMWaV-2 2.4 实时荧光定量RT-PCR检测的特异性 用本试验所建立实时荧光定量RT-PCR检测体系，分别以PMWaV-2 CP片段的重组质粒和含PMWaV-1、PMWaV-3等病毒的cDNA样品为模板进行实时荧光定量RT-PCR扩增。结果如图4，除了含PMWaV-2目的片段的阳性质粒出现良好的特异性扩增曲线，PMWaV-1、PMWaV-3和阴性对照检测结果均无荧光吸收值的变化，表明本试验所建立的实时荧光定量RT-PCR检测方法能够

27、特异性地检测PMWaV-2。 2.5 实时荧光定量RT-PCR检测的灵敏度 普通RT-PCR的最低检出限测为6.16 103 copies L-1（图5），实时荧光定量RT-PCR最低检出为61.6 copies L-1（图6），表明实时荧光定量RT-PCR检测灵敏度为普通RT-PCR的100倍。 1262 园 艺 学 报 41卷 图 4 PMWaV-2实时荧光定量RT-PCR特异性试验结果 Fig.4 The specificity of RT-qPCR for PMWaV-2 图 5 PMWaV-2普通RT-PCR检测灵敏度 Fig. 5 General RT-PCR for PMWaV-

28、2 M：Marker 2000；1：6.16 1010 copies L-1；2：6.16 109 copies L-1；3：6.16 108 copies L-1；4：6.16 107 copies L-1； 5：6.16 106 copies L-1；6：6.16 105 copies L-1；7：6.16 104 copies L-1；8：6.16 103 copies L-1； 9：6.16 102 copies L-1；10：6.16 101 copies L-1；CK-：Negative control. 2.6 重复性 通过对6.16 102 6.16 106 copies L-

29、1稀释梯度的质粒DNA实时荧光定量RT-PCR的扩增曲线（图7）和进行统计学分析（表2），发现同一批次试验各梯度的变异系数均小于1.25%，表明该方法具有较好组内的重复性。而批次间重复性试验结果表明，各梯度批间差异系数均小于1.85%，表明该方法的批间重复性较好，可以用于菠萝叶片PMWaV-2的定量检测。 表2 重复性试验统计结果 Table 2 Intral-assay and inter-assay reproducibility of real-time fluorescent quantitative RT-PCR for PMWaV-2 组内重复Reproducibility of

30、intral-assay 组间重复Reproducibility of inter-assay 质粒拷贝数/（copies L-1） Plasmid concentration Ct SD CV/% Ct SD CV/% 6.16 106 20.46 0.093 0.45 20.59 0.094 0.46 6.16 105 24.17 0.297 1.23 24.38 0.446 1.83 6.16 104 27.11 0.183 0.68 27.34 0.361 1.32 6.16 103 31.09 0.148 0.48 31.26 0.321 1.03 6.16 102 33.63 0.279 0.83 33.45 0.494 1.48 6期 胡加谊等：菠萝凋萎相关病毒2实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立 1263 图 6 PMWaV-2单重实时荧光定量RT-PCR的灵敏度 Fig. 6 The sensibility of single RT-qPCR for PMWaV-2 图 7 实时荧光定量RT-PCR扩增曲线重复性 Fig. 7 The reproducibility test of real-time fluorescent quantitative RT-PC