丹参酮IIA磺酸钠稳定性试验.docx

1、丹参酮IIA磺酸钠稳定性试验第6章 丹参酮IIA磺酸钠相关杂质及稳定性分析6.1 丹参酮IIA磺酸钠相关杂质及结构鉴定丹参酮IIA磺酸钠原料在生产和储存过程中都会出现稳定性问题，如酸性增强、含量降低等现象，质量标准中监控其相关物质成为必要，提供高纯度的相关物质对照品成为很大挑战。随着药品质量标准提高，ICH要求尽可能提供单杂大于0.1%的相关物质结构和可能的产生机制，构效关系和药理毒数据等。因此我们从丹参酮IIA磺酸钠原料生产过程中的精制母液中分离纯化获得相关物质，并和丹参酮IIA磺酸钠原料中的相关物质进行HPLC对照，再通过LC-MS和1H-NMR分析，最终确定其结构。Baolin Wang

2、 等从丹参酮IIA磺酸钠原料过色谱分离纯化、LC-MSn和NMR鉴定推测出八种相关物质；Qiaogen Zou等从丹参酮IIA磺酸钠 原料过色谱分离纯化、UV、LC-MS和NMR鉴定推测出六种相关物质。而其磺化过程中的副产物和杂质成分研究还不够完善，我们通过制备液相技术分离纯化丹参酮IIA磺酸钠精制母液中的组分，寻找确定丹参酮IIA磺酸钠原料中的相关物质，通过分子量和氢谱数据鉴定出三种相关物质结构，分别确证为丹参酮IIB磺酸钠（2）、丹参酮I磺酸钠（4)紫丹参甲素磺酸钠（5/6），其中4已作为药典标准中的杂质对照品（中国药典2000年版二部附录VB），但2和5/6尚未见有文献报道得到纯物质。1

3、,26.1.1 仪器与原料Varian SD-1液相制备及色谱装填系统，色谱柱L&L4001,1 inch.25cm，色谱柱4002 ,2inch,25cm；孔径12nm粒径5m色谱填料ODS-AQ100g，理论工作压力1500psi，YMC;孔径12nm粒径10m色谱填料PLRP-S150g，理论工作压力650psi，Angilent Technologies；Waters2695/2489高效液相色谱仪；色谱柱Angilent Extend C18 5m，4.615cm；400M核磁共振波谱仪，NMR Avance III 400MHz，瑞士公司；超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱联用仪，

4、ACQUITYTIMUPLC&Q-TOF MS Premier，USA Waters公司。 丹参酮IIA磺酸钠车间精制母液（自制）；纯化水；甲醇，HPLC,Tedia、Fisher Scientific 和Merk；三乙胺（TEA),HPLC,Tedia。6.1.2 方法6.1.2.1 样品前处理 丹参酮IIA磺酸钠车间精制母液进行相关物质富集前先在37条件下减压旋蒸结晶后滤纸过滤在经过0.22m有机相微孔滤膜做过滤除菌处理。6.1.2.2 富集和进一步纯化 选用装填PLRP-S聚合物填料的Varian L&L4002色谱柱。实验体系为甲醇/水，20%80%梯度洗脱，流速为100mL/min，

5、检测波长为271nm。根据紫外检测结果实时收集样品。6.1.2.3 二步纯化及精制 选用装填ODS-AQ硅胶填料的VarianL&L4002色谱柱。实验体系为0.1%TEA-甲醇/0.1%TEA-水，20%60%梯度洗脱，流速为25mL/min，检测波长为271nm。根据紫外检测结果实时收集样品。6.1.2.4 HPLC检测 在富集、纯化精制过程中采用HPLC方法对样品组成及含量进行全程监测。HPLC监测体系为：Agilent Extend C18，5m，4.6*150mm,流速为1mL/min，检测波长为271nm。6.1.2.5冻干 经HPLC检测纯度98%的样品进行冻干保存。6.1.2.

6、6结构鉴定 将完成冻干的样品，进行LC-MS和1H-NMR检测。6.1.3结果与讨论6.1.3.1丹参酮IIA磺酸钠原料与精致母液的相关物质组成图1丹参酮IIA磺酸钠原料HPLC检测图谱 丹参酮IIA磺酸钠原料HPLC检测结果见图1。根据图中结果显示，丹参酮IIA磺酸钠原料中含有5%左右的总杂含量，主要包含了六中相关物质（编号1,2,3,4,5,6)，其保留时间分别为13.122min，13.474min，15.576min，17.139min，19.196min及19.433min。其中，4为已确认的丹参酮I磺酸钠，并作为药典标准中的相关物质对照品（中国药典2000年版二部附录VB），而其余

7、相关物质药典未提供相对关照品。 为简化相关物质的富集工作，采取从车间精制母液中富集提取相关物质的方法。丹参酮IIA磺酸钠车间精制母液HPLC检测结果见图2。图中结果显示，精制母液中含有保留时间为13.495min（a）和19.122（b）的相关物质，其含量分别为15.6%和32.6%，远高于原料中相关物质含量。图2丹参酮IIA磺酸钠车间精制母液HPLC检测图谱6.1.3.2相关物质的富集与一步纯化根据图3结果显示，利用L&L4002柱进行一次富集后，可获得HPLC纯度达到40%50%的相关物质样品。图3富集后相关物质a（3.3-1）和b（3.3-2）的HPLC检测图 一步纯化体系同富集体系，梯

8、度洗脱20%60%。根据图4结果显示，经过一步纯化后，相关物质a、b纯度已达到80%。图4一步纯化后相关物质a（3.4-1）和b（3.4-2）的HPLC检测图6.1.3.3二部纯化及精制相关物质的二步纯化及精制过程选用装填ODS-AQ硅胶填料的Varian L&L4001色谱柱。实验体系为0.1%TEA-水。根据图5的结果可见，经过二步纯化和精制两步骤，获得纯度98%的a和b。样品加入丹参酮IIA磺酸钠原料，根据HPLC结果推出a可能为相关物质2，b可能为相关物质5和6。图5二步纯化和精制后相关物质a（3.5-1）和b（3.5-2）的HPLC检测图6.1.3.4结构鉴定与解析相关物质2为无定形

9、红棕色粉末，如图6所示，LC-MS测得其分子离子峰C19H17O7S（M-Na-）质荷比（m/z）为389.0.1H-NMR（D2O,400MHz，ppm）数据（见图7）显示，两个甲基氢化学位移信号H7.530（1H，J=8.0HZ，d，H-6）和H7.181（1H，J=8.0HZ，d，H-7）；三个亚甲基氢化学位移信号2.680-2.730（2H，m，H-1），H1.401-1.083（2H，m，H-19），化学位移受离子对试剂TEA残留干扰，最终确定其结构如图8所示，为丹参酮B磺酸钠。图6丹参酮IIA磺酸钠相关物质2 LC-MS数据图7丹参酮IIA磺酸钠相关物质21H-NMR数据相关物质4

10、为无定形褐色粉末，其在HPLC检测体系中保留时间为17.1min。MS测得其分子离子峰C18H11O6S（M-Na-)质荷比（m/z）为355.0265，根据1H-NMR（D3COD,400MHz，ppm）数据显示，两个甲基氢化学位移信号H2.49（3H，s，H-19），五个苯 氢 化 学 位 移 信 号H9.260（1H，J =8.8Hz，d，H-1），H7.532-7.572（1H，m，H-2），H7.406（1H，J =6.8Hz，d，H-3）,H8.478（1H,J =8.8Hz，d，H-6），H8.004(1H，J =8.8Hz，d，H-7）。相关物质4目前尚在研究中，推测其为丹参酮

11、磺酸钠，结构结构如图8所示。相关物质5/6为无定形红棕色粉末，LC-MS测得其分子离子峰C19H17O7S（M-Na-）质荷比（m/z）为389.0,1H-NMR(D20,400 MHz，ppm）数据显示，两个苯氢化学位移信号H4.789（2H，m，H-2）和H1.530-1.635（2H，m，H-3）；-CH2OH氢化学位移信号H4.789（2H，s，H-17），化学位移受离子对试剂TEA残留干扰。目前推测其为紫丹参甲素磺酸钠，结构结构如图8所示。图8推测丹参酮IIA磺酸钠相关物质化学结构表1丹参酮IIA磺酸钠相关物质HPLC检测及MS数据相关物质tR(min)M-Na-（m/z）化学结构2

12、13.19389丹参酮IIB磺酸钠417.02355丹参酮I磺酸钠（推测）5/619.14389紫丹参甲素磺酸钠（推测）丹参酮IIA磺酸钠21.2373丹参酮IIA磺酸钠 综上，通过分子量和氢谱数据鉴定出三种相关物质结构，其中相关物质2确证为丹参酮B磺酸钠（Sodium Tanshinone IIB Sulfonate)，相关物质4和相关物质5/6还有待进一步研究确认，目前推测其分别为丹 参 酮 磺 酸 钠 （Sodium Tanshinone I Sulfonate，4）和紫丹参甲素磺酸钠（Sodium Tanshinone I Sulfonate，5/6）。其中2的标准纯物质尚未被报道过，

13、见表1。 丹参酮IIA磺酸钠相关物质产生主要来源于丹参酮A原料中丹参组织来源的丹参酮A结构类似物引入合成工艺中磺化反应过程，产生副反应产物，在精制过程重结晶时的共结晶沉淀，以及丹参酮IIA磺酸钠原料制备和保存过程中的降解反应等。相关物质4、5/6目前限于LC上难以区分，其准确定位有待进一步研究。6.2 丹参酮IIA磺酸钠稳定性分析 丹参酮IIA磺酸钠是从中药丹参中提取丹参酮IIA，经磺化后得到的水溶性钠盐。由于用来制备丹参酮IIA磺酸钠的原料丹参酮IIA，是经过药材提取纯化所得，因此不可避免的含有其它丹参酮类化合物，同时，磺化过程中也会产生很多副产物，反应产物经过结晶后，除去了其部分的杂质，但

14、仍有微量杂质存在。而目前，丹参酮IIA磺酸钠研究主要还是集中在其药理活性的探讨上，原料药中的微量杂质成分的研究还是空白。基于此方面的考虑，我们准备进行初步的研究。国家标准记载丹参酮IIA磺酸钠（见国家药品标准WS-10001-（HD-0923）-2002）的性状为：本品为砖红色结晶性粉末；无臭，味微苦；有吸湿性；遇高热，见光色渐变深。在热水中溶解，在甲醇或乙醇中略溶，在氯仿中不溶。从上面的叙述中我们可以知道，丹参酮IIA磺酸钠对光和热不稳定，不利于长时间加热和光照，且具有吸湿性。稳定性试验的目的是考察原料在温度，湿度，光线的影响下随时间变化的规律。根据丹参酮IIA的特点和我公司的实际情况，我们

15、将温度作为重点考察因素作一系列的试验。样品选择：抽取6批丹参酮IIA磺酸钠作为供试品，批号分别为：1207154，1207156，1208168，1208170，1208171，1208174。储存条件：以上每批样品分为5份，分别放置于0-10，室温，30，40，50环境中保存，定期抽样检测。抽样频率：试验起始之日起，每月取样一次，持续半年，共计7次。检测项目：含量测定和相关物质检测。丹参酮IIA磺酸钠稳定性数据见表6.1。为了更清晰直观的进行观察分析，将试验数据转化为图表形式表现，见图6.2。根据图6.2结果显示，环境温度越高，丹参酮IIA磺酸钠的杂质含量也越高。在高温环境中（30度、40度、50度），杂质含量随着储存时间增长而增大。而在0-10度环境和常温下，杂质含量趋于平稳。由此可以证明，丹参酮IIA磺酸钠对高温不稳定。1Baolin Wang et al.Isolation and structure characterization of related impurities in Sodium Tanshinone IIA Sulfonate by LC/ESI-MSn and NMR.JournalOf Pharmaceutical and Biomedical Analysis.2012,67(68):36-41.2Qia