质粒转入大肠杆菌.docx

1、质粒转入大肠杆菌摘要：将受体菌与质粒DNA混匀直接在Ca2+离子选择平板上进行转化和筛选，其转化过程仅需2 min左右，并能得到105以上的转化效率, 可满足一般克隆工作的需要。关键词：转化;大肠杆菌;Ca2+选择平板中图分类号：Q933，Q93.039文献标识码：B文章编号：0253-9772(1999)04-0048-51A Simple and Rapid Method for the Transformationof Escherichia coli by PlasmidsGUO Pei-yi,CHEN Xiang-dong,XIE Zhi-xiong,SHEN Ping(Colleg

2、e of Life Sciences,Wuhan University,Wuhan430072,China)Abstract：After mixing the recipient cells and plasmids DNA, directly spread the mixture on selective media containing Ca2+. The whole process of transformation just needs 2 min or so, and could acquire the transformation efficiency of more than 1

3、05, which is enough to common gene cloning.Key words:Transformation;Escherichia coli;Ca2+ selective plate转化是分子克隆中将外源DNA导入受体细胞的关键技术，自1970年Mandel和Higa发现用CaCl2处理的细菌细胞可被噬菌体DNA转染后1，接着在1972年和1973年Cohen等人用同样的方法首次成功地将R因子和重组质粒DNA导入大肠杆菌细胞（Escherichia coli）2, 3，而成为基因工程的创始人。此后在转化技术上虽有过不少的改进，但都旨在如何提高转化效率上46，自70年

4、代中期以来, 使转化效率作为分子克隆中限制因素的时代已一去不复返了7, 8。但就方法本身而言一直没有大的变化，而是作为一种常规转化技术一直沿用至今810。该转化技术主要由三部分组成8：（1）用CaCl2诱导受体细胞使其成为感受态；（2）DNA转化受体细胞；（3）涂布平板筛选转化重组子。一般至少需要2 h完成。我们这里介绍一种十分简便迅速的质粒平板转化方法，该方法删除了常规方法中十分费时、繁杂的（1）和（2）二部分的操作，而是直接在Ca2+选择平板上一次完成，整个过程仅需2 min左右，转化效率与常规方法相当，足以满足一般克隆工作的需要。1材料和方法1.1菌株大肠杆菌（E. coli）TG1、H

5、B101、DH5，本实验室保存。1.2质粒pBR322 购自华美生物工程公司；重组质粒pJH由本实验室构建11；枯草杆菌-大肠杆菌穿梭重组质粒pBE2，中科院微生物学研究所郭兴华先生馈赠12。1.3试剂、培养基及主要缓冲液Bacto-Tryptone及Yeast extract为英国Oxiod公司生产；氨苄青霉素由华北制药厂生产；RNase、Protease K、BamHI、DNA Marker等均购自华美生物工程公司；其它化学试剂均为分析纯产品。LB培养基及用于质粒提取、检测的各种缓冲溶液均参照Sambrook等的方法配制8，而用于平板转化的Ca2+选择平板是在LB固体培养基加入单独灭菌的C

6、aCl2和氨苄青霉素 （终浓度分别为100 mmol/L和100 mg/ml）。1.4实验方法质粒的提取、纯化、酶切、琼脂糖凝胶电泳等均参照文献8。传统的CaCl2处理转化方法参见文献8略做修改：(1) CaCl2处理法制备感受态大肠杆菌：挑取受体菌单菌落接种于5ml LB培养液，37培养过夜，以1/100量接种于LB培养基活化至OD600=0.40.6。取菌液1ml，冰浴10min，412 000 r/min离心2030 s收集菌体，弃上清，重悬于1ml经预冷的100 mmol/L CaCl2中，冰浴2040 min，412 000 r/min离心2030 s收集菌体，弃上清，重悬于0.2m

7、l经预冷的100 mmol/L CaCl2中，冰浴27 h；(2) 转化：将10 l质粒DNA（1ng/l）与200 l感受态细胞溶液混匀，经冰浴2040 min、42水浴34 min、冰浴12 min处理后，加等体积2倍LB培养液，37水浴温育1h；(3) 转化子的检测：涂布20 l转化混合物于加相关抗生素的LB选择平板，37倒置培养约20 h，筛选转化子。平板转化法：挑取受体菌单菌落接种于5ml LB培养液，37培养过夜，以1/100量接种于LB培养基活化23 h（OD6000.50.55），取菌液1ml，12 000 r/min离心2030 s收集菌体，重悬于200 l LB培养液，加入

8、10 l质粒DNA（1ng/l），混匀，取20 l转化混合物涂布于4下预冷的含Ca2+和相关抗生素的选择平板，37倒置培养约20 h，筛选转化子。2结果与分析2.1平板法与传统的CaCl2处理方法的转化效率将质粒pBR322分别用二种方法转化经常用的三种大肠杆菌受体菌株TG1，HB101和DH5，结果（表1）显示，新方法所能达到的转化效率与传统方法相当，可达105转化子/gDNA，足以满足一般常规克隆的需要。为了进一步证实新方法的适用性，我们又将不同的质粒分别转化同一受体菌。这些质粒包括松弛型质粒pBR322，带有古细菌启动子的重组质粒pJH，以及穿梭质粒pBE2。表2显示用TG1为受体的转化

9、效率比较，其结果表明新方法对所用的三种质粒均显示出与传统方法相当的转化效率，以其它菌株为受体也获得类似的结果，说明该方法具有很好的适用性。表1及表2中的数据均为3次独立实验结果的平均值。表1二种转化方法对不同受体菌株的转化效率比较菌株 传统方法的转化效率（平均转化子数ugDNA） 平板转化法的转化效率（平均转化子数/ugDNA）TG1 5.1105 1.84105HB101 4.3105 2.1105DH5 1.8105 0.89105表2二种转化方法对不同质粒DNA的转化效率比较质粒 传统方法的转化效率（平均转化子数ugDNA） 平板转化法的转化效率（平均转化子数/ugDNA）pBR322

10、5.1105 1.84105pJH 4.6105 1.9105pBE2 0.94105 1.01052.2转化子的检测任意挑取34个用新方法转化所得到的转化子进行质粒检测，均能检测到质粒，而且酶切结果（图1）也显示，不同转化子所携带质粒的大小及酶切位点均完全与原转化质粒DNA相同，说明所采用的平板转化方法具有与传统转化方法相同的质粒转化特点13。此外，用从转化子中提取的质粒，采用新方法重新转化受体菌，仍可以获得相似的转化结果，说明采用新方法对质粒的转化活性也无影响。 1.DNAHind Marker2.pBR322转化子质粒3.pBR322转化子质粒BamHI4.pBR322BamHI5.pB

11、E2转化子质粒6.pBE2转化子质粒BamHI7.pBE2BamHI8.pJH转化子质粒9.pJH转化子质粒BamHI10.pJHBamHI图1新方法转化子质粒及其酶切的凝胶电泳检测2.3Ca2+浓度对转化率的影响Ca2+浓度是影响转化的重要因素8，为了找到Ca2+选择平板中最适的Ca2+浓度，我们以不同Ca2+浓度的选择平板进行了pBR322转化大肠杆菌TG1的实验。结果（图2和表3）表明，平板转化和传统方法一样需要通过Ca2+的处理促使细胞建立感受态才能进行有效的质粒DNA转化8，并随着转化体系中Ca2+浓度的增加，转化效率逐渐升高，在Ca2+浓度达到80100 mmol/L时，可以获得最

12、高的转化效率。而Ca2+浓度进一步升高，超过120mmol/L后，转化效率明显下降，这可能与平板中的高离子浓度抑制了细胞的生长有关。图2Ca2+浓度对转化效率的影响表3Ca2+浓度对转化效率的影响CaCl2(mmolL) 0 20 40 60 80 100 120 140 160转化效率(g) 0 100 525 39900 128000 119000 54600 1200 03讨论(1)CaCl2处理对于诱导大肠杆菌受体细胞感受态的形成具有重要作用,在传统的转化方法中，CaCl2处理及转化都是在液体条件下完成的8。而本实验的结果证明，在一定的离子浓度范围内CaCl2同样可以诱导涂布到平板上的

13、受体细胞建立感受态，并进行质粒DNA的转化。采用这种平板转化方法所得到的转化子菌落较传统方法形成的转化子菌落略小，说明培养基中的CaCl2可能在一定程度上对细菌的生长有抑制作用。(2) 在传统的转化方法中转化过程的变温处理被认为对转化率的提高具有崐重要意义8。我们在实验中也发现将受体菌和转化DNA混合后涂布到事先预冷的平板上比使用未经预冷的平板能得到更高的转化效率，但两者间的差异不超过一个数量级（分别为1.8105和3.0104转化子/g DNA），该现象在Baur等最近的研究报道中也有反映14。(3)本文介绍的质粒转化大肠杆菌的新方法将受体细胞感受态的诱导建立、质粒DNA转化及转化子的筛选等

14、步骤合并在Ca2+选择平板上一步完成，与传统方法相比，具有操作简便易行的优点，整个转化过程仅需2 min左右，无需其他特殊仪器及试剂，且转化率与传统方法基本相当，足以满足一般常规克隆的需要。同时，用平板转化代替液体转化，对进一步揭示大肠杆菌的DNA转化机理也有一定的方法学上的意义14。基金项目：国家自然科学基金（39670397）资助项目。目的楼主的问题问的有些不明白。质粒是原核生物的细胞质中游离的环状DNA双链结构，由于构造简单等特点，常常用于基因工程的载体，即将目的基因导入到质粒中，然后将重组质粒导入到受体细胞中去，目前比较成熟的是导入到原核生物中去，诸如大肠杆菌，这样，大肠杆菌就能表达我

15、们所需要的形状。评论|102011-03-09 10:42huaizheng2010|四级质粒是真核细胞细胞核外或原核生物拟核区外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器（主要指线粒体和叶绿体）中和细菌细胞拟核区以外的环状脱氧核糖核酸(DNA)分子。现在习惯上用来专指细菌(大肠杆菌）、酵母菌和放线菌等生物中细胞核或拟核中的DNA以外的DNA分子。在基因工程中质粒常被用做基因的载体(Vector)。许多细菌除了拟核中的DNA外，还有大量很小的环状DNA分子，这就是质粒(plasmid)（补充：部分质粒为RNA）。质粒上常有抗生素的抗性基因，例如，四环素抗性基因或卡那霉素抗性基因等。有些质

16、粒称为附加体(episome)，这类质粒能够整合进真菌的染色体，也能从整合位置上切离下来成为游离于染色体外的DNA分子。质粒在宿主细胞体内外都可复制！ 通过个些特性，人们可以把一些目的DNA片断构建在质粒中，通过转化入大肠杆菌中，不断的复制，来得到目的产物。这就是转化的目的。是不是农杆菌转化法：1、获取目的基因。用限制性核酸内切酶切割下目的基因。 2、基因表达载体的构建。将目的基因与载体（大多数选用质粒）用DNA连接酶连接起来。 3、将目的基因导入受体细胞。将含目的基因的重组质粒导入农杆菌（农杆菌为受体细胞）。 4、目的基因的检测与鉴定。用DNA分子杂交技术/分子杂交技术/抗原-抗体杂交/个体

17、生物学水平鉴定。 5、最后将成功表达的细胞导入植物体内，对植物体进行个体生物学水平鉴定。 原理所谓的转化是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的mob基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。细胞处于能够吸收DNA的状态称感受态，处于感受态的细胞称作感受态细胞。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变

18、异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体（R，M），它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞。进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子（即带有异源DNA分子的受体细胞）。提问者评价大肠杆菌感受态细胞的制备原理、步骤以及重组质粒转化一、目的1.了解感受态细胞生理特性及制备条件，掌握大肠杆菌感受态细胞制备方法。2.掌握质粒DNA转化大肠杆菌的方法，了解转化的条件和利用半乳糖苷酶基

19、因插入失活选择重组质粒DNA的原理。二、原理（一）大肠杆菌感受态细胞制备的原理所谓感受态，是指细菌生长过程中的某一阶段的培养物，只有某一生长阶段中的细菌才能作为转化的受体，能接受外源DNA而不将其降解的生理状态。感受态形成后，细胞生理状态会发生改变，出现各种蛋白质和酶，负责供体DNA的结合和加工等。细胞表面正电荷增加，通透性增加，形成能接受外来的DNA分子的受体位点等。本实验为了把外源DNA（重组质粒）引入大肠杆菌，就必须先制备能吸收外来DNA分子的感受态细胞。在细菌中，能发生感受态细胞是占极少数。而且，细菌的感受态是在短暂时间内发生。目前对感受态细胞能接受外来DNA分子的本质看法不一。主要有

20、两种假说：1、局部原生质体化假说细胞表面的细胞壁结构发生变化，即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，使DNA分子能通过质膜进细胞。证据有：（1）发芽的芽孢杆菌容易转化；（2）大肠杆菌的原生质体不能被噬菌体感染，却能受噬菌体DNA转化；（3）适量的溶菌酶能提高转化率。2、酶受体假说感受态细胞的表面形成一种能接受DNA的酶位点，使DNA分子能进入细胞。证据是：（1）蛋白质合成的抑制剂如氯霉素，可以抑制转化作用；（2）细胞分裂过程中，一直有局部原生质化，但感受态只在生长对数期的中早期出现；（3）分离到感受态因子，能使非感受态细胞转变为感受细胞。目前对感受态细胞的转化理论尚未有统一结论，但是许多实验室一直

21、进行探索，试图从实验中获得明确回答。有人根据pBR322质粒DNA对EcoliK12X1776菌株的转化结果，认为：近来，在许多研究室都发现CaCl2对受体菌处理，可提高转化效率几十倍，通常把细胞悬浮在pH6.0的100mmol/LCaCl2中，在冰浴条件下，放置过夜，转化率转高，但一过24小时，转化率测恢复为原来的水平。（二）重组DNA的转化原理我们已经制备好大肠杆菌感受态细胞，接下的实验是把重组的DNA引入受体细胞，使受体菌具有新的遗传特性，并从中选出转化子。作为受体的大肠杆菌C600或DH5，必须不同外来DNA分子发生遗传重组，通常是rec基因缺陷型的突变体，同时它们必须是限制系统缺陷或

22、限制与修饰系统均缺陷的菌株。这样外来的DNA分子不会受其限制酶的降解。保持外来DNA分子在受体细胞中的稳定性。制备的大肠杆菌细胞就具有这三种缺陷（rk-mk-rec-）同时此受体细胞还是氨苄青霉素敏感（Ap）。在体外构建好的重组分子上具有分解氨苄青霉素（Ap）基因存在，当它导入受体细胞后，就赋于这些受体细胞新的特性，即Ap抗性。同时载体质粒上具有乳糖操纵的一半乳糖苷酶基因(lacZ)，我们可以利用外源基因插入载体一半乳糖苷酶基因(lacZ)，使其失去一半乳糖苷酶活性的原理来选择新构建的重组子。因pUC18带有Ampr基因而外源片段上不带该基因,故转化受体菌后只有带有pUC18DNA的转化子才能

23、在含有Amp的LB平板上存活下来;而只带有自身环化的外源片段的转化子则不能存活。此为初步的抗性筛选。pUC18上带有-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列和-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码序列。这个编码区中插入了一个多克隆位点,但并没有破坏lacZ的阅读框架,不影响其正常功能。E.coliDH5菌株带有-半乳糖苷酶C端部分序列的编码信息。在各自独立的情况下,pUC18和DH5编码的-半乳糖苷酶的片段都没有酶活性。但在pUC18和DH5融为一体时可形成具有酶活性的蛋白质。这种lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的-半乳糖苷酸阴性突变体之间实现互补的现象叫-互补。

24、由-互补产生的Lac细菌较易识别，它在生色底物X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)存在下被IPTG(异丙基硫代-D-半乳糖苷)诱导形成蓝色菌落。当外源片段TGF插入到pUC18质粒的多克隆位点上后会导致读码框架改变,表达蛋白失活,产生的氨基酸片段失去-互补能力,因此在同样条件下含重组质粒的转化子在生色诱导培养基上只能形成白色菌落。由此可将重组质粒与自身环化的载体DNA分开。此为-互补现象筛选。本实验是把外来重组分子和感受态细胞在低温下混合，使其进入受体细胞。DNA分子转化的原理较复杂：1、吸附完整的双链DNA分子吸附在受体菌表面。2、转入双链DNA分子解链，单链DNA分子进入受体

25、菌，另一链降解。3、自稳外源质粒DNA分子在细胞内又复制成双链环状DNA。4、表达供体基因随同复制子同时复制，并被转录和翻译5.无菌条件下将上述1毫升菌液倒入1.5毫升EP离心管中（离心管应带盖并高压灭菌过），每组2支。6、带菌液的离心管置于冰上10分钟，冷却菌液，平衡好，置于台式低速离心机上，3500r/min离心5分钟。7、无菌条件下，倒去上清LB，倒斜离心管，让LB流干，留下沉淀菌体，加入预冷的100mmol/LCaCl2溶液600微升，用微量取样器轻轻吸冲底部沉淀菌体，使其悬浮后，把2支管转为1支，摇匀后于冰浴中放置30分钟。8、重新将CaCl2菌悬浮液置于台式低速离心机上，3500r

26、/min离心10分钟，小心侧倒掉上清CaCl2，留沉淀菌体。9、再把菌体悬浮在200微升100mmol/LCaCl2的溶液中，置于冰上作为转化的受体菌液。此制备的感受态细胞应在此步后1小时至24小时内使用，效率比较高。10.在事先制备好的含50g/mlAmp的LB平板表面加40mlX-gal储液和4lIPTG储液,用无菌玻棒将溶液涂匀,置于37下放置3-4小时,使培养基表面的液体完全被吸收，备用。（二）重组DNA转化1.取0.2ml大肠杆菌感受态细胞，在无菌条件下，加入到连接液的Eppendorf管，混匀，置冰浴中30分钟。2.冰浴后，将正在转化反应的细胞悬浮液加入已调好42的的恒温水浴槽内，

27、保温2分种。3.热冲击处理后的细胞易死亡，应迅速倒入LB培养液1毫升，（无抗菌素LB液，有助于基因表达）马上置37水浴1小时，每10分钟翻转1次。4.用移液器取0.1毫升的转化菌液直接涂布含50g/mlAmp、40mlX-gal储液和4lIPTG储液LB固体平皿上，共涂布三个培养皿。5.用移液器取未经转化的受体大肠杆菌感受态菌液0.1毫升直接涂布于含50g/mlAmp、40mlX-gal储液和4lIPTG储液LB固体平皿上，作为受体菌对照。6.将第14、15步涂布培养皿先放室温15分钟左右，使涂布上的菌液干燥不会流动。然后倒置放于恒温箱中37培养过夜。7.第二天取出培养皿，观察对照平皿和转化平皿菌落情况。对照平皿因受体菌对Amp敏感，故不能在含Amp的培养基上生长。转化平皿是否有兰色和白色菌落生成？如果长出兰色菌落，说明自连的载体pUC18质粒已转入受体菌，但目的基因没有接入载体。如果长出白色菌落，说明目的基因已接入载体，重组质粒的转化子因此丧失了-半乳糖苷酶活性,在x-gal和ITPG存在的生色诱导培养基上只能形成白色菌落。五、结果和讨论比较对照平皿和转化平皿，讨论转化成败原因. （注：可编辑下载，若有不当之处，请指正，谢谢!）