实验六细菌地生化试验.docx

1、实验六细菌地生化试验实验六 细菌的生化试验目的要求1通过本试验加深对细菌生化反应原理和意义的理解；2掌握常规细菌生化试验操作方法。操作步骤一、糖类发酵（分解）试验原理：细菌含有分解不同糖（醇、苷）类的酶，因而分解各种糖（醇、苷）类的能力也不一样。有些细菌分解某些糖（醇、苷）产酸（符号：+）、产气（符号：），培养基由兰变黄（指示剂溴麝香草酚兰由兰遇酸变黄的结果），并有气泡；有些产酸，仅培养基变黄；有些不分解糖类（符号：），培养基仍为兰色。（一）适用于需氧菌的方法培养基 用邓亨氏（Dunham）蛋白胨水溶液（蛋白胨1g，氯化钠0.5g，水100ml，pH7.6按0.51的比例分别加入各种糖），每1

2、00ml加入1.2ml的0.2溴麝香草酚蓝（或用1.6溴甲酚紫酒精溶液0.1ml）作指示剂。分装于试管（每一个试管事先都加有一枚倒立的小发酵管），10磅高压灭菌10分钟。如在培养基中加入琼脂达0.50.7，则成半固体，可省去倒立的小发酵管。0.2溴麝香草酚蓝溶液配法：溴麝香草酚蓝 0.2g 0.1N NaOH 5ml蒸馏水 95ml方法：从琼脂斜面的纯培养物上，用接种环取少量被检细菌接种于糖发酵管培养基中（如为半固体，应穿刺），在37培养，一般观察23天，观察时用上述符号标记之。（二）适用于厌氧菌的方法培养基：蛋白胨 20g 氯化钠 5g琼脂 1g 1.6溴甲酚紫酒精溶液 1ml 糖 10g硫

3、乙醇酸钠 1g蒸馏水 1000ml将胨、盐、硫乙醇酸钠、琼脂和水放于烧瓶，加热使融化，再加入所需的糖，调整pH到7.0，加入指示剂，分装试管，在10磅高压灭菌15分钟后，做成高层。方法 将厌氧菌的培养物用穿刺接种法接种于上述培养基的深部，于37培养。结果观察同需氧菌。二、VP试验（二乙酰试验）原理：某些细菌能从葡萄糖丙酮酸乙酰甲基甲醇（Acetymethyl carbinol）2，3-丁烯二醇（2，3-bytaylene cylycol），在有碱存在时氧化成二乙酰，后者和胨中的胍基化合物起作用，产生粉红色的化合物。其反应式为：2CH3COCOOHCH3COCHOHCH3十2CO2丙酮酸 乙酰甲

4、基甲醇CH3CHOHCHOHCH3 CH3COCOCH32，3-丁烯二醇 丁二酮（二乙酰） 培养基：含葡萄糖、K2HPO4、蛋白胨各5g，完全溶解于1000ml水中后，分装试管，间歇灭菌或10磅10分钟灭菌。方法：1OMearas法试剂：40g氢氧化钾溶于100ml蒸馏水中，加入0.3g肌酐即成。将被检细菌接种于葡萄糖蛋白胨水培养后，于3537培养48小时，于每毫升培养物中加入0.1ml，猛烈摇振混合。2Baritts法试剂：6-奈酚酒精溶液为甲液，40氢氧化钾为乙液。同上法接种培养细菌，于2ml培养液加入甲液1ml和乙液0.4毫升，摇振混合。试验时强阳性者约于5分钟后，可产生粉红色反应（长时

5、间无反应，置室温过夜），次日不变者为阴性。三、甲基红（MR）试验原理：某些细菌在糖代过程中生成丙酮酸，有的甚至进一步被分解为甲酸、乙酸、乳酸等，而不是生成VP试验中的二乙酰，从而使培养基的pH下降至4.5或以下（VP试验的培养物pH常在4.5以上），故加入甲基红试剂呈红色。本试验常与VP试验一起使用，因为前者呈阳性的细菌，后者通常为阴性。培养基：同VP试验培养基。甲基红指示剂：0.1g甲基红溶于300ml95酒精中，再加入蒸馏水200ml。方法：接种细菌于培养液中， 37培养27天后，于培养物中加入几滴试剂，变红色者为阳性反应。四、淀粉水解试验原理：细菌如产生淀粉酶可将淀粉分解为糖类，在培养基

6、上滴加碘液，可在菌落周围出现透明区。淀粉琼脂培养基： pH7.6的肉浸汤琼脂 90ml无菌羊血清（只对不易生长的细菌才加） 5ml无菌3淀粉溶液 10ml将琼脂加热融化，冷却到45，加入淀粉溶液及羊血清，混匀后，倾注平板。方法：将细菌划线接种于上述平板上，在37培养24小时。生长后取出，在菌落处滴加革兰氏碘液少许，观察。结果：培养基呈深蓝色，能水解淀粉的细菌及其菌落周围有透明的环。五、枸橼酸盐利用试验原理：当细菌利用铵盐作为唯一氮源，并利用枸橼酸盐作为唯一碳源时，可在枸橼酸盐培养基上生长，生成碳酸钠，并同时利用铵盐生成氢，使培养基呈碱性。方法1：Simmons氏培养基：柠檬酸钠 lg K2HP

7、O4 lg 硫酸镁 0.2g 氯化钠 5g琼脂（洗过） 20gNH4H2PO4 1g1溴麝香草酚蓝酒精溶液 10ml蒸馏水 加至1，000ml调整pH至6.8，15磅15分钟高压灭菌后制成斜面。将上述培养基中的琼脂省去，制成液体培养基，同样可以应用。将被检细菌少量接种到培养基中， 37培养24日，培养基变蓝色者为阳性，不变者为阴性。方法2：Christenten氏培养基：柠檬酸钠 5g KH2PO4 1g 葡萄糖 0.2g 氯化钠 5g 酚红 0.012g半胱氨酸 0.1g琼脂 15g酵母浸膏 0.5g蒸馏水加至 1000ml有的配方尚加柠檬酸铁铵0.4g，硫代硫酸钠0.08g。PH不必调整。

8、高压灭菌后做成短厚的斜面。接种时先划线后穿刺，孵育于37观察七天。阳性者培养基变红色，阴性者培养基仍为黄色。六、吲哚试验原理：细菌分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚（靛基质），经与试剂中的对位二甲基氨基苯甲醛作用，生成玫瑰吲哚。培养基：邓亨氏蛋白胨溶液同（一）试剂：常用下述两种。1欧立希氏（Ebrlichs）吲哚试剂对位二甲基氨基苯甲醛（P-dimethyl aminobenzaldehyde） 1g纯乙醇 95ml 浓盐酸 20ml先以乙醇溶解试剂，后加盐酸，要避光保存。2Kovacs试剂对位二甲基氨基苯甲醛 5g 戊醇（聚异戊醇） 75g浓盐酸 25ml方法：以接种环接种待试细菌的新鲜斜面培养

9、物于邓亨氏蛋白胨溶液中， 37培养2448小时后（可延长45天）。于培养液中加入戊醇或二甲苯23ml，摇匀，静置片刻后，沿试管壁加入试剂2毫升。在戊醇或二甲苯下面的液体变红色者为阳性反应。也可将一指头大的脱脂棉，滴上两滴欧立希氏试剂，再在同处加滴两滴高硫酸钾（K2S2O4）饱和水溶液，置于含培养液的被检试管中，离液面约半寸，置烧杯水浴煮沸为止，脱脂棉上出现红色为阳性。此法略繁，但省试剂且准确，因为将试剂加到液体中，吲哚和粪臭素均呈阳性，而用此法，只是吲哚（它能挥发）呈阳性反应。亦可以滤纸片浸湿1%的二甲基苯丙烯甲醛的10浓HCl溶液，然后以接种环刮取一环琼脂的纯培养物涂布于该滤纸上。细菌涂印周

10、围呈蓝色者为阳性，细菌涂印周围无色泽变化或淡黄色者为阴性。厌氧菌用蛋白胨水蛋白胨 20g 葡萄糖 10g 硫乙醇酸钠 1g Na2HPO4（无水） 2g琼脂 1g蒸馏水 1000ml加热溶解，调整pH至7.47.6，过滤，分装小试管，15磅高压15分钟。七、硫化氢试验原理：有些细菌能分解含硫氨基酸，产生硫化氢（H2S），H2S会使培养基中的醋酸铅或氯化铁形成黑色的硫化铅或硫化铁。方法1：醋酸铅琼脂法培养基：肉汤琼脂 100ml 10硫代硫酸钠溶液（新配） 2.5ml10醋酸铅溶液 3ml三种成份分别高压灭菌，前二者混合后待凉至60，加入醋酸铅溶液，混合均匀，无菌分装试管达56cm高，立即浸入冷

11、水中，使冷凝成琼脂高层。方法：用接种针蘸取纯培养物，沿管壁作穿刺，孵育于37 12天后观察，必要时可延长57天。培养基变黑色者为阳性。或将细菌培养于肉汤、肝浸汤琼脂斜面或血清葡萄糖琼脂斜面，在试管的棉花塞下方挂一约6.50.6cm2的浸蘸饱和醋酸铅溶液（10g醋酸铅溶于50毫升沸蒸馏水中即成）且已干燥的滤纸条，于37培养，观察7天，纸条变黑者为阳性结果。方法2：三氯化铁明胶培养基法培养基：硫胨（Thiopeptone） 25g 明胶 120g牛肉膏 7.5g 氯化钠 5g蒸馏水加至 1000ml上述成份灭菌后趁热加入5ml灭菌的10氯化铁溶液。立即以无菌操作分装试管，达56cm高，迅速冷凝成高

12、层。方法：穿刺接种，培养于37观察7天，培养基变黑色者为阳性。八、硝酸盐还原试验原理：有的细菌能把硝酸盐还原为亚硝酸盐，而亚硝酸盐能和对氨基苯磺酸作用生成对重氮基苯磺酸，且对重氮基苯磺酸与-萘胺作用能生成红色的化合物N-萘胺偶氮苯磺酸，其反应式为：对氨基苯磺酸 对重氮基苯磺酸（一）适用于需氧菌的方法培养基：硝酸钾（不含NO2-） 0.2g蛋白胨 5g蒸馏水 1000ml溶解，调节pH至7.4，分装试管。每管约5毫升，15磅高压灭菌15分钟。试剂：甲液 对位氨基苯磺酸 0.8g5N醋酸溶液 100ml乙液 萘胺 0.5g5N醋酸溶液 100ml方法：接种细菌后37培养4天，沿管壁加入甲液二滴与乙

13、液二滴，当时观察。阳性者立刻呈红色。（二）厌氧菌硝酸盐培养基法培养基：硝酸钾（不含NO2-，化学纯） 1g磷酸氢二钠 2g 葡萄糖 1g 琼脂 1g蛋白胨 20g蒸馏水 1000ml加热溶解，调整pH至7.2，过滤，分装试管，15磅高压灭菌15分钟。方法：接种后作厌氧培养，试验方法和结果观察同上法，但培养12日即可。九、石蕊牛乳试验原理：紫乳培养基中的主要成分为干酪素、乳糖及指示剂等。由于各种细菌对这些成分的作用不同，引起培养基的变化也有不同，观察的主要变化为：产酸：主要从乳糖产生酸，指示剂变酸色（石蕊为红色，溴甲酚紫为黄色）。酸凝或加有产气：产酸，并有牛乳的凝固（pH4.7以下）；如有气体形

14、成，则凝块中有裂隙，在氏梭菌则呈“暴烈发酵”。凝乳酶产生：很少或无酸产生，牛乳凝固。胨化：部分或大部分牛奶变清亮。产碱：细菌产生蛋白酶可将干酪素分解产生胺或氨，使培养基的pH进一步升高，呈深紫色。培养基：加石蕊的酒精饱和溶液于新鲜脱脂牛奶中，使达浅紫色，分装于小试管，用流动蒸汽灭菌，每天1次，每次1小时，共3天。接种细菌后，培养及观察一周。石蕊酒精溶液的制备：8g石蕊在30ml40乙醇中研磨，吸出上清液，再如此用乙醇操作两次。加40乙醇到总量为100ml，并煮沸1分钟。取用上清液，必要时可加几滴1N盐酸使达艳紫色。现在多应用溴甲酚紫代替石蕊，即于100ml脱脂乳中加入1.2ml的1.6溴甲酚紫

15、的乙醇溶液。方法：将细菌接种于紫乳培养基中，37培养17天后观察结果，根据细菌的种类不同，可呈现上述一种或几种现象。十、凝固血清液化试验原理：有些细菌产生胞外酶，可使凝固的血清液化，借此鉴别细菌。吕氏血清培养基：1葡萄糖肉汤（pH7.6）100毫升，无菌羊（牛、猪）血清300ml，混合后，分装于无菌试管，每管约57ml，在血清凝固器摆成斜面，间歇灭菌。第一天，80 l小时，于37过夜；第二天，851小时，于37过夜；第三天，901小时，于37过夜。弃去有污染的管。方法与结果：将纯培养物在斜面上作划线接种，于37培养1周，观察培养基有无液化。十一、肉渣消化试验原理：有些细菌能够产生蛋白酶，消化肉

16、渣。熟肉基：即于pH7.47.6的牛肉汤中，于分装试管前，加入半指高的肉渣。液面上加少量凡士林或液体石蜡，15磅高压灭菌30分钟。方法：用无菌毛细玻管或接种环接种细菌后，用蜡笔于培养基的肉渣层上缘划一横线作标记，在37培养几天，观察管肉渣的高度有无变化，即可判定肉渣是否已被部分消化。十二、明胶液化试验原理：有些细菌能产生分泌于细胞外的明胶酶，分解明胶为氨基酸，使半固体的明胶培养基成为液体。培养基：明胶培养基（见附录 培养基27）方法1、明胶琼脂平板法可于普通琼脂加入1明胶倾注平板后，分为四个区，每个区分别划线接种一种被检菌，经2448小时培养后，于培养基表面注入氯化汞溶液（氯化汞12g，蒸馏水

17、80ml，浓盐酸16ml），如细菌液化明胶，则在菌落周围出现透明带。方法2、将被检菌穿刺接种于明胶培养基，于20培养7天，逐日观察明胶液化现象。如室温高，培养基自行溶化时，可与冰箱放置30分钟，然后取出观察结果，不再凝固时为阳性。十三、尿素酶试验原理：某些细菌能产生尿素酶。尿素酶可分解尿素，产生大量的氨，使培养基的pH值升高，反应式为： ONH2-C-NH2+2H2O（NH4）2CO32NH3+CO2+H2O培养基：应用Christenrsen氏培养基蛋白胨 1g 葡萄糖 1g氯化钠 5g KH2PO4 2g 0.2酚红溶液 6ml 琼脂 20g蒸馏水加至 1000ml调整pH至6.9。需生长

18、因子的细菌，可加入酵母浸膏0.1。121高压灭菌15分钟，冷却到55时加入十分之一的20尿素液（经滤过法除菌）使尿素含量为2（即每1000ml中有20g），制成短斜面。接种细菌时，同时作划线及穿刺，置37培养24小时后观察，培养基从黄色变红色时为阳性。接种量多，反应快的细菌，数小时即可使培养基变红。阴性者应继续观察4天。可以省去琼脂，将各物（包括20g尿素）溶解后，过滤除菌，无菌分装，培养2日，无菌者应用。十四、触酶试验原理：触酶又称过氧化氢酶，能将过氧化氢分解为水和氧气：2H2O22H2O+O2培养基：细菌应培养在不含血液的营养琼脂上，因为红血球含有接触酶。方法：将约1 ml3的H2O2倾注

19、于生长物（菌落或菌苔）上，有气泡（O2）发生者为阳性。亦可于清洁小试管中加入少量的H2O2（30），再用清洁无菌的细玻捧（或火焰封口的毛细玻管或镍铬丝做成的接种环）蘸细菌少许，插入于H2O2液面下，有气泡产生者为阳性。不可用铂环取细菌，因为铂有时可使H2O2产生气泡。Daniel，YC法：将细菌在平皿上划线，培养于3724小时。另取一支毛细玻璃管（外径1mm，长67mm左右），将其一端浸于3的H2O2液中，使H2O2上升到毛细玻管，高度约达20mm。将这一支带有H2O2的毛细管下端，轻轻接触菌落，毛细管立即出现“沸腾”者为强阳性，观察时间以10秒钟为限。十五、氧化酶试验（Kovac试验）原理：

20、氧化酶及细胞色素氧化酶。做氧化酶试验时，此酶并不直接与氧化酶试剂起反应，而是首先使细胞色素C氧化，然后此氧化型细胞色素C再使对苯二胺氧化，产生颜色反应。氧化酶2还原型细胞色素C+2H+O22氧化型细胞色素C十H2O试剂，1%盐酸四甲基苯二胺水溶液，或1%盐酸二甲基对苯二胺水溶液，配制后盛于棕色瓶中，置冰箱中可保存2周，若冰冻保存可用46周。方法1 如细菌在固体培养基上长出菌落，可将试剂直接滴在细菌的菌落上，菌落呈玫瑰红色然后到深紫色者为氧化酶阳性。方法2 取白色洁净滤纸一角，蘸取试验菌菌落少许，加试剂一滴，阳性者立即呈粉红色，以后颜色逐渐加深。十六、DNA酶试验原理：DNA酶可使DNA链水解成

21、为由几个单核苷酸组成的寡核苷酸链。长链DNA可被酸沉淀，而水解后形成的寡核苷酸，则可溶于酸，于DNA琼脂平板上进行试验，可在菌落周围形成透明环。培养基：DNA酶试验培养基营养琼脂（pH7.2） 100ml 脱氧核糖核酸（DNA） 0.2g8CaCl2水溶液 1ml方法：将被检菌接种于0.2%DNA琼脂平板上做点状接种，于3537培养1824小时后，用1N盐酸倾注平板。于菌落周围出现透明环为阳性。十七、脂酶试验原理：细菌产生的脂酶可分解脂肪为游离脂肪酸。加在培养基中的维多利亚蓝可与脂肪结合成为无色化合物，如果脂肪被细菌产生的脂肪酶分解，则维多利亚蓝释出，呈现深蓝色。该试验主要用于厌氧菌的鉴定。培

22、养基：脂酶培养基蛋白胨 10g 酵母浸膏 3g 氯化钠 5g 琼脂 20g pH7.8维多利亚蓝（1：1500水溶液） 100ml玉米油 50ml蒸馏水 900ml方法：将被检细菌接种于脂酶培养基上，于3537培养24小时。细菌如有脂酶，则使培养基变为深蓝色，否则培养基不变色（无色或粉红色）。十八、氨基酸脱羧酶试验原理：有的细菌具有脱羧酶，能使氨基酸脱羧（-COOH），生成胺和CO2，使培养基的pH升高，最常用的氨基酸有赖氨酸、鸟氨酸和精氨酸。基础培养基：蛋白胨 5g 葡萄糖 1g 0.2%溴麝香草酚蓝溶液 12ml蒸馏水 1000ml调整pH到6.8，每100m1基础培养基，加入所需要测定的

23、氨基酸0.5g，所加的氨基酸应先溶解于NaOH溶液。Ld赖氨酸0.5g + 15Na0H溶液0.5mlLd鸟氨酸0.5g + 15%NaOH溶液0.6ml加入氨基酸后，再调整pH至6.8，分装于灭菌小试管，每管1ml，121高压灭菌10分钟。方法：从琼脂斜面上挑取培养物少许接种，上面滴加一层无菌液体石蜡，于37培养4天，每天观察结果。阳性者培养液先变为黄色，后变为蓝色。阴性者为黄色。十九、苯丙氨酸脱氨酶试验原理：细菌能将苯丙氨酸脱氨变成苯丙酮酸，酮酸能使三氯化铁指示剂变绿色。变形杆菌及普罗菲登斯菌有苯丙氨酸脱氨酶的活力。培养基：DL苯丙氨酸（或L苯丙氨酸1g） 2g 氯化钠 5g酵母浸膏 3g

24、 琼脂 12gNa2HPO4 1g 蒸馏水 1000ml分装于小试管，121高压灭菌 10分钟，制成长斜面。试验方法：多量接种被检菌， 37孵育1824小时，生长好后，取出注入0.2毫升（或45滴）10的FeCl3水溶液于生长面上，变绿色者为阳性。二十、氰化钾抑菌试验原理：氰化钾可以抑制某些细菌的呼吸酶系统，细胞色素、细胞色素氧化酶、过氧化氢酶和过氧化物酶，以铁卟啉作为辅基，氰化钾能和铁卟淋结合，使这些酶失去活性，使细菌生长受到抑制。培养基：蛋白胨 10g Na2HPO4 5.64gNaCl 5g KH2PO4 0.225g蒸馏水 1000ml此为基础液。调节pH至7.6，15磅灭菌15分钟，冷却，置冰箱。于冷基础液中加以15ml0.5氰化钾溶液（0.5g KCN溶于100ml冷却的灭菌蒸馏水中），分装于灭菌小试管，每管约1ml，立即用蘸有热石蜡的软木塞塞紧，可于冰箱中保存2周。方法：将2024小时肉汤培养物，接种一大环到KCN培养基中，立即用软木塞塞紧，置37培养，连续观察2天，有细菌生长时为阳性反应。注意：KCN为剧毒药，宜在通气橱操作。