《生物化学实验手册》.docx

1、生物化学实验手册生物化学实验手册学时：36 学分：1.5课程属性：专业必修课 开课单位：华侨大学生物医学学院 先修课程：高等数学、普通物理学、无机及分析化学、有机化学一、课程的性质与任务 生物化学实验课是在学习生物化学理论课的基础上进行的一个实践性环节，本课程的教学任务是让学生运用已学过的知识验证一些结论、结果和现象，及综合运用已学过的理论知识设计实验或进行综合性的实验，巩固和加深对生物化学课程中基本理论知识的理解，训练学生理论知识的运用能力、实验操作技能、实验数据的处理和分析能力。二、实验目的与基本要求本实验课配合理论教学，通过实验从实践中进一步学习，掌握和运用学过的基本理论；运用生物化学理

2、论分析实验过程中的各种现象和问题，培养、训练学生的分析和解决问题的能力。学生必须完成的基本要求：预习实验，准备实验；写出预习报告，拟定记录表格；测取实验数据；整理实验数据；写出实验报告。三、实验项目一览表生物化学实验项目一览表序号实验项目名称实验类型实验要求适用专业学时12345678910111213氨基酸的分离鉴定纸层析法紫外分光光度法测定蛋白质的含量Bradford法测定蛋白质的含量Folin-酚法测定蛋白质的含量垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质脲酶的动力学研究用正交法测定几种因素对酶活性的影响DNA的提取与测定琼脂糖凝胶电泳实验还原糖和总糖的测定可溶性糖的硅胶G薄层层析维生素C含量的

3、定量测定卵磷脂的提取、纯化和鉴定基础性基础性基础性基础性综合性基础性基础性综合性综合性基础性基础性基础性设计性必做必做必做必做必做必做必做必做必做必做必做必做必做生物医学类生物医学类生物医学类生物医学类生物医学类生物医学类生物医学类生物医学类生物医学类生物医学类生物医学类生物医学类生物医学类3222622333323四、实验考核方式及办法考核方式：考查和实验成绩。 实验考查成绩占总成绩的30%。 实验成绩占总成绩的70%。实验成绩评分办法：实验操作占40%，实验态度占20%，实验报告占40%。五、实验项目的具体内容。实验一：氨基酸的分离鉴定纸层析法一、实验目的通过对氨基酸的分离，学习运用纸层析

4、法分离氨基酸混合物的基本原理，掌握纸层析的操作方法。二、实验原理纸层析（Paper Chromatography，简称PC），是以滤纸作为惰性支持物的分配层析，滤纸纤维上有亲水性的羟基，通过吸附一层水作为固定相，通常把有机溶剂作为流动相。有机溶剂自上而下流动称为下行层析，自下而上流动称为上行层析。流动相流经支持物时，与固定相之间连续抽提，使物质在两相间不断分配而得到分离。物质被分离后在纸层析图谱上的位置用Rf值（比移值）来表示：Rf值 = 原点到层析点中心的距离/ 原点到溶剂前沿的距离在一定条件下某种物质的Rf值是常数，其大小受物质的结构、性质、溶剂系统物质组成与比例、pH值、选用滤纸质地和温

5、度等多种因素影响。此外，样品中的盐分、其他杂质以及点样过多均会影响的有效分离。无色物质的纸层析图谱可用光谱法（紫外光照射）或显色法鉴定，氨基酸纸层析图谱常用茚三酮或吲哚醌作为显色剂，本实验采用茚三酮作为显色剂。三、仪器与试剂 （一）实验器材（1）层析缸 （2）微量器枪头（3）喷雾器（4）培养皿（5）电吹风机 （6）层析滤纸 （7）直尺（二）实验试剂（1）扩展剂：4份水饱和的正丁醇和1份冰乙酸的混合物。将20毫升正丁醇与5毫升冰乙酸放入分液漏斗中与15毫升水混合，充分振荡，静置后分层，放出下层水层，取漏斗内的扩展剂约5毫升置于小烧杯中做平衡溶剂，其余的倒入培养皿中备用。（2）氨基酸溶液：2mg/

6、mL的赖氨酸、甘氨酸、脯氨酸、谷氨酸、丙氨酸、亮氨酸溶液以及它们的混合液。（3）显色剂：0.5%水合茚三酮正丁醇溶液。四、操作步聚1. 将盛有平衡溶剂的小烧杯置于密闭的层析缸中，取长22厘米，宽14厘米的层析滤纸一张，在滤纸的一端距边缘2-3厘米处用铅笔划一条直线，在此直线上每间隔2厘米作一记号，等待点样。2. 点样：用毛细管将各氨基酸样液分别点在7个位置上，注意一定要每个点用一个毛细管，避免混用污染。样点干燥后再点2-3次，每点在滤纸上的扩散直径范围在3毫米内为最佳。3. 扩展：用针线将滤纸缝成圆筒状，注意纸的两边不能接触，留一定缝隙。将盛有约20毫升扩展剂的培养皿迅速置于密闭的层析缸中，并

7、将滤纸垂直立于培养皿中，点样的一端在下，扩展剂的液面需低于点样线1厘米，待溶剂上升至距离滤纸上端2厘米左右时取出滤纸，用铅笔在溶剂前沿划一边界线，自然干燥或用电吹风机吹干溶剂。4. 显色：用喷雾器均匀喷上0.5%茚三酮正丁醇溶液，然后置100烘箱烘烤5分钟或用电热风吹干即可显出各层析斑点。5. 计算各种氨基酸的Rf值。五、思考题为什么不同的氨基酸有不同的Rf值，影响本实验Rf值精确性的因素有哪些？实验二： 紫外分光光度法测定蛋白质的含量一、实验目的了解紫外吸收法测定蛋白质的含量的原理，掌握紫外分光光度的使用方法以及紫外分光光度法测定蛋白质含量的方法。二、实验原理蛋白质分子中存在含有共轭双键的酪

8、氨酸和色氨酸，使蛋白质对280nm的光波具有最大吸收值，在一定的范围内，蛋白质溶液的吸光值与其浓度成正比，可作定量测定。该法操作简单、快捷，并且测定的样品可以回收，低浓度盐类不干扰测定，故在蛋白质和酶的生化制备中广泛被采用。但此方法存在以下缺点：1当待测的蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基含量差别较大是会产生一定的误差，故该法适用于测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的样品。2若样品中含有其他在280nm吸收的物质如核酸等化合物，就会出现较大的干扰。但核酸的吸收高峰在260nm，因此分别测定280nm和260nm两处的光吸收值，通过计算可以适当的消除核酸对于测定蛋白质浓度的干扰作用。但因为不同的蛋白质和核酸

9、的紫外吸收是不同的，虽经校正，测定结果还存在着一定的误差。三、实验器材1紫外分光光度计 2移液管 3试管及试管架 4石英比色皿四、材料与试剂1标准蛋白质溶液：准确称取经凯氏定氮校正的牛血清清蛋白，配制成浓度为1mg/mL的溶液。2待测蛋白溶液：酪蛋白稀释溶液，使其浓度在标准曲线范围内。五、操作方法1标准曲线的制作表1 标准曲线的制作管号12345678标准蛋白质溶液/mL00.51.01.52.02.53.04.0蒸馏水/mL43.53.02.52.01.51.00蛋白质浓度/（mg/mL）00.1250.250.3750.500.6250.751.00A280A260按表1加入试剂。混匀后,

10、 选用1cm的石英比色皿，在波长280nm处测定各管的吸光值。以蛋白质的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制出血清蛋白的标准曲线。2未知样品的测定取待测蛋白质溶液1mL，加入3mL蒸馏水，在280nm下测定其吸光度值。并从标准曲线上查出待测蛋白质的浓度。实验三： Bradford法测定蛋白质的含量一、实验目的学习考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质浓度的原理和方法。二、实验原理1976年Bradford建立了用考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合的原理，迅速而准确的定量蛋白质的方法。染料与蛋白质结合后引起染料最大吸收光的改变，从465nm变为595nm。蛋白质-染料复合物具有高的消光系数，因此大大提

11、高了蛋白质测定的灵敏度（最低检出量为1g）。染料与蛋白质的结合是很迅速的过程，大约只需2min，结合物的颜色在1h内是稳定的。一些阳离子（如K+，Na+，Mg2+），（NH4）2SO4，乙醇等物质不干扰测定，而大量的去污剂如TritonX-100，SDS等严重干扰测定，少量的去污剂可通过用适当的对照而消除。由于染色法简单迅速，干扰物质少，灵敏度高，现已广泛用于蛋白质含量的测定。三、实验器材1天平 2分光光度计 3试管及试管架 4比色皿 5移液管四、材料与试剂1考马斯亮蓝G-250：称取100mg考马斯亮蓝G-250溶于50mL95%乙醇中，加入100mL85%（W/V）磷酸，将溶液用水稀释到1

12、000mL。试剂的终含量为：0.01%考马斯亮蓝G-250，4.7%（W/V）乙醇，和8.5%（W/V）磷酸。2标准蛋白质溶液：可用牛血清白蛋白预先经凯氏定氮法测定蛋白含氮量，根据其纯度配制成1mg/mL的溶液。3未知样品液。五、操作方法1. 牛血清蛋白标准曲线的制作表2 牛血清蛋白标准曲线的制作试管号123456标准蛋白液/mL00.20.40.60.81.0水/mL10.80.60.40.20每管中所含标准蛋白质的量/?g02004006008001000G-250染色液/mL555555室温下静置2minA595取6支试管，编号为1、2、3、4、5、6，按表2加入试剂。混匀后静置2min

13、，以1号管作空白对照,测定各管595nm下的吸光值，以吸光植为纵坐标，蛋白浓度为横坐标作图，得到标准曲线。2未知样品中蛋白质的测定取未知浓度的蛋白液（通过适当稀释，使其浓度控制在0.015-0.1mg/mL范围内）加到1mL试管内，再加入G-250染色液5mL混匀，测其595nm下的吸光度，对照标准曲线求出未知蛋白液的浓度。六、思考题1比较两种方法的测定结果, 分析紫外法和Bradford法测定蛋白质含量的各自有哪些优点和缺点？2若样品中含有核酸杂质，紫外法测定时应如何排除干扰？实验四：Folin-酚法测定蛋白质的含量一、实验目的学习Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法。进一步掌握比色法

14、或分光光度法在实际测量中的应用和注意事项。二、实验原理 Folin-酚试剂法是测定蛋白质含量的经典方法，它是在双缩脲法的基础上发展而来的。它操作简单、迅速、灵敏度高，叫双缩脲法灵敏100倍。Folin-酚法所用的试剂由两部分组成，试剂A相当于双缩脲试剂。蛋白质中的肽键与试剂A中的碱性硫酸铜反应形成铜-蛋白质复合物。这个复合物可与试剂B中磷钼酸-磷钨酸发生氧化还原反应。由于磷钼酸与磷钨酸易被酚类化合物还原而呈蓝色反应。而蛋白质中的酪氨酸和色氨酸均可发生此呈色反应。颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。故可用比色法测定蛋白质的含量。此法易受蛋白质样品中酚类化合物及柠檬酸的干扰。另外，试剂B中的磷钼酸-磷

15、钨酸仅在酸性pH值时稳定，故在将试剂B加入到碱性的铜-蛋白质溶液时，必须立即混合均匀。以确保还原反应能正常发生。此法也适用与酪氨酸和色氨酸的定量测定。三、实验器材 试管及试管架。 分光光度计。 吸管：0.5ml、1ml、5ml。四、材料与试剂 Folin酚试剂甲：A：10g Na2CO3、 2g NaOH和0.25 g 酒石酸钾钠，溶解定溶至500 ml， B：0.5g硫酸铜溶于100ml溶液中，使用当天将50ml A和1ml B混合即得溶液（甲）。有效期为1天。 Folin酚试剂乙（购买）。 牛血清蛋白（250g/ml）。 未知蛋白溶液：生物材料或样品，配制成溶液。五、操作方法 标准曲线的绘

16、制 表1 血清白蛋白标准曲线制作管号123456牛血清白蛋白/mL 00.20.40.60.81.0蒸馏水/mL10.80.60.40.20每管所含牛血清白蛋白的含量g/mL050100150200250Folin酚试剂甲/mL555555室温下放置10minFolin酚试剂乙/mL0.50.50.50.50.50.5OD650取7支试管，做好标记，按表1加入试剂。将各管混合均匀，室温下放置10min。再各加入0.5 mL Folin酚试剂乙，混合均匀，30min后，以1号管作空白， 650nm波长下测定各管的吸光度，以吸光度为纵坐标，以牛血清白蛋白溶液为横坐标，绘制出牛血清白蛋白的标准曲线。

17、 样品的测定准确吸取样品0.2ml，再加入0.8ml蒸馏水使样品体积达到1ml，加入5ml Folin酚试剂A15min后，再加Folin酚试剂B0.5ml，放置30min后，以0号管为空白，于500nm波长下测定吸光度由标准曲线查出样品的蛋白质浓度。六、思考题1. 试述Folin酚法的优缺点。2. 比较紫外分光光度法与比色法的异同。实验五：垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质一、实验目的 学习SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)分离蛋白质的原理和基本操作技术。二、实验原理 蛋白质是两性电解质，在一定的pH条件下解离而带电荷。当溶液的pH大于蛋白质的等电点(pI)时，蛋白质本身带负电

18、，在电场中将向正极移动；当溶液的pH小于蛋白质的等电点时，蛋白质带正电，在电场中将向负极移动；蛋白质在特定电场中移动的速度取决于其本身所带的净电荷的多少、蛋白质颗粒的大小和分子形状、电场强度等。 聚丙烯酰胺凝胶是由一定量的丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合而成的三维网状孔结构。本实验采用不连续凝胶系统，调整双丙烯酰胺用量的多少，可制成不同孔径的两层凝胶；这样，当含有不同分子量的蛋白质溶液通过这两层凝胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率。由于上层胶的孔径较大，不同大小的蛋白质分子在通过大孔胶时，受到的阻滞基本相同，因此以相同的速率移动；当进入小孔胶时，分子量大的蛋白质移动速度减慢，因而在两层凝胶的界

19、面处，样品被压缩成很窄的区带。这就是常说的浓缩效应和分子筛效应。同时，在制备上层胶(浓缩胶)和下层胶(分离胶)时，采用两种缓冲体系；上层胶pH=6.76.8，下层胶pH8.9；TrisHCI缓冲液中的Tris用于维持溶液的电中性及pH，是缓冲配对离子；CI-是前导离子。在pH6.8时，缓冲液中的Gly-为尾随离子，而在pH8.9时，Gly的解离度增加；这样浓缩胶和分离胶之间pH的不连续性，控制了慢离子的解离度，进而达到控制其有效迁移率之目的。不同蛋白质具有不同的等电点，在进入分离胶后，各种蛋白质由于所带的静电荷不同，而有不同的迁移率。由于在聚丙烯酰胺凝胶电泳中存在的浓缩效应，分子筛效应及电荷效

20、应，使不同的蛋白质在同一电场中达到有效的分离。 如果在聚丙烯酰胺凝胶中加入一定浓度的十二烷基硫酸钠(SDS)，由于SDS带有大量的负电荷，且这种阴离子表面活性剂能使蛋白质变性，特别是在强还原剂如巯基乙醇存在下，蛋白质分子内的二硫键被还原，肽链完全伸展，使蛋白质分子与SDS充分结合，形成带负电性的蛋白质SDS复合物；此时，蛋白质分子上所带的负电荷量远远超过蛋白质分子原有的电荷量，掩盖了不同蛋白质间所带电荷上的差异。蛋白质分子量愈小，在电场中移动得愈快；反之，愈慢。蛋白质的分子量与电泳迁移率之间的关系是：Mr=K(10-bm) logMr=LogKbRm，式中： Mr 蛋白质的分子量；logK截距

21、；b斜率；Rm 相对迁移率。实验证明，蛋白质分子量在15,000200,000的范围内，电泳迁移率与分子量的对数之间呈线性关系。蛋白质的相对迁移率Rm蛋白质样品的迁移距离染料(溴酚蓝)迁移距离。这样，在同一电场中进行电泳，把标准蛋白质的相对迁移率与相应的蛋白质分子量对数作图，由未知蛋白的相对迁移率可从标准曲线上求出它的分子量。 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法分离蛋白质具有简便、快速、重复性好的优点，是目前一般实验室常用的分离鉴定蛋白质的方法。三、试剂及主要器材1主要试剂1) 标准蛋白混合液内含：磷酸化酶(Mw 94,000)，牛血清蛋白(Mw 67,000)，肌动蛋白(Mw

22、43,000)，磷酸酐酶(Mw 30,000)和溶菌酶(Mw 14,000)2) 30凝胶贮备液：Acr 30g，Bis 0.8g,加蒸馏水至100mL3) 分离胶缓冲液(1.5molL): Tris 18.15g, 加水溶解, 6mol/L HCl调pH8.9, 定容100mL4) 浓缩胶缓冲液(0.5molL): Tris 6g, 加水溶解，6mol/L HCl调pH6.8，并定容到100mL5) 电极缓冲液(pH8.3)：SDS lg，Tris 6g，Gly 28.8g，加水溶解并定容到1000mL。用时稀释五倍。6) 10SDS 7) 10过硫酸铵(新鲜配制) 8) 1TEMED9)

23、上样缓冲液： 0.5molL Tris-HCl pH6.8 1.25mL，50甘油4mL，10SDS 2mL，巯基乙醇0.4mL，0.1溴酚蓝0.4mL，加蒸馏水定溶至10mL。10) 0.25考马斯亮蓝R-250染色液：考马斯亮蓝R-250 1.25g，50甲醇454mL，冰乙酸46mL。11) 脱色液：冰乙酸 35mL，蒸馏水465 mL。12) 未知分子量的蛋白质样品(1mgmL )2实验器材DYCZ-24D垂直板电泳槽(北京市六一仪器厂)；电泳仪；长滴管；微量加样器；烧杯(250mL、500m1)；量筒(500mL、 250m1)；培养皿(15cm?l5cm); 注射器等。四、实验操作

24、1. 装板将密封用硅胶框放在平玻璃上，然后将凹型玻璃与平玻璃重叠，将两块玻璃立起来使底端接触桌面，用手将两块玻璃夹住放入电泳槽内，然后插入斜插板到适中程度, 即可灌胶。2. 凝胶的聚合 分离胶和浓缩胶的制备：按下表中溶液的顺序及比例，配置10的分离胶和4.8的浓缩胶。试剂名称10%的分离胶/mL4.8%的浓缩胶/mLAcr/Bis 30%分离胶缓冲液（pH8.9）浓缩胶缓冲液（pH6.8）10%SDS10%过硫酸铵水TEMED53.7500.150.1511.601.250.10.14.951按上表各液加入混匀后配制成分离胶后，将凝胶液沿凝胶腔的长玻璃板的内面缓缓用滴管滴入，小心不要产生气泡。

25、将胶液加到距短玻璃板上沿2cm处为止,约5mL。然后用细滴管或注射器仔细注入少量水,约0.5-1mL。室温放置聚合30-40min。待分离胶聚合后，用滤纸条轻轻吸去分离胶表面的水分，按上表制备浓缩胶。用长滴管小心加到分离胶的上面，插入样品模子(梳子)；待浓缩胶聚合后，小心拔出样品模子。3蛋白质样品的处理 若标准蛋白质或欲分离的蛋白质样品是固体，称取lmg的样品溶解于lmL 0.5molL pH6.8Tris-盐酸缓冲液或蒸馏水中；若样品是液体，要测定蛋白质浓度，按1.01.5mgmL溶液比例，取蛋白质样液与样品处理液等体积混匀。本实验所用样品为1520?g的标准蛋白样品溶液，放置在0.5mL的

26、离心管中，加入1520?l的样品处理液。在100水浴中处理2min，冷却至室温后备用。 吸取未知分子量的蛋白质样品20?l，按照标准蛋白的处理方法进行处理。加样4SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直板型电泳的加样方法用手夹住两块玻璃板,上提斜插板使其松开,然后取下玻璃胶室去掉密封用硅胶框,注意在上述过程中手始终给玻璃胶室一个夹紧力,再将玻璃胶室凹面朝里置入电泳槽,插入斜板,将缓冲液加至内槽玻璃凹面以上,外槽缓冲液加到距平板玻璃上沿3mm处即可,注意避免在电泳槽内出现气泡。 加样时可用加样器斜靠在提手边缘的凹槽内，以准确定位加样位置，或用微量注射器依次在各样品槽内加样，各加1015?l(含蛋白质1015?

27、g)，稀溶液可加2030?l (还要根据胶的厚度灵活掌握)。 5电泳 加样完毕，盖好上盖，连接电泳仪，打开电泳仪开关后，样品进胶前电流控制在1520mA，大约1520min；样品中的溴酚蓝指示剂到达分离胶之后，电流升到3045mA，电泳过程保持电流稳定。当溴酚蓝指示剂迁移到距前沿12cm处即停止电泳，约1-2小时。如室温高，打开电泳槽循环水，降低电泳温度。6染色、脱色 电泳结束后，关掉电源，取出玻璃板，在长短两块玻璃板下角空隙内，用刀轻轻撬动，即将胶面与一块玻璃板分开，然后轻轻将胶片托起，指示剂区带中心插入铜丝作为标志，放入大培养皿中染色，使用0.25的考马斯亮蓝染液，染色24h，必要时可过夜

28、。 弃去染色液，用蒸馏水把胶面漂洗几次，然后加入脱色液，进行扩散脱色，经常换脱色液，直至蛋白质带清晰为止。7结果处理1) 测量脱色后凝胶板的长度和每个蛋白质样品移动距离(即蛋白质带中心到加样孔的距离)，测量指示染料迁移的距离。2) 按以下公式计算蛋白质样品的相对迁移率(Rm)相对迁移率样品迁移距离(cm)染料迁移距离(cm)3) 标准曲线的制作：以各标准蛋白质相对迁移率为横坐标，蛋白质分子量的对数为 纵坐标在半对数坐标纸上做图，得到一条标准曲线。4) 测定蛋白质样品的分子量：根据待测蛋白质样品的相对迁移率，从标准曲线上查得该蛋白质的分子量。五、思考题1. 聚丙烯酰胺凝胶电泳的几个不连续性是什么

29、？2. 电泳时的三个物理效应是什么？是怎样造成的？3. 电泳后上下槽缓冲液可否混合后再使用？为什么？4. 上样缓冲液中加入甘油的作用是什么？5. 贮液配制及贮存应注意什么？6. 过硫酸铵、7%乙酸和考马斯亮蓝在实验中有什么作用？实验六：脲酶的动力学研究一、实验目的了解酶动力学的研究的一般内容及方法。掌握脲酶的动力学研究的操作步骤。二、实验原理本实验以脲酶(Mrease)为例研究底物浓度、pH、抑制剂(磷酸根离子)浓度对反应速度的影响，并学会计算Km、V 等常数。脲酶广泛分布于植物界的种子中，某些微生物中也有，但在刀豆和大豆中含量较丰富。脲酶特异性地促使脲水解释放出氨和二氧化碳，其反应如下：脲酶属于一种寡聚酶44，分子量约为483000，等电点为4.8，最适pH 7.0。三、仪器和试剂1）仪器 细玻棒、恒温水浴、恒温箱、微量水平滴定管、吸量管。2）实验原料：新鲜大豆粉3）试剂1. 30乙醇(VV) 2. 1/10mol/L 尿素:称取0.6g尿素，加水至100 mL。然后稀释至1/20 mol/L；1/30 mol/L；1/40 mol/L；1/50 mol/L备用。3. 1/15mol/L PH7.0磷酸盐缓冲液：取60 mL 1/15mol/L磷酸氢二纳和40 mL 1/15mol/L磷酸二氢钾溶液。4. 10ZnSO4溶液5. 0.5M氢氧化