VPA01000红霉素中二氯甲烷残留检验方法验证方案0112.docx

1、VPA01000红霉素中二氯甲烷残留检验方法验证方案0112红霉素中二氯甲烷和三氯甲烷残留检验方法验证报告Validation Report of Methylene Chloride and Chloroform Residue Test Method in Erythromycin验证方案编号：VP-A-012-00版 本 号：00目 录1.概述 21.1产品概述 21.1.1产品名称 21.1.2产品化学结构式 21.2方法建立概述 22.检测方法 32.1溶剂残留接受标准 32.2 方法描述 32.2.1 仪器 32.2.2 试剂 32.2.3 溶液配制 32.2.4 色谱条件 32.

2、2.5 系统适应性 42.2.6 计算 43 验证内容 53.1 试剂及仪器 5A检测用试剂 5B样品 5C仪器和设备 53.2 验证溶液配制 53.3 操作 63.4 验证项目 63.4.1精密度 63.4.2线性 83.4.3 回收率 83.4.4 定量限、检测限 93.4.5耐用性 104.验证结果评定与结论 111.概述1.1产品概述1.1.1产品名称中文名：红霉素英文名：ERYTHROMYCIN1.1.2产品化学结构式分子式：C37H67NO13 结构式：1.2方法建立概述我公司生产的红霉素在生产过程中使用了二氯甲烷，该溶剂的测定方法按照VP-A-004-00进行了验证，但是由于使用

3、了FID检测器，对二氯甲烷的灵敏度不高，因此验证结并不是很理想，特别是当二氯甲烷的浓 度较低时，准确度难以保证，该方法使用电子捕获检测器（ECD）对二氯甲烷的检测重新验证。试剂二氯甲烷中含有少量三氯甲烷，因此同时对三氯甲烷也需要检测监控。色谱系统和条件参照美国药典（USP）467专论和欧洲药典（Ph.Eur）2.4.24专论。2.检测方法2.1溶剂残留接受标准溶剂二氯甲烷三氯甲烷限度600ppm60ppm2.2 方法描述2.2.1 仪器万分之一分析天平 Agilent6890N GC with 7694E Headspace2.2.2 试剂DMSO(HPLC)；二氯甲烷(AR)；三氯甲烷（AR

4、） 2.2.3 溶液配制样品溶液：取样品约0.50g，精密称定，用DMSO溶解，并稀释至50ml；溶剂溶液：取二氯甲烷约3.0g，三氯甲烷约0.3g，精密称定，用DMSO溶解，并稀释至100ml，精密量取1.0ml，用水稀释至100ml,精密量取1.0ml，用水稀释至10ml。 空白溶液：按照溶剂溶液的配制方法配制空白溶液，但是没有二氯甲烷和三氯甲烷。 供试液：精密量取5.0ml 样品溶液+1.0ml空白溶液于20ml顶空瓶中；（三样） 对照液A：精密量取5.0ml样品溶液+1.0ml溶剂溶液于20ml顶空瓶中；（三样） 对照液B：精密量取5.0ml DMSO +1.0ml空白溶液于20ml顶

5、空瓶中.2.2.4 色谱条件色谱柱：DB624， 30m0.32mm1.8um载气：氮气；流速：35cm/s ；顶空温度：样品瓶温105；定量环温110；传输线温110；进样条件：加热平衡45min，样品瓶加压0.5min，定量环充样0.03min，定量环平衡0.2min，进样1.0min；炉温：40保持15min，以20/min的速度升温至240，保持2min；检测器：ECD，温度250，进样口温度140。操作进样对照液B；进样对照液A；进样供试液。2.2.5 系统适应性对照液A三针的RSD不大于10%2.2.6 计算 其中：AT为供试液平均峰面积；AR 为对照液平均峰面积； MR为对照液二

6、氯甲烷或三氯甲烷的称样量；MT为样品的称样量。3 验证内容3.1 试剂及仪器A检测用试剂试剂名称批号厂家等级DMSO408168美国天地公司HPLC二氯甲烷20040325国药集团化学试剂有限公司AR三氯甲烷0603092广东汕头市西陇化工厂ARB样品样品名称红霉素/批号ERY2-200707001/C仪器和设备仪器名称型号数量校正有效期至气相色谱仪6890N12009年5月17日自动顶空进样器7694E12009年5月17日3.2 验证溶液配制 样品溶液配制：取样品约2.5g，精密称定,用DMSO溶解并稀释至250ml。 对照储备液：取二氯甲烷约3.0g，三氯甲烷约0.3g，精密称定，用DM

7、SO溶解并稀释至100ml，精密量取1.0ml， 用水稀释至100ml。 各浓度对照液：分别取对照储备液1.0ml，2.0ml，4.0ml，5.0ml和7.5ml于5个50ml容量瓶中，用水稀释至刻度。配制成20%，40%，80%，100%和150%的对照液。 空白溶液：按照对照液的配制方法配制空白溶液，但是没有二氯甲烷和三氯甲烷。 0%溶液：精密量取5.0ml样品溶液+1.0ml空白溶液于20ml顶空瓶中(平行三样)； 20%-150%样品溶液：精密量取5.0ml样品溶液+1.0ml对应浓度对照液于20ml顶空瓶中(平行三样)；100% 对照溶液：精密量取5.0ml DMSO +1.0ml对

8、应浓度对照液 (100%)于20ml顶空瓶中（平行六样）。3.3 操作按照0%、20%、40%、80%、100%、150%样品溶液、100%对照的顺序进样，记录各样的峰面积，结果见表1。（以下记录峰面积均为扣除空白后面积）表1溶液0%20%40%80%100%150%100%对照二氯甲烷55.4373.6719.41221.21516.12159.51615.01536.651.5383.6713.11233.91480.52099.61535.51546.556.0390.6736.01178.41450.02011.61516.21545.8平均值54.3382.6722.81211.21

9、482.22090.21549.3RSD4.5%2.2%1.6%2.4%2.2%3.6%2.2%三氯甲烷372.01329.42634.44841.56295.39615.56536.66326.9332.51357.72603.44905.56144.99277.76271.76359.5363.81415.52707.44724.56039.58909.26184.36296.2平均值256.11367.62648.44823.86159.99267.56329.2RSD5.8%3.2%2.0%1.9%2.1%3.8%1.9%操作人/日期： 3.4 验证项目3.4.1精密度1系统精密度计算

10、40%、80%、150%样品溶液各自三针的RSD，查看系统精密度（具体数据参见表1），结果见表2。表2溶液浓度40%80%150%二氯甲烷RSD1.6%2.4%3.6%三氯甲烷RSD2.0%1.9%3.8%2方法精密度计算100%对照液6针的RSD， 查看方法精密度，结果见表3。表3测定次数123456RSD二氯甲烷面积1615.01536.61535.51546.51516.21545.82.2%三氯甲烷面积6536.66326.96271.76359.56184.36296.21.9%结论： 该方法精密度良好，RSD均小于3.0%，能满足分析要求。操作者/日期： 3中间精密度按照3.3.2

11、配制溶液40%（三份）、80%（三份）、和150%（三份），100%对照溶液（六份），在另一天由另一QC员进行实验。计算中间精密度，结果见表4、表5。表4溶液浓度40%RSD80%RSD150%RSD二氯甲烷482.54.5%998.61.5%1621.72.0%477.41028.91583.3444.11011.61647.2三氯甲烷1951.53.6%4298.51.9%7371.92.2%1981.94464.97197.71850.14366.47523.3结论：中间精密度良好，RSD均小于5.0%，表明方法重现性较好操作者/日期：表5测定次数123456RSD二氯甲烷面积1290.

12、01264.41216.01211.71226.21201.92.8%三氯甲烷面积6046.95560.45353.25309.25384.35366.85.1%结论：结果表明仪器精密度良好，RSD小于10.0%。操作者/日期： 3.4.2线性把20%、40%、80%、100%，150%样品溶液的峰面积平均值分别减去溶液0%的平均值，以溶液中二氯甲烷和三氯甲烷的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，进行二元线性回归，计算方法的线性和相关系数，结果见表6。表6溶液浓度0%20%40%80%100%150%二氯甲烷峰面积54.3382.6722.81211.21482.22090.2调整面积/328.3

13、668.51156.81427.92035.9三氯甲烷峰面积256.11367.62648.44823.86159.99267.5调整面积/1059.52351.34368.45683.48553.1二氯甲烷线性公式： y=43.215x112.26 r2=0.9976三氯甲烷线性公式： y=1957.5x52.095 r2=0.9996要求：r20.98结论：线性关系良好,线性范围分别为: 二氯甲烷 119891ppm，三氯甲烷 1287ppm。操作者/日期： 3.4.3 回收率把样品溶液20%、40%、80%、100% 150%的峰面积平均值分别减去溶液0%的平均值，再除以对照100%的平

14、均值，分别乘以5、2.5、1.25、1.0、0.667。以考察各个浓度下方法的回收率。回收率应在80%-120%之间，结果见表7。表7溶液浓度0%20%40%80%100%150%二氯甲烷峰面积54.3382.6722.81211.21482.22090.2调整峰面积/328.3668.51156.81427.92035.9回收率/106%108%93%92%88%三氯甲烷峰面积256.11367.62648.44823.86159.99267.5调整峰面积/1059.52351.34368.45683.48553.1回收率/84%93%86%90%90%结论：二氯甲烷及三氯甲烷回收率均在80

15、%120%之间，符合回收率要求。二氯甲烷平均回收率为97%，说明用该方法进行测定，准确度高；三氯甲烷平均回收率为89%，略偏低，但仍能满足分析要求。操作者/日期： 3.4.4 定量限、检测限把对照100%用DMSO不断稀释，计算待测信号的信噪比，以确定 待测溶剂的检测限和定量限，以及他们在样品中的含量限度，结果见表8。 表8检测限定量限S/N浓度(ug/ml) 样品中残留量S/N浓度(ug/ml) 样品中残留量二氯甲烷2.90.36ppm11.9120ppm三氯甲烷3.80.010.3ppm11.70.031ppm结论：由上述实验可以看出，使用ECD检测器进行检测，灵敏度高，响应值大。二氯甲烷

16、检测限为6ppm，定量限为20ppm；三氯甲烷检测限为0.3ppm，定量限为1ppm。操作者/日期： 3.4.5耐用性 用对照100%溶液来考察方法的耐用性，仅进行单因素条件试验，不进行正交试验（即只改变某一个条件，其它条件不变），以二氯甲烷及三氯甲烷的峰面积为考查对象，计算RSD，结果见表9。方面包括如下： 1）顶空瓶平衡时间考查40min、45min、50min； 2）色谱柱初始温度考查42、40、38 3）载气流速35cm/s、38cm/s、32cm/s 表9123二氯甲烷三氯甲烷RTAreaRSDRTAreaRSD4540354.6811104.41.0%8.5763997.31.2%

17、4538354.8721082.69.0923902.34542354.4601097.68.0213942.44040354.6571285.52.9%8.5354542.22.9%4540354.6561266.48.5324494.65040354.6581214.18.5374295.34540384.3131207.16.5%7.8884421.18.1%4540354.6811104.48.5763997.34540325.1311064.89.4133772.2结论：通过上述试验可以看出，顶空平衡时间及色谱柱初始温度的微小改变对结果基本上无影响，其RSD均小于3.0%；流速的改变对结果影响较大，RSD大于5.0%。操作者/日期： 4.验证结果评定与结论质量研究组长 签名： 日期：质量科副科长 签名： 日期：质量科QA主任 签名： 日期：附件1 验证方案修改申请及批准书验证方案修改申请及批准书验证方案名 称验证方案编 号修改内容签名： 日期：修改原因及 依 据签名： 日期：验证小组意见 验证小组组长： 日期：决定 QA主任： 日期：附件2 验证过程中偏差记录验证方案名称：验证方案编号：偏差描述： 操作人： 日期：偏差原因： 操作人： 日期：建议措施： 验证小组组长： 日期：处理决定： QA主任： 日期：验证过程中偏差记录