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1、工业微生物 chap11 微生物与现代生物制药工业工业微生物 chap11 微生物与现代生物制药工业 第十一章 微生物与现代生物制药工业微生物制药的开创可追溯到20世纪40年代初，世界上第一个有效的抗菌物质青霉素的研究开发和工业化生产。在英国细菌学家弗莱明（Fleming）发现了点青霉能产生一种活性抗菌成分并命名为青霉素（Penicillin）的10年后，牛津大学病理学教授Florey和他的助手Chain组织了20多位不同学科的学者进行攻关。经过一年多时间的努力，首次制得青霉素结晶并在1941年应用于临床试验，奠定了青霉素的治疗学基础。1942年，美国Merck制药公司在Florey和Chai

2、n的帮助下，开始工业化生产青霉素并大规模用于临床试验，为挽救在第二次世界大战中战伤受细菌感染而濒临死亡的伤员生命, 发挥了奇特的决定性的重大作用。1943年又发现产黄青霉菌（Pchrysogenum）, 经选育后表现出更高的青霉素产生能力，使青霉素的产量大大提高。同年，Chain又确定了青霉素的分子结构。至此，第一个利用微生物发酵制备抗生素的工业化获得了成功，开创了抗生素黄金时代的到来，被誉为二次大战中三大发现之一，而Fleming、Florey和Chain三位科学家同时获得了1945年度诺贝尔医学生理学奖。青霉素在临床上的抗感染奇异疗效，引起世人的震惊轰动，也大大激发了各国微生物学者的研究热

3、情。继青霉素之后，从微生物中大规模进行其他抗生素的筛选，是由美国科学家瓦克斯曼（Waksman）及其合作者开始的。瓦克斯曼根据自己多年的研究工作，逐步建立并提出一整套分离培养放线菌、提取抗生素及测定其活性的筛选实验技术。使他在1943年发现了链霉素，并在1944年1月首次对外宣布了这种新抗生素作为抗结核病药品应用于临床取得了令人振奋的治疗效果。在以后的近20年内陆续发现了众多的抗生素品种。如1947年发现了氯霉素（第一个广谱抗生素）；1948年Dugger发现了金霉素，以后又得到土霉素和毒性较低的四环素；1952年发现了红霉素；1953年发现了新生霉素；1957年，Sensi发现了利福霉素（经

4、结构改造得到利福平），同年由梅泽滨夫发现了对耐药菌有效的卡那霉素；1963年Weinstein发现了毒性较低的艮他霉素(庆大霉素)等。自60年代起，抗肿瘤抗生素（柔红霉素、丝裂霉素C、博莱霉素）、抗虫抗生素（盐霉素、莫能霉素、阿弗米丁）、农用抗生素（春雷霉素、有效霉素、井冈霉素）和抗病毒抗生素等也不断被发现。目前，在临床上应用的大多数天然抗生素都是在5060年代发现的。由于青霉素等天然抗生素的大量广泛使用，使临床应用上出现过敏反应和耐药性菌，因此，从60年代开始，科学家们对原有抗生素进行结构改造，寻求具有更好临床效果的抗生素衍生物，使抗生素的研究进入了半合成抗生素的时代。如60年代初，英国Be

5、echam公司由青霉素母核6APA合成了苯乙青霉素，接着又合成了耐酶的甲氧苯青霉素、可供口服的苯唑青霉素和广谱氨苄青霉素。接着，Glanxo公司也由头孢菌素C的母核7ACA先后合成了头孢噻吩、头孢唑啉、头孢噻肟和头孢拉定等抗菌性较强的半合成头孢菌素。后来又发展到由青霉素G的6-APA母核经化学扩环得到的7ADCA为母核，再经酶促合成获得可供口服的头孢氨苄、头孢克罗等半合成头孢菌素，并使该类抗生素从窄谱的第一代逐渐发展到广谱的第三代，临床应用的品种增加到50多个。由于40和50年代抗生素大规模发酵生产的成功，从而建立了一整套液体深层通气发酵工程技术，这就为其他的微生物药物的发酵生产奠定了坚实的基

6、础。这些微生物药物是应用生物化学和微生物学的理论、方法和研究成果，从微生物菌体或其发酵液中经分离、纯化得到的某些生理活性物质。除抗生素类药物外，还包括氨基酸类药物、核苷酸类药物、维生素类药物、酶类药物、多肽蛋白质类药物、甾体类激素和生物制品等。这类以微生物初级代谢产物和微生物菌体为主的微生物药物，在6070年代得到蓬勃发展并取得巨大的成果。在抗生素深入研究的基础上另一类由微生物产生的除抗感染、抗肿瘤以外的其他生理活性物质，如特异性酶抑制剂、免疫调节剂、受体拮抗剂和抗氧化剂等的研究报道层出不穷，这类物质也是微生物的次级代谢产物，但其活性已超出了抑制某些生物生命活动的范围。由于这类物质具有广泛的生

7、理活性而已经或正在被开发成为各种药物用于临床。从已经取得的研究成果来看，在微生物次级代谢产物中已发现的生理活性物质，不仅是构成微生物药物的最新部分，而且已是主要部分。随着细胞工程技术和基因工程技术的发展，更进一步为微生物制药提供了新型的融合子和工程菌，它们能极大地提高生产效率或能够生产原来微生物所不能产生的药物。如用于预防或治疗心脑血管疾病、糖尿病、肝炎、肿瘤的药物以及抗感染、抗衰老的新型药物。基因工程药物主要是生理活性多肽类和蛋白质类药物，如胰岛素、生长激素、干扰素、组织纤溶酶原激活剂、白细胞介素、促红细胞生成素、集落刺激因子等，此外还有各种基因工程疫苗。实际上，应用DNA重组技术和细胞工程

8、技术所获得的工程菌和新型微生物菌种来开发各类新型药物，已经成为微生物制药研究的重点和发展方向之一。生物制药的三大来源是微生物、植物和动物，而植物和动物的生长周期长，收获量有限，因此，开发新型生物药物的重点会逐渐转向微生物。应用微生物技术研究开发新药, 改造和替代传统制药工业技术，加快医药生物技术产品的产业化规模和速度，是目前医药工业的一个重要发展方向。 第一节 微生物来源抗生素的研究与生产抗生素的来源可以是微生物、植物和动物，但抗生素的工业化生产主要是来自微生物的大量发酵法。多数学者认为传统概念的抗生素仍应只限于微生物的次级代谢产物。因此抗生素可定义为：抗生素是在低微浓度下即可对它种生物的生命

9、活动有特异性抑制或影响作用的微生物次级代谢产物及其衍生物。抗生素是一类最重要和在临床上用量最大的抗感染药物。它用于治疗由病原微生物，包括病毒、细菌、真菌、原虫和寄生虫所引起的各种疾病，也用于某些癌症的治疗。此外，抗生素还应用于禽畜和植物病害的防治、食物防腐以及工业防霉等。可见抗生素对人类的生活与生产以及对国民经济的作用十分重要。在50年代至60年代，是从微生物的次级代谢产物中不断发现和生产各种天然抗生素的黄金时代，而随后开创的从已有抗生素采用酶法或化学法进行结构改造来生产各种疗效更高、毒副作用更低和更为有效的半合成抗生素，则是又一个黄金时代。随着对抗生素认识的加深和研究工作的深入开展，许多新型

10、抗生素不断被发现，其中有不少已被应用于临床。目前，抗生素的生理活性和作用已超出了抗微生物感染和抗肿瘤的范围，某些抗生素还具有特异性酶抑制作用、免疫调节作用和受体拮抗作用等广泛的生理活性作用。 、微生物发酵法生产天然抗生素(一) 主要天然抗生素及其产生菌当前在临床上实际应用和工业生产的天然抗生素中，以放线菌所产生的抗生素为第一位（表81），其次是真菌中的半知菌产生的抗生素（表8 2），再其次是由细菌产生的抗生素（表83）。 表8 1 放线菌产生的主要抗生素 抗生素 产生菌链霉素（streptomycins）灰色链霉菌（Sgriseus）卡那霉素（kanamycins）卡那霉素链霉菌（Skanam

11、yceticus）庆大霉素（gentamycins）绛红小单孢菌 ( M. purpurea )棘孢小单孢菌 ( Mechinospora )金霉素（chlortetracycline）金色链霉菌（Saureofaciens）红霉素（erythromycin）红色链霉菌（Serythreus）柱晶白霉素（leucomycins）北里链霉菌（Sritasatoensis）麦迪霉素（mydemycin）生米卡链霉菌 ( Smycarfaciens nov.sp.)螺旋霉素（spiramycins）生二素链霉菌（Sambofaciens）制霉菌素（nystatin）诺卡氏链霉菌（Snoursei）两

12、性霉素B（amphotericin B）结节链霉菌（Streptomyces nodosus）诺卡霉素（nacardicins）均匀诺卡氏菌（Nocardia uniformi）硫霉素（thienamycin）卡特利链霉菌 (Scatteya )氯霉素（chloramphenicol）委内瑞拉链霉菌（Sveneznelae）新生霉素（novobiocin）浑球链霉菌（S. sphaeroides）四环素（tetracycline）金霉素链霉菌（Saureofaciens）土霉素（oxytetracycine）龟裂链霉菌（Srimosus）巴龙霉素（paromomycin）巴龙霉素型龟裂链霉菌（

13、S. rimosus var paromonomycincus）利福霉素（rifamycin）地中海诺卡氏菌（Nocardia meditrerranei）博莱霉素（bleomycins）轮枝链霉菌（Sreticillus）丝裂霉素C（mitomycin C）头状链霉菌 ( Scaespitocus )放线菌素C（actinomycin C）金羊毛链霉菌 ( SChrysomallus )林可霉素（lincomycin）林可链霉菌 ( S. lincolnensis )表8 2 真菌产生的主要抗生素抗生素产生菌青霉素（不包括青霉素N）（penicillin）点青霉（Penicillium no

14、tatum）产黄青霉 ( Pencillnum chrysogenum ) 青霉素N（penicillin N）顶孢头孢子菌（Cephalosporium acremonium） 头孢菌素C（cephalosporin C）顶孢头孢子菌 去乙酰氧头孢菌素C（deacetoxycephalosporin C）顶孢头孢子菌 去乙酰头孢菌素 C（deacetylocephalosporin C）顶孢头孢子菌 灰黄霉素（grisefulvin）灰黄霉素青霉 ( Penicillium griseofulvin ) 变曲霉素（pecilocin）宛氏拟青霉 ( Paecilomyces varioti

15、) 表8 3 细菌产生的主要抗生素抗生素产生菌 杆菌肽（bacitracin）枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）短杆菌肽（gramicidin）短芽孢杆菌 ( Bacillus brevies )多黏菌素（polymyxin）多黏芽孢杆菌（Bacillus polymyxin）短杆菌酪肽（tyrocidin）短芽孢杆菌 ( Bacillus brevies )(二) 新抗生素产生菌的分离与筛选1. 放线菌的分离大多数放线菌的分离并不采用含丰富营养的生长培养基，而是采用较贫瘠或复杂底物（如几丁质）的琼脂平板培养基。如可采用精氨酸甘油培养基、AV琼脂、Benedict琼脂、胶状几丁

16、琼脂等培养基进行平板分离。在分离培养基中，通常都加入抗真菌剂如制霉菌素或放线菌酮，以抑制真菌的繁殖。此外，为了富集和分离某些特殊种类的放线菌，可选择性地添加某些抗生素。放线菌的分离有非选择性分离和选择性分离两种，前者是对土样中所有放线菌都进行分离，后者是在分离之前，先对土样进行预处理（如在不同温度下进行热处理），只留下具有特定特性的放线菌。分离方法可采用平板划线分离法、玻璃涂棒连续涂布法、十倍稀释法和接种环快速稀释法等。总的目的是使以混杂的状态生长繁殖在一起的各类微生物单个分开并选择性地生长，从而获得放线菌的纯培养。2. 放线菌的次代培养及纯化成功地分离出各种不同放线菌的关键, 是上述所采集的

17、含菌样品的本身及所采用的合适分离培养基。而当菌落形成后，先用肉眼识别不同的生长形态，从而初步地加以鉴定，再通过显微镜进行镜检。进一步了解其菌丝和孢子丝的形成情况，这对于成功地分离获得放线菌纯培养也是很重要的。次代培养及纯化操作是将分离平板上所形成的菌落, 用无菌接种针或钩挑取单个菌落，转接到适宜的琼脂斜面上，或者点接到琼脂平板上进行培养，以供进一步分离和筛选用。3. 新抗生素产生菌的筛选从大量分离获得的纯培养微生物中，采用合理的方法尽快鉴别出少数有应用价值的抗生素产生菌的试验过程，即为筛选。一般根据筛选目的，选择合适的筛选方法，例如选用有利于目的菌种生长的培养基及选用合适的试验菌作为筛选模型。

18、在筛选抗细菌或抗真菌的新抗生素时，一般应先尽量选用无毒性而对某些致病菌具有代表性的微生物作为试验菌，以防止在筛选工作中感染病原菌的危险。例如常用金黄色葡萄球菌209P代表革兰氏阳性病原球菌作为试验菌，即筛选模型；用大肠杆菌代表革兰氏阴性肠道致病细菌作为试验菌；用青霉菌代表致病性丝状真菌作为试验菌等。新抗生素产生菌的常用筛选方法有下列几种：(1) 琼脂块移置法将已分离纯化的放线菌逐个点接于合适的平板培养基上，经培养形成菌落后，用打孔器将菌落连同琼脂块切取后分别移置于已接种有试验菌的平板上，在合适温度下培养一定时间后，观察琼脂块周围有无抑菌圈形成。(2) 培养液扩散法将待筛选的纯化菌株接种于一定量

19、的液体培养基中，置摇床于适宜的温度下振荡培养36 d。用直径为5mm的滤纸片沾取培养液的上清液或菌丝体的丙酮浸提液，分别置于接种有试验菌的平板上，培养一定时间后观察有否抑菌圈产生。(3) 抗肿瘤抗生素的筛选法筛选抗肿瘤抗生素的方法很多，较有效的方法是人肿瘤细胞或动物肿瘤模型法，但因该法繁复，耗时耗动物和耗人力多，故作为初筛一般仍常用体外微生物噬菌体模型法。噬菌体模型法可分为诱导噬菌体法和抗噬菌体法两种。前者是将沾有待筛培养液的圆滤纸置于混有溶原菌和指示菌的平板上，凡能诱导溶原菌释放出噬菌体者，滤纸片周围出现清晰噬菌斑。后者则是将沾培养液的滤纸片置于混有噬菌体及其敏感细菌的平板上，有抗噬菌体作用

20、者，滤纸片周围有明显的细菌生长圈。(4) 抗病毒抗生素的筛选法筛选抗病毒抗生素除可采用前述筛选抗肿瘤抗生素类似的方法外，还可采用体内筛选法。该法是采用病毒感染动物，然后进行试验治疗，观察动物存活期或生存期以判断其疗效。4. 新抗生素的早期鉴别为了尽早了解筛选到的抗生素是新的还是旧的抗生素，是那一类新或旧的抗生素，必须对上述筛选获得的阳性菌株进行早期鉴别，以便淘汰不需要的菌株。鉴别时，可先进行菌株形态特征、培养特征和生理生化特性等试验，观察并分析有否可能是哪种新老抗生素的产生菌。接着可将产生菌所产生的抗生素进行层析或电泳分析，并将获得的各种图谱与已知抗生素图谱进行比较鉴别和判断。经过分离筛选和早

21、期鉴别，有价值的新抗生素产生菌应进行菌种选育和发酵条件优化提高抗生素产量，并妥善保藏。新抗生素还必须通过药理和临床试验，以便为实际应用提供实验依据。（三）抗生素的生物效价测定法抗生素的医疗作用主要是它的抗菌活力，而采用微生物检定法正是以抗生素的抗菌活力为指标来衡量抗生素生物效价的一种方法。其测定原理于临床要求相一致，能直接反映抗生素的医疗价值。微生物检定法测定抗生素生物效价，一般可分为稀释法、比较法和琼脂扩散法。以琼脂扩散法（亦称管碟法）应用最广泛。该法的一般操作步骤是：先将固体培养基融化并倒制平板，待凝固后，在上面再倒一层混有试验菌的融化培养基。凝固后，在表面放置不锈钢管子，向管子中加入抗生

22、素稀释液，适温培养一定时间。经培养后，由于抗生素向培养基中扩散，凡抑菌浓度所达之处，试验菌不能生长而呈透明抑菌圈。量取抑菌圈直径并进行效价计算，具体方法请参照中国药典。（四）内酰胺类抗生素的发酵生产 内酰胺类抗生素是一类最重要的抗生素，在医用抗生素中一直处于优势地位，在销量和发展上一直呈上升趋势。其主要特征是在分子结构中含有一个具抗菌活力的内酰胺环状结构。青霉素和头孢菌素是天然内酰胺类抗生素的两个典型代表。1. 青霉素（1）结构与性质青霉素的母核是6氨基青霉烷酸（6Amino Penicillanic Acid, 6APA），由四元内酰胺环、五元二氢噻唑环这两个稠骈杂环组成，可以看作由半胱氨基

23、酸和缬氨酸结合而成。侧链R不同，所形成的青霉素也不同，如R为苯甲基（苄基）时，为青霉素G即苄基青霉素（图8 1）。 图11 1 青霉素的化学结构 R侧链； *不对称碳原子 在不添加侧链前体的自然发酵液中，含有青霉素F、G、K、V、X和双氢F等混合物，但只有青霉素G和青霉素V在临床上有疗效。现行的青霉素发酵液中，G的含量最高，抗菌作用最强。青霉素G是一种有机酸、难溶于水，不稳定。但其Na+、K+盐稳定，易溶于水。 青霉素G优点是使用安全，毒性小，低浓度抑菌、高浓度杀菌、对大多数G+球菌和杆菌、螺旋体及放线菌的抗菌作用强。其缺点是对酸不稳定，不能口服、排泄快；对G-菌无效，大量应用后易诱发耐药性菌

24、株；某些病人会产生过敏反应（因产品中含微量青霉噻唑酸蛋白）。上述缺点可通过研制各类半合成新青霉素和各种制剂加以克服。（2）青霉素产生菌1929年由Fleming发现并分离获得的青霉素产生菌是点青霉菌，又称音符型青霉菌（Penicillium notatum），其青霉素产量很低，表面培养的效价也只有几十个单位，不符合工业生产的要求。1943年分离到一株橄榄型青霉菌即产黄青霉菌（Penicillium.Chrysogenum）NRRL1995，适合于液体深层发酵，效价约为100 U/ml。该菌株经X射线和紫外线诱变处理后得到一变异株WisQ176，青霉素产量最高达1500 U/ml，比原始株提高约

25、15倍，但发酵时产色素，影响产品质量。后来再将WisQ176通过一系列的诱变处理，获得不产生色素的变异株5120。目前工业生产上采用的生产菌种均为该变种经不同改良途径得到的变异株，有形成绿色和黄色孢子的两种生产菌株。通过采用理化因素不断进行诱变选育，当前青霉素发酵生产的效价已超过50000 U/ml的高水平。目前，又采用原生质体诱变、原生质体融合及基因工程等现代育种技术进一步定向选育优良高产的菌种，并已取得显著成效。 产黄青霉菌的个体形态：青霉穗形似毛笔，从气生菌丝形成大梗和小梗，于小梗上着生分生孢子。分生孢子呈链状排列，椭园或园柱形。菌落形态为园形，边缘整齐或锯齿状，外观平坦或皱褶，孢子呈黄

26、绿色，绿色或蓝绿色，成熟后变为黄棕色或红棕色。（3）青霉素的发酵 工业生产上所用的产黄青霉菌孢子的制备过程是：将长期保藏的冷冻管孢子移接于斜面培养基上培养，成熟后再移植于固体培养基（大米和小米）上，于25培养约7天，收集成熟孢子进行真空干燥，低温保存备生产用。 为制备大量种子（菌丝体）供大规模发酵用，一般采用二级或三级种子培养。一级种子培养在小型种子罐中进行，主要是使接入的生产孢子萌发形成菌丝并增殖为大量菌丝体。二级种子培养在较大的种子罐中进行，主要目的是进一步扩大培养使获得足量的供发酵用的菌丝体。种子培养基营养较丰富，碳源多采用葡萄糖、蔗糖或乳糖，氮源采用玉米浆、尿素等，还有起pH缓冲作用的

27、碳酸钙和各种必需的无机盐类。在自然pH条件下，保持最适生长温度2627和充分的通气、搅拌，分别培养约56 h和24 h，可达到上述种子扩大培养之目的。 进入大罐发酵时除了继续大量繁殖菌丝体外，主要是发酵产生青霉素。为了获得较高的青霉素发酵产率，需要控制并优化的主要环境因素和生理因素有：发酵温度、发酵pH、溶解氧、碳氮源、补料、侧链前体添加、菌丝浓度与生长速度、菌丝形态等。（4）青霉素的提取 发酵液预处理：发酵液中杂质很多，其中对青霉素提取影响最大的是高价无机离子Ca+、Mg+、Fe+等和蛋白。可用草酸钙除Ca+和蛋白，用三聚磷酸纳除Ca+、Mg+，用黄血盐除Fe+，变性除蛋白。过滤：通过调pH

28、、加去乳化剂、助滤剂等方法尽量除去蛋白以改善过滤性能，并经两次过滤得青霉素滤液。 萃取：根据青霉素游离酸易溶于有机溶剂而青霉素盐易溶于水的特性，采用溶媒萃取法，进行反复转移而达到提纯和浓缩之目的。整个萃取过程在低温下进行，需添加去乳化剂防止蛋白引起的乳化。 结晶：在醋酸丁酯萃取液中加入醋酸钾（或钠）乙醇液，使析出青霉素钾盐或钠盐的结晶。 2. 头孢菌素(1) 头孢菌素C的结构头孢菌素C的化学结构与青霉素相似，也具有-内酰胺环，其母核为7-氨基头孢霉烷酸（7ACA）。不同之处在于青霉素母核的二氢噻唑五元环扩大为 二氢噻嗪六元环，侧链为D氨基己二酸，含有乙酰氧基取代基（图8 2）。 图11 2 头

29、孢菌素C的化学结构（2）头孢菌素C的性质与特点头孢菌素C与青霉素不同，对酸性和重金属离子较稳定。在pH11时，才迅速丧失其生物活性；对青霉素酶不敏感，抗革兰氏阴性细菌能力较强；具有抗耐药金黄色葡菌球菌（革兰氏阳性）的作用；对细菌的作用是杀菌，对动物和人毒性非常低；头孢菌素C的抗菌活性较低，只有苄青霉素的1/200；头孢菌素C虽没有临床应用价值，但通过酶法和化学改造，可以制备出比半合成青霉素更高效的衍生物，即半合成头孢菌素类抗生素。（3）头孢菌素C产生菌 1948年布鲁特治氏（Brotzas）分离到顶孢头孢菌（Cephalosporium acremonium），后来从发酵液中发现其中含有三种完

30、全不同的抗生素：头孢菌素N、头孢菌素P和头孢菌素C。这三种天然头孢菌素都不具备临床使用价值。但由于头孢菌素C的化学结构、母核与青霉素相似，而与青霉素相比具有耐酸性强、毒性低，对青霉素酶不敏感，抗革兰氏阴性菌能力强，且具有抗耐青霉素的金黄色葡萄球菌等优点而引起重视。原始的Bratzas顶孢头孢菌菌株产量很低，后经诱变选育获得M 8650母株，再经埃莉.礼莱公司（Eli.Lilly）进一步诱变选育获得菌株CW 19，产量比母株提高了三倍，而且发酵液中头孢菌素C与副产物青霉素N (造成提取和纯化的困难及成本的增加）之间的比例也有明显的改进。 其它有关菌种选育的报道有：意大利报道，通过选育获得一个头孢

31、菌素C产量高而青霉素N产量低的新菌种名为Cephalosporium SP.F12（ATCC20339）, 发酵130 h可得头孢菌素C 45005000 g/ml，且副产物PCN产量低； 1976年，日本某公司将一高产菌株N-16亲株以紫外线处理后，获得一变异株IS5，能利用硫酸盐合成头孢菌素C，改变过去一直用甲硫氨酸作硫源的工艺，且产量比亲株提高2倍; 日本某公司将LM5（甲硫氨酸和亮氨酸双缺陷型）与AP78（精氨酸、苯丙氨酸双缺）进行杂交，获得头孢菌素C高产菌株2M16，产量高达8200 g/ml。(4) 头孢菌素C的发酵 头孢菌素C的发酵控制要点可归纳为下列几点： 解除碳源阻遏作用： 在较高葡萄糖浓度下头孢菌素C的产率下降，而青霉素N积累增加，表明葡萄糖会通过阻遏扩环酶的产生而阻遏头孢菌素C的生物合成。通过控制碳源的流加补料发酵，或用代谢速度较慢的植物油作碳源，可以较有效地避免这种碳源阻遏作用，显著提高头孢菌素C的产率。 硫源的补给： 头孢菌素C分子中含有硫原子，故发酵时除需要一般的碳源和氮源外，还须在培养液中补给硫源。头孢菌素C的产量与蛋氨酸和硫酸盐的量成正比，蛋氨酸不仅能提供硫，而且还有诱导调控作用。此外半胱氨酸能渗入头孢菌素C结构中去。