伪狂犬病检验方法.docx

1、伪狂犬病检验方法十一、伪狂犬病检测办法伪狂犬病病毒分离鉴定1 材料准备 DMEM培养基、BHK-21细胞、新生犊牛血清、青霉素、链霉素溶液、0.22ul微孔滤膜、细胞培养瓶、CO2培养箱、倒置显微镜。溶液配制见附录A(原则附录)2 操作环节2.1 病料采集 对于刚死亡或活体送检并处死动物，无菌采用肝、脾、肺、肾及其脑组织，特别是三叉神经节、嗅球， 4送实验室检测。2.2 样品解决 待检组织在灭菌乳钵内剪碎，加入灭菌玻璃砂研磨，用灭菌生理盐水或DME培养基制成1：5乳剂，70重复冻融后，经3000rpm离心30分钟后，取上清液经0.22m微孔滤膜过滤后，加入青链霉素溶液至最后浓度为100U/mL

2、，70保存作为接种材料。2.3 病料接种 将病料滤液接种已长成单层BHK-21细胞，接种量为培养基量10%，37恒温箱中吸附1小时后，加入含10%新生犊牛血清（通过56水浴灭活30分钟，过滤除菌，无支原体）DMEM培养基，置37温箱中培养。2.4 观测成果 接种后2448小时，BHK-21细胞应浮现典型细胞病变效应（Cyto pathogenic effect，CPE），体现为细胞变圆，脱落。如第一次接种不浮现CPE，应将细胞培养物冻融后盲传三代，如仍无CPE，则判为伪狂犬病病毒阴性。2.5 病毒鉴定 将浮现CPE细胞培养物重复冻融后，用聚合酶链式反映、荧光抗体实验等两种办法中任一办法作进一步

3、鉴定。伪狂犬病聚合酶链式反映1 材料准备:待检组织、组织匀浆器、蛋白酶K，十二烷基磺酸钠（SDS），苯酚、氯仿，异戊醇（分析纯）、TEN缓冲液。溶液配制见附录C(原则附录)引物：扩增伪狂犬病病毒基因中434651bp之间217bp基因片段，由上海生物工程公司合成。序列为，上游引物P1：5-CAGGAGGACGAGCTGGGGCT-3，下游引物P2：5-GTCCACGCCC-CGCTTGAAGCT-3 仪器设备有：凝胶电泳紫外线检测仪， PCR扩增仪，电泳仪2操作环节：21 样品采集：对于病死或扑杀动物，取脑组织；对于待检活猪，用已灭菌棉签，伸入猪鼻腔中，采用鼻粘液，即为鼻拭子，冷藏条件送实验室

4、检测。2.2 样品解决 所采病料经组织研磨器充分研磨，按1:5用TEN缓冲液悬浮收集于离心管内，-70重复冻融3次，7000r/min离心5min，如样品为鼻试子，则加入2ml TEN缓冲液，充分挤压，取出棉签，7000rpm，离心5分钟，取上清液。取上清液472.5l,加入25l 10SDS和2.5l20mg/ml 蛋白酶K，50水浴摇床上放置2h后加入等量饱和酚500l，涡旋20s。离心取上清液，加等量酚：氯仿：异戍醇（25:24:1）抽提一次，再用氯仿：异戍醇（24：1）抽提一次，最后用乙醇沉淀，真空抽干后加入20l双蒸水溶解，-20贮存备用。2.3. PCR操作程序 先将制备模板DNA

5、置100水浴10分钟作变性解决，然后及时放于冰浴中。PCR反映体系为：总体积25l，具有50m mol/L KCl,10m mol/L Tris-HCl（pH 9.0），0.1Triton X-100，100mol/L dNTPs，0.35mol/L引物，2 m mol/L MgCl2，及0.5U Taq酶，1l模板DNA。惯用反映体系构成如下 10缓冲液 2.5 l 15mM MgCl2 2.5 l dNTPs 2.0 l 引物 各2.0l Taq聚合酶 1.0l DNA模板 2.0l 灭菌去离子水 11.0l 矿物油 约 20l 扩増条件为:94变性3分钟，进入循环，9460秒，6560秒

6、，7260秒，40个循环后72延伸5分钟。2.4 PCR产物检测 PCR扩增产物在1琼脂糖凝胶上电泳，溴化乙锭染色，在紫外光下观测成果。为进一步进行PCR扩增产物特异性鉴定，可取PCR产物用SalI酶切，酶切产物在2琼脂糖凝胶上电泳，EB染色，在紫外光下观测并与原则分子量比较，可见产生140bp和77bp两个片段。伪狂犬病荧光抗体实验1材料准备：碳酸盐缓冲甘油、磷酸盐缓冲液、丙酮（分析纯），伪狂犬病荧光抗体、冰冻切片机，荧光显微镜。溶液配制见附录D(原则附录)2操作环节21样品采集 扑杀可疑动物，取大脑、淋巴结、扁桃体迅速送检实验室，如不能及时送出，必要冻结保存，避免腐败、自溶。本法也可用于对

7、疑似伪狂犬病病毒培养物进行鉴定。22 切片制备 将样品组织块切成1cm 1cm面，不经任何固定解决，直接贴于冰冻切片托上，进行切片，切片厚度规定57um，将切片展贴于0.8mm1mm厚干净载玻片上。23固定：将切片置纯丙酮中固定15分钟，取出及时放入0.01mol/L，pH7.2磷酸盐缓冲液中，轻轻漂洗34次，取出，自然干燥后尽快进行荧光抗体染色。24 染色 将伪狂犬病荧光抗体滴加于切片表面，置温盒内于37作用30分钟，取出后放入磷酸盐缓冲液中充分漂洗，再用0.5moL/L，pH9.09.5碳酸盐缓冲甘油封固盖片（0.1mm厚），染色后应尽快镜检，必要时可放置低温待检。25 观测 将染色后切片

8、标本置激发光为蓝紫光或紫外光荧光显微镜下观测。26鉴定：于荧光显微镜视野中，见细胞中浮现明亮黄绿色荧光，判为伪狂犬病病毒感染阳性。伪狂犬病微量中和实验（固定病毒，稀释血清法）1 材料准备1.25%胰酶（配制见附录B）、BHK-21细胞,多道可调微量移液器，,96孔细胞培养板,CO2培养箱，倒置显微镜。2 操作环节2.1 病毒半数组织细胞感染量（TCID50）测定：2.1.1 病毒培养和收获 将伪狂犬病毒接种于长成单层BHK-21细胞，接种量为液体培养基量10%,37培养，待浮现病变后，冻融，收获病毒。2.1.2 病毒滴定 用DMEM培养基将伪狂犬病病毒作持续10倍稀释，即101、102每个稀释

9、度取100L加入96孔细胞培养板中，随后加入经0.25%胰酶消化BHK-21细胞100L（细胞含量以105/mL左右 为宜），每个稀释度作8个重复，并设空白细胞培养对照。置37 5%CO2培养箱中。 2.1.3 TCID50计算 逐日观测细胞病变，并记录细胞病变孔数，直到对照细胞老化脱落为止。按照Reed-Muench法计算病毒TCID50（详细计算示例见附录B）。2.2 中和实验 将无菌采集待检猪血清置56水浴灭活30分钟。用DMEM培养基作倍比稀释，在细胞培养板各孔中加入50L培养基，随后在第一孔中加入经待检猪血清50L混合后，用微量移液器取出50L，加到第二孔中，混匀后取出50L再加入第

10、三孔中，依此类推。血清稀释度即为1：2、1：4、1：8，每份待检血清稀释度作24个重复。将50L含200个TCID50病毒液加入到不同稀释度血清孔中，37作用1小时，每孔中再加入100L经胰酶消化分散BHK-21细胞，同步设病毒对照、阳性血清、阴性血清，待检血清、正常细胞对照。2.3计算抗体中和效价 逐日观测，直至细胞对照浮现老化脱落为止，按Reed-Muench两氏法，计算抗体中和效价。如抗体效价为1：2及1：2以上，则判为伪狂犬病抗体阳性。伪狂犬病酶联免疫吸附实验（间接法）1材料准备：抗原、酶标抗体，底物（OPDH2O2），酶联免疫检测仪；溶液配制见附录F(原则附录)2 操作环节：2.1

11、包被 将PRV抗原加入酶标板孔内，每孔100uL，37作用1h后置4冰箱过夜。2.2 洗涤 弃去孔内液体，用洗涤液洗3次，每次3min，用吸水纸拍干2.3 封闭 各孔加入封闭液100uL 37作用1h。按2.2环节洗涤24 加入待检血清 待检血清经56oC30分钟灭活将待检血清用洗涤液稀释，每孔100uL，37作用1h。重复2.2环节。25 加入酶标抗体 用洗涤液将酶标抗体按工作浓度稀释，每孔100uL，37作用1h。重复2.2环节。26 加入底物（OPD-H22）：每孔100uL，室温避光显色25分钟。27 终结反映 每孔加入50uL终结液终结反映。28 测定OD值 在酶联免疫检测仪上490

12、nm波长处读数。29血清阴阳性鉴定原则拟定 取60份经中和实验检测为PRV抗体阴性猪血清，按1:20稀释后进行间接ELISA实验，测定490nm波长处OD值，规定以60份血清平均OD值加上3倍原则差作为鉴定阴阳性临界值。伪狂犬病乳胶凝集实验1材料准备：伪狂犬病乳胶凝集抗原、伪狂犬病阳性血清、阴性血清、稀释液，玻片，溶液配制见附录E(原则附录)2操作环节：21待检血清不须经热灭活或其他方式灭活解决22将待检血清用稀释液作倍比稀释后，各取15L与等量乳胶凝集抗原在干净干燥玻片上用竹签搅拌充分混合，在35分钟内观测成果；也许浮现如下几种凝集成果，即： 100%凝集：混合液透亮，浮现大凝集块 75%凝

13、集：混合液几乎透明，浮现大凝集块 50%凝集：约50%乳胶凝集，凝集颗粒较细 25%凝集；混合液浑浊，有少量凝集颗粒 0%凝集：混合液浑浊，无凝集颗粒浮现 如浮现50%凝集限度以上（含50%凝集限度），判为伪狂犬病抗体阳性，否则判为抗体阴性。如为阴性，可用微量中和实验进一步检测。伪狂犬病琼脂扩散实验1材料准备 琼脂扩散抗原、阴性血清和阳性血清；优质琼脂粉、平皿2操作环节21 0.8%琼脂板制作 将1克琼脂粉溶于100毫升Tris盐酸缓冲液(Tris 6.5克，NaCl 2.9克，NaN3 0.2克，蒸馏水 1000毫升，用HCl调pH值至7.2)中，趁热倾倒于玻璃平皿上，厚度为23mm，待冷却

14、凝集后，打孔，中央一孔，周边6孔，孔径为2mm，周边孔之间距离2mm，周边孔与中央孔间距为4mm6mm，用酒精灯微热封底。22加样 将琼脂扩散抗原加到中央孔中，周边孔加经热灭活待检血清，设阴性血清和阳性血清对照。置温盒37作用，2448小时后观测成果。23成果鉴定 在抗原孔与待检血清孔之间浮现白色沉淀线，抗体可判为阳性；如待检血清抗体水平较低，可以观测到与待检血清相邻阳性血清沉淀线末端略向抗原抗弯曲。阴性血清与抗原孔之间则没有沉淀线。伪狂犬病区别强弱毒感染鉴别乳胶凝集实验1猪伪狂犬病gG鉴别诊断乳胶凝集实验伪狂犬病gG鉴别诊断乳胶凝集实验是用伪狂犬病毒gG基因基因工程表达产物致敏乳胶抗本来检测

15、动物血清、全血或乳汁中抗gG蛋白抗体。用于伪狂犬病毒感染猪与gG基因缺失疫苗注苗猪免疫学鉴别诊断。11材料准备：伪狂犬病毒gG蛋白致敏乳胶抗原、伪狂犬病毒致敏乳胶抗原、伪狂犬病毒阳性血清和注射gG基因缺失疫苗血清、玻片、吸头等。12操作环节121对照实验 检测之前应做对照实验，浮现如下成果实验方可成立，否则应重试，如重试仍不浮现如下成果则停止使用：伪狂犬病毒阳性血清加gG蛋白致敏乳胶抗原呈阳性凝集；注射gG基因缺失疫苗血清加gG蛋白致敏乳胶抗原呈阴性凝集；伪狂犬病毒阳性血清与注射gG基因缺失疫苗血清加伪狂犬病毒致敏乳胶抗原均呈阳性凝集。122检测实验1221待检血清不须经热灭活或其他方式灭活解

16、决1222待检血清一滴，置于玻片上。加gG蛋白致敏乳胶抗原一滴，用牙签混匀，搅拌并摇动1-2分钟，于3-5分钟内观测成果(注：gG蛋白致敏乳胶抗原与血清反映凝集颗粒较细)；也许浮现如下几种凝集成果，即： “+”所有乳胶凝集，颗粒聚于液滴边沿，液体完全透明； “+”大某些乳胶凝集，颗粒明显，液体稍混浊； “+”约一半乳胶凝集，但颗粒较细，液体较混浊； “+”有少量凝集，液体呈混浊； “”液滴呈原有均匀乳状。以浮现“+”以上凝集者判为阳性凝集。2猪伪狂犬病gE鉴别诊断乳胶凝集实验伪狂犬病gE鉴别诊断乳胶凝集实验是用伪狂犬病毒gE基因基因工程表达产物致敏乳胶抗本来检测动物血清、全血或乳汁中抗gE蛋白

17、抗体。用于伪狂犬病毒感染猪与gE基因缺失疫苗注苗猪免疫学鉴别诊断。11材料准备：伪狂犬病毒gE蛋白致敏乳胶抗原、伪狂犬病毒致敏乳胶抗原、伪狂犬病毒阳性血清和注射gG基因缺失疫苗血清、玻片、吸头等。12操作环节121对照实验 检测之前应做对照实验，浮现如下成果实验方可成立，否则应重试，如重试仍不浮现如下成果则停止使用：伪狂犬病毒阳性血清加gE蛋白致敏乳胶抗原呈阳性凝集；注射gE基因缺失疫苗血清加gE蛋白致敏乳胶抗原呈阴性凝集；伪狂犬病毒阳性血清与注射gE基因缺失疫苗血清加伪狂犬病毒致敏乳胶抗原均呈阳性凝集。122检测实验1221待检血清不须经热灭活或其他方式灭活解决1222待检血清一滴，置于玻片

18、上。加gE蛋白致敏乳胶抗原一滴，用牙签混匀，搅拌并摇动1-2分钟，于3-5分钟内观测成果(注：gE蛋白致敏乳胶抗原与血清反映凝集颗粒较细)；也许浮现如下几种凝集成果，即： “+”所有乳胶凝集，颗粒聚于液滴边沿，液体完全透明； “+”大某些乳胶凝集，颗粒明显，液体稍混浊； “+”约一半乳胶凝集，但颗粒较细，液体较混浊； “+”有少量凝集，液体呈混浊； “”液滴呈原有均匀乳状。以浮现“+”以上凝集者判为阳性凝集。伪狂犬病区别强弱毒感染鉴别ELISA1伪狂犬病gG-ELISA鉴别诊断（间接法）伪狂犬病gG-ELISA鉴别诊断是用伪狂犬病毒gG基因基因工程表达产物包被ELISA板用来检测动物血清中抗g

19、G蛋白抗体。用于伪狂犬病毒感染猪与gG基因缺失疫苗注苗猪免疫学鉴别诊断。11材料准备：gG蛋白包被ELISA板、酶标抗体，底物（OPDH2O2），酶联免疫检测仪；溶液配制见附录F(原则附录)12 操作环节：12.1加入待检血清 待检血清经56oC30分钟灭活后用保温液作40倍稀释，每孔加入，37作用30min。12.2 洗涤 弃去孔内液体，每孔用200uL洗涤液洗3次，每次3min，用吸水纸拍干。12.3 加入酶标抗体 用洗涤液将酶标抗体按工作浓度稀释，每孔100uL，37作用30min,重复2.2环节。 124 加入底物（OPD-H2O2）：每孔100uL，室温避光显色25分钟。125 终结

20、反映 每孔加入50uL终结液终结反映。 126 测定OD值 在酶联免疫检测仪上490nm波长处读数。测定490nm波长处OD值，记为P值，阴性对照OD值记为N值，N值如不大于0.1时，按0.1计算，不不大于0.1时为实际值。当阳性对照孔OD值阴性对照OD值不不大于0.25时，实验成立。127成果鉴定：P/N2.1判为gG抗体阳性P/N1.9判为gG抗体阴性,1.9PN2.1,判为可疑2伪狂犬病gE-ELISA鉴别诊断（间接法）伪狂犬病gE-ELISA鉴别诊断是用伪狂犬病毒gE基因基因工程表达产物包被ELISA板用来检测动物血清中抗gE蛋白抗体。用于伪狂犬病毒感染猪与gE基因缺失疫苗注苗猪免疫学

21、鉴别诊断。21材料准备：gE蛋白包被ELISA板、酶标抗体，底物（OPDH2O2），酶联免疫检测仪；溶液配制见附录F(原则附录)22 操作环节：22.1加入待检血清 待检血清经56oC30分钟灭活后用保温液作40倍稀释，每孔加入，37作用30min。22.2 洗涤 弃去孔内液体，每孔用200uL洗涤液洗3次，每次3min，用吸水纸拍干。22.3 加入酶标抗体 用洗涤液将酶标抗体按工作浓度稀释，每孔100uL，37作用30min,重复2.2环节。 224 加入底物（OPD-H2O2）：每孔100uL，室温避光显色25分钟。225 终结反映 每孔加入50uL终结液终结反映。 226 测定OD值 在

22、酶联免疫检测仪上490nm波长处读数。测定490nm波长处OD值，记为P值，阴性对照OD值记为N值，N值如不大于0.1时，按0.1计算，不不大于0.1时为实际值。当阳性对照孔OD值阴性对照OD值不不大于0.25时，实验成立。227成果鉴定：P/N2.1判为gE抗体阳性P/N1.9判为gE抗体阴性1.9PN2.1,判为可疑伪狂犬病病毒血凝（HA）与血凝抑制（HI）实验办法 （一）红血球制备：将小白鼠尾尖剪断，插入盛有灭菌阿氏液离心管抽气瓶中，负压抽吸，采血完毕后，将离心管取出，用PBS洗涤3次，每次1 500转/分钟离心10分钟，使用时加PBS配成0.1%红血球悬液。 （二）待测血清预解决：取待

23、测血清0.1毫升加PBS 0.3毫升，56灭活30分钟，加入0.4毫升 25%白陶土25振荡1小时，离心取上清液加入0.1毫升配好0.1%红血球悬液37作用1小时,离心除去红血球,上清液作为1:8稀释血清用于HI实验. （三） HA实验操作:选用96孔V型板每孔加入PBS 50微升,在第一排孔前6孔内加入50微升 PrV病毒液,后两孔作为空白对照,用微量加样器作倍比稀释,从1:2至1:1024,即将第一排孔病毒液混匀后吸出50微升至第二排孔均匀混合,再从第二排孔吸出50微升至第三排孔,依次类推至最后一排孔取50微升弃掉,每孔加入50微升 0.1%红血球，在振荡器较微振荡混合均匀，以一定温度作用

24、2小时，观测成果，以完全凝集红血球最大稀释倍数作为一种血凝单位。 （四）HI实验操作：在96孔V型板中每孔加入50微升 PBS液，然后在第一排孔前6孔内加入50微升已解决血清作为对照，用微量加样器将血清倍比稀释从1：2至1：1 024，然后各孔加入50微升用PBS稀释好4个血凝单位病毒液，每孔分别加入50微升 0.1%红血球悬液，混合均匀后室温放置2小时，观测成果。(吴 斌 何启盖)进口伪狂犬病抗体检测试剂盒（用于普查）一、试剂 贮存在2-71PRV包被酶标板 5块2抗猪辣根过氧化物酶（HRP）连结物（酶标抗体） 60ml3PRV阳性对照血清 4ml4PRV阴性对照血清 4ml5样品稀释液 1

25、75ml6洗涤液（10） 250ml7TMB底物 60ml8终结液 60ml二、样品准备用样品稀释液按1：20稀释待检血清。（如20ul样品加380ul样品稀释液）。注意：阴、阳性对照不稀释。每同样品必要更换吸嘴，并记录样品在板上位置，在样品加到酶标孔内之前必须混合均匀。三、洗涤液准备浓缩洗涤液（10）应置室温并摇动使沉淀盐能充分溶解。在用之前，浓缩洗涤液（10）应用蒸馏水或去离子水接1：10稀释（如30ml浓缩洗涤液加 270ml蒸馏水或去离子水即可用于一块板洗涤）。四、实验过程在使用之前所有试剂必要置室温并轻轻摇动或涡旋。1取出酶标板并记录样品在板上位置。2在A1、A2、A3孔内各加未稀释

26、阴性对照100ul。3在A4、A5、A6孔内各加未稀释阳性对照100ul。4加100ul已稀释样品（1：20）到相应孔内，每同样品应同步做2孔。5室温作用30分钟。6倾去孔内液体到废液缸内。7每孔用近300ul洗涤液洗3-5次，每次洗后倾去孔内液体。在加酶标抗体之前应避免孔内干燥，最后一次洗涤后应在吸水材料上拍干酶标板。8在每一孔内加入100ul抗猪酶标抗体。9室温作用30分钟。10重复环节6和7。11在每一孔内加入TMB底物溶液100ul。12室温显色15分钟。13每一孔内加入100ul终结剂以终结反映。14空气调零。15在650nm测量并记录样品和对照吸取值。16计算成果。五、成果 阳性对

27、照平均值（PCX）与阴性对照平均值（NCX）之差（P-N）不不大于或等于0.15时实验方成立。并且阴性对照平均值（NCX）必要不大于或等于0.15。如果实验不成立，也许操作有误，实验应在熟悉产品阐明书后重试。每同样品内针对PRV抗体有无是由样品与阳性对照比率（S/P）来拟定。阳性对照已原则化且有很高水平PRV抗体。六、成果阐明1S/P比值不大于0.4样品拟定为PRV抗体阴性。2S/P比值不不大于或等于0.4样品拟定为PRV抗体阳性。在该实验中定为阳性样品应再用“伪狂犬病抗体确认试剂盒”来进一步证明其阳性真假。七、计算1阴性对照平均值（NCX）计算 A1A（650）+A2A（650）+A3A（6

28、50） 0.06+0.063+0.069NCX= 例如：=0.064 3 3 2阳性对照平均值（PCX）计算 A4A（650）+A5A（650）+A6A（650） 0.313+0.299+0.33NCX= 例如：=0.314 3 3 3S/P比值计算 例如：某样品平均值=0.350 Sample A（650）NCX 0.350-64 0.286S/P= S/P= = =1.14 PCXNCX 0.314-0.064 0.250（华中农大覃雅丽、唐勇译）伪狂犬病gE抗体试剂盒（进口）一、试剂 贮存在2-71.PRV包被酶标板 6块2.抗 PRV-gE辣根过氧化物酶（HRP）连结物（酶标抗体） 6

29、0ml3.阴性猪血清对照-不与PRV-gE 反映猪血清 5ml4.阳性对照血清-抗PRV-gE 5ml5.样品稀释液 120ml6.洗涤液（10） 235ml7.TMB底物 60ml8.8终结液 60ml二、样品准备用样品稀释液按1：2 比例稀释待检血清。每同样品必要更换吸嘴，样品加到酶标孔内之前必要混合均匀。三、洗涤液准备浓缩洗涤液（10）应平衡到室温，摇动使沉淀盐能充分溶解。在用之前，浓缩洗涤液（10）应用蒸馏水或去离子水按1：10稀释（如30ml浓缩洗涤液加 270ml蒸馏水或去离子水即可用于一块板洗涤）。四、实验过程在使用之前所有试剂必要平衡到室温，用前轻轻摇动混匀。1取出酶标板在记录

30、纸上标记好样品在板上位置。2在A1、A2、A3孔内各加100ul阴性对照（ 1:2 稀释）。3在A4、A5孔内加入100ul阳性对照（1:2 稀释）。4加100ul已稀释样品（1：2）加到相应孔内。5于室温放置1小时或者于2-7过夜 。6倾去孔内液体到废液缸内。7每孔用近300ul洗涤液洗3-5次，每次3-5分钟。每次洗后倾去孔内液体，在洗涤过程中应避免孔内干燥，最后一次洗涤后应在吸水材料上拍干酶标板。10在每一孔内加入100ul抗PRV- gE酶标抗体。11室温放置20分钟。10重复环节6和7。17在每一孔内加入TMB底物溶液100ul。18室温显色15分钟。19每一孔内加入100ul终结剂以终结反映。20 对空调零。21在650nm测量并记录样品和对照吸取值。22计算成果。五、成果 阳性对照平均值（PCX）与阴性对照平均值（NCX）之差（P-N）不不大于或等于0.3时实验方成立。如果实验不成立，也许操作有误，实验应在熟悉产品阐明书后重试。每同样品内针对PRV-gE抗体有无是由样品与阴性对照比率（S/N）来拟定。