林木育种学实验实习指导.docx

1、林木育种学实验实习指导林木育种学实验与实习指导 康向阳、胡冬梅编二七年五月前 言本实验与实习指导是根据林木育种学和林木育种学实习新教学大纲要求以及相应教学条件编写的。旨在通过教学实验和实习，促进同学对课堂讲授的林木育种学理论知识的理解，加深同学对有关林木育种相关技术环节的感性认识，培养同学独立思考以及自己动手解决具体育种工作问题的能力，为今后从事林木良种选育研究、品种管理、繁育和推广等工作打下一定的基础。本实验和实习指导包括两部分，其中实验教学部分共设计了4个实验，每个实验4-6学时，包括树木开花授粉习性观察，树木花粉收集、储藏与生活力测定，树木花粉染色体加倍以及树木有性杂交等内容，主要利用校

2、内栽植的树木为材料；实习教学部分在内容选择时注意避免与实验内容的重复，设置了优树选择、林木种子园、子代测定林等内容，主要依托实习基地河北省承德市平泉县七沟林场国家油松良种基地的油松或华北落叶松种子园与子代测定林展开。在编写本实验与实习指导时，综合考虑了实验、实习时间以及学校和基地实验、实习条件的充分利用，其中实验部分注意到每个实验的相对独立性和可操作的同时，也考虑到实验的系统性和综合性，鼓励只选用一个树种为实验材料，从而将所涉及的4个实验内容整合为某一植物花粉染色体加倍与杂交的研究型综合实验；而在实习教学中，鼓励同学在教师指导下自主完成实习计划制定、实地调查与测定、内业资料整理等。由于实验、实

3、习条件以及学习期限所限，本实验与实习指导材料难以覆盖林木育种的各个技术环节。此外，编者虽尽心尽力，但因条件与水平所限，难免存在错误与不妥之处，恳请读者提出宝贵意见，以便进一步完善、提高。 编者 2007年5月1日目录第一部分 林木育种学实验指导3实验一 树木开花授粉习性观察4实验二 植物花粉染色体加倍与鉴定6实验三 树木花粉收集、储藏与生活力测定10实验四 树木杂交试验14第二部分 林木育种学实习指导17实习一 优树选择18实习二 林木种子园22实习三 子代测定林26第一部分 林木育种学实验指导1实验目的林木育种学实验属于林木育种学专业课程的重要组成部分。通过实验教学，使同学加深对课堂理论教学

4、的理解，增进对树木开花授粉习性观察，树木花粉收集、储藏与生活力测定，树木花粉染色体加倍以及树木有性杂交等内容的认识，掌握相关工作的具体技术环节，培养同学自己动手解决具体育种工作问题的能力等。2实验地点北京林业大学林木育种学实验室。3实验组织形式由于植物花芽发育过程有其固有节律，且受环境影响较大，难以限定在特定的实验课内完成，因此，根据育种实验的特点，从利于学生能力培养出发，本实验课采取开放性教学。即实验提早启动，尊重实验材料与环境互作的客观规律；学生要按教师的要求自己设计并完成实验，促进自主学习以及专业兴趣与创新能力培养；实验室、温室以及仪器设备等全面开放，提高仪器设备运转效率等。要求由各组同

5、学通过查阅有关文献资料，选定树种、制定实验方案，在与指导教师充分讨论的基础上，根据花芽发育进程，按方案合理安排实验次序，完成有关实验过程。4实验要求1实验前一周，各小组长与实验指导老师取得联系，准备好相关器具和药品。2以实验小组为单位，集体完成有关实验内容的调查和数据整理。3每位同学按要求独自提交一份完整的实验报告，要求撰写规范，语言简洁，分析透彻，结论可信。4遵守实验室规定以及社会公德，注意人身安全，防止各类事故。5实验成绩评定根据每位同学的实验出勤情况、实习态度、实习报告质量等评定实习成绩。实验成绩采取百分制，其中，实验态度占50分，包括出勤与团结协作精神（15分）、参与实习调查是否认真（

6、15分）、是否遵守实验管理规定（20分）；实验报告质量占50分，包括整理是否科学准确（30分）、报告撰写是否认真规范（20分）。实验一 树木开花授粉习性观察不同树种的开花授粉习性存在一定差异，在进行杂交和多倍体育种前，了解树木的花器构造、开花习性以及传粉和结实特点等，从而确定适宜的花粉采集时期、授粉时期以及采取适宜的杂交技术等，因此，树木开花授粉习性观察是杂交育种和配子染色体加倍的基础。一、实验目的通过实际观察，掌握树木开花授粉习性及其观察方法。二、实验材料校园内的树木，如刺槐、玉兰、泡桐、榆树、连翘、山桃、杨树、杜仲、银杏、油松、白皮松等。三、实验用具游标卡尺、羊皮纸袋、镊子、放大镜、记录本

7、、标签、记号笔、铅笔、曲别针、工具书等。四、实验方法与步骤1玉兰、榆树、连翘、山桃、刺槐、泡桐等雌雄同花树种确定观察的树种，选择观察的花枝与花蕾（序）。每天或间隔数天定时观测花蕾（序）一次，观察花蕾（序）的形态和颜色变化，雌雄蕊成熟期的先后，测量花蕾（序）长度和直径，直至散粉完毕为止，并详细记录花蕾（序）各发育时期的形态变化和经历时间（如表1-1）。通过去雄、授粉、套袋等方法（如表1-2），观察在套袋隔离状态下不同处理的结实情况，判定该树种的开花授粉习性。如闭花授粉，则表明该树种为自花授粉植物；如去雄套袋不授粉而收获种子，表明该树种存在无融合生殖现象；如人工自花授粉套袋后未收获种子，而去雄套袋

8、异花授粉收获种子，表明该树种存在自交不亲和，属于异花授粉植物；如人工自花授粉套袋后收获种子，而去雄套袋异花授粉亦收获种子，表明该树种不存在自交不亲和现象（无融合生殖例外），既可进行自花授粉，也能进行异花授粉。 2油松、白皮松等雌雄同株异花树种确定观察的树种，选择观察的花枝与雌、雄球花。每天或间隔数天定时观测雌、雄球花一次，观察雌、雄球花的形态和颜色变化，测量雌、雄球花长度和直径，直至雌球花闭合、雄球花散粉完毕为止，并详细记录雌、雄球花各发育时期的形态变化和经历时间（如表1-1）。3杨树、杜仲、银杏等雌雄异株树种确定观察的树种，选择观察的花枝与雌、雄花芽。每天或间隔数天定时观测雌、雄花芽一次，观

9、察雌、雄花芽的形态和颜色变化，测量雌、雄花芽长度和直径，直至雌、雄花散粉完毕为止，并详细记录雌、雄花芽各发育阶段的形态变化和经历时间（如表1-1）。五、作业 按实验的目的要求，以实验小组为单位完成实验内容；每位同学独立撰写一份林木开花授粉习性观察分析报告。表1-1 不同发育时期花（序）形态变化表日期气温雄花（序）雌花（序）平均花长平均花径花的颜色花药颜色平均花长平均花径花的颜色表1-2 开花授粉习性处理方法处理花朵数收获果实数收获种子数自然状态人工自花授粉套袋套袋自然自花授粉去雄套袋异花授粉去雄套袋不授粉实验二 植物花粉染色体加倍与鉴定染色体加倍主要是通过人工理化方法处理植物分裂细胞，促使细胞

10、内的理化环境发生改变，影响纺锤丝或细胞板的形成，从而诱导细胞核或细胞质不分裂，导致体细胞内染色体数目倍增。其中物理诱导法包括各种采用各种射线辐射、高低温以及机械损伤等处理；化学诱导法包括采用各种植物碱、麻醉剂等。人工诱导花粉染色体加倍是树木人工多倍体育种中最为快捷的途径之一。一、实验目的学习植物染色体加倍及鉴定的方法和技术。二、实验材料杨树、二月兰等树木或草本植物材料。三、主要仪器与试剂仪器设备：温室、人工气候箱（0-50）、显微镜、微量注射器、干燥器、酒精灯、烧杯、容量瓶、量筒、吸管、青霉素小瓶、镊子、剪刀、解剖针、单面刀片、载玻片、盖玻片、滤纸、记号笔、标签等。试剂：秋水仙碱、冰乙酸、无水

11、乙醇、盐酸、醋酸洋红等。四、实验方法与步骤1花粉染色体加倍有效处理时期由于理化处理只影响正在分裂的细胞，所以在处理时要了解被处理植物的细胞分裂周期，从而保证在细胞分裂有效作用时期之前进行处理。掌握最适处理时期，可取得事半功倍的效果。秋水仙碱等化学药剂诱导杨树等植物花粉染色体加倍的最佳处理时期为减数分裂粗线期（康向阳等，1999），高温诱导杨树等植物花粉染色体加倍的最佳处理时期为减数分裂终变期-中期之前（康向阳等，2000）。实验时可选择在减数分裂的细线末期、粗线期、终变期等时期进行处理。在实验中，可采用醋酸洋红压片观察杨树等小孢子母细胞减数分裂过程，同时观察花芽外部形态的变化，及其与花芽外部形

12、态变化的相互关系等（表2-1）。定期用卡诺固定液固定花芽，并边固定边采用制片跟踪观察。即花芽在固定液中固定2h后，用镊子摘取花药置于载玻片上，立即滴一滴醋酸洋红染色液，镊子挤压花药，将花粉母细胞排出，使其悬浮于染色液中，然后将花药壁组织清除干净，加盖玻片观察。由于杨树等花芽内小孢子母细胞减数分裂过程不同步，故以全部分裂相中占大多数的减数分裂时期作为该花芽的代表时期。2诱导花粉染色体加倍的方法（1）化学诱导花粉染色体加倍花粉染色体化学加倍主要选用秋水仙碱处理，萘嵌戊烷（C12H10）、有机杀菌剂富民隆、氧化亚氮（N2O）等也常被使用。试剂的最适浓度：因处理的材料、选择的处理方法以及处理的持续时间

13、和环境温度等而异。一般而言，敏感材料（如根）采取直接浸泡或注射、处理持续时间长、环境温度高时，浓度宜较低；而当材料相对不敏感、采取涂布、喷雾等方法、处理持续时间短或环境温度较低时，浓度宜较高。秋水仙碱化学诱导采用的浓度一般为0.01%0.5%。处理持续时间：因处理的材料、选择的处理方法以及环境温度等而异，一般在1272小时之间。处理的持续时间必需适度，如处理时间太短，则往往只有少数细胞染色体加倍，此时未加倍的细胞在生长、分裂速度方面较加倍细胞快，加倍细胞的生长增殖受到抑制，处理无效；反之，如处理时间过长，超过一个细胞分裂周期，则处理结果是染色体数目增加不止一倍，而形成更高的倍性细胞，或者因细胞

14、受到秋水仙碱等化学试剂的毒害而引起细胞死亡，甚至导致组织或个体死亡。处理方式有：浸渍法：即用一定浓度的秋水仙碱等化学试剂浸渍萌发的种子、幼苗、茎尖、花芽等。注射法：即用注射器将一定浓度的秋水仙碱等化学溶液直接注射到待处理的部位。一些树木的花芽适合用此方法。涂布法：即将含一定浓度的秋水仙碱等化学溶液的羊毛脂软膏涂抹在生长点上。喷雾法：即将配制好的秋水仙碱等化学药剂喷到要处理的分生部位。药剂-培养基法：即将待处理材料接种到含一定浓度秋水仙碱等化学试剂的培养基上进行处理的方法。幼胚、愈伤组织以及一些较小的种子适合采用该种方法。杨树等树木花粉染色体加倍可采用注射法，即用微量注射器将秋水仙碱液从花芽顶端

15、注入花芽内，每天3-4次，每次注入至药液溢出花芽为止，每次处理间隔为5-7小时。如该批花枝当天没注射完，于当日晚将所注射花枝移入冷室（0-4）以减缓减数分裂进程，确保处理效果的连续性。处理适宜温度：温度过高和过低均不利于多倍体诱导。低于10时，因低温能抑制细胞分裂，从而影响化学药剂的作用效果；大于25，药剂对细胞的毒害作用加剧，导致细胞活力降低、甚至发生细胞裂解等。一般处理温度以1520为宜。另外，处理温度与处理的溶液浓度和持续时间密切相关，一般温度低时浓度可稍大、处理时间可较长；温度高时须降低溶液浓度，缩短处理的持续时间。（2）物理因素诱导花粉染色体加倍物理诱导法是指利用温度、射线、机械损伤

16、等物理因素处理植物材料诱导细胞染色体加倍的方法，其中以高温处理效果最好。由于物种生物学特性差异，一些植物对秋水仙碱等化学试剂较为敏感，处理后因化学试剂毒害作用而难以取得理想效果，此时选择高温等物理方法诱导染色体加倍可能会收到叫好的效果。处理的适宜温度：因处理的材料、处理的持续时间等而异。一般而言，高温处理诱导杨树等植物花粉染色体加倍的适宜温度范围为3845。处理持续时间：因处理的材料、选择的处理温度等而异，一般高温处理在28 h，如在温度较高时处理时间过长，会导致花药细胞干枯而死亡。处理方法：在进行高温处理时，对于类似于杨树等可以采用切枝水培的树种，或可通过盆栽的一、二年生草本植物、小灌木，可

17、于恒温箱中施加高温处理诱发花粉染色体加倍；对于如杜仲等难以像杨树那样切枝水培的树种，可以采用“树木高温加倍器（发明专利ZL200510011598.5）”于树上对花芽进行高温处理诱导花粉染色体加倍。3标记与花枝管理：各处理均要挂上标签，注明处理方法、浓度、次数、日期等，并注意观察花序生长变化，及时换水，注意收集花粉。4花粉形态观察与统计：一般而言，未减数二倍性花粉是正常花粉体积的2倍，在光学显微镜下，2n花粉与正常花粉对比明显，易于判别。在统计时将各个处理所得的花粉混合均匀，用解剖针取少量花粉置于洁净的载玻片上，用醋酸洋红染色，制成3-5个临时涂片，每片观察5个视野，统计花粉中的大花粉百分率（

18、表2-2，表2-3）。五、作业每组选择1种实验材料，以小组为单位采用秋水仙碱或高温处理完成一植物种的花粉染色体加倍及鉴定过程；每位同学独立并完成一份实验报告。表2-1 花粉母细胞减数分裂及雄配子发育进程水培时间（h）减数分裂时期花序形态花药颜色表2-2 秋水仙碱诱导 2n花粉比率统计表处理时期浓度注射次数对照（0次）备注135表2-3 高温处理诱导 2n花粉百分率(%)处理时期处理温度处理时间h2n花粉百分率%花粉量/花芽mg对照（未处理正常散粉）实验三 树木花粉收集、储藏与生活力测定为了保证杂交工作顺利进行，必须在雌花开放前取得足够量的花粉。在自然条件下，花粉一般很容易丧失生活力。花粉贮藏的

19、目的在于人为创造一定的环境条件，使花粉自身代谢强度降低，从而延长花粉寿命，并通过花粉贮藏和运输，打破杂交亲本时间与空间隔离，解决花期不遇和异地亲本杂交等问题。为了保证杂交成功，经长期贮藏或从外地寄来的花粉, 在杂交前应先检验花粉的生活力，避免因花粉失去活力而导致杂交失败，造成人力、物力浪费。一、实验目的通过实验掌握林木花粉收集、储藏与生活力测定方法。二、实验材料杨树、白榆、油松、银杏、杜仲、法桐等树木的花粉。三、实验药剂与用具显微镜、冰箱、恒温箱、干燥器、培养皿、安瓿瓶或指形管、酒精灯、烧杯、量筒、凹型载玻片、盖玻片、脱脂棉、花粉筛、标签、刀片、镊子、解剖针、毛笔、记录本、铅笔、无水乙醇、硫酸

20、、氯化钙、硅胶、蔗糖（或者葡萄糖）、琼脂、苯胺兰、联苯胺、碳酸氢钠、-奈乙酚、过氧化氢、红氮四唑、甘油、硼酸、蒸馏水等。四、实验方法与步骤1花粉采集林木大多为风媒花树种，可在散粉时于树上直接收集花粉，一些树种也可以采用切枝水培方法收集花粉，或摘取雄（球）花阴干收集花粉等方法。其中，油松、银杏等可直接于树上摘取雄球花阴干收集花粉；杨、柳、榆等可提前切取花枝进入温室水培收集，但切枝水培的枝条采集不宜过早，如杨树花枝采集以每年12月底以后为好，因花芽发育需要一个低温期，过早则难以取得花粉。虫媒花树种的花粉数量少，花粉粒大且具有粘性，可于开花前数日采集即将开放的花蕾，取出花药(勿带花丝)，贮藏备用。

21、2花粉储藏树木花粉寿命的长短，主要取决于遗传特性，控制温度和湿度等条件对延长花粉的寿命有重要影响。低温、干燥、避光有利于花粉寿命的延长。具体储藏方法是将花粉采集后阴干，除净杂物，分装到安瓿瓶、指形管或其它小容器中；注意不论盛在任何容器，都不宜过满，也不宜盖严，以免妨碍气体交换，影响花粉干燥。一般数量约为容器容积的1/5-1/4；用双层纱布或棉花封口；贴上标签，注明树种、花粉品种和采集日期、贮藏日期等；然后将容器放入盛有干燥剂的干燥器中，置于0-4冰箱内储藏。多数树种最适宜的储藏含水量在10%以下，可以将花粉放入盛有硅胶的安瓿瓶内密封储藏。但也有树种需要保持较高的含水量，可以通过在干燥器内添加不

22、同浓度的硫酸调节花粉储藏的相对湿度（表3-1）。表3-1 干燥器环境温度0时不同干燥剂与相对湿度的关系干燥剂硫酸浓度（%）硅胶95.063.154.349.442.134.829.417.8相对湿度（%）01025355065709053花粉生命力鉴定测定花粉生活力的方法包括直接测定和间接测定。直接测定法是将花粉直接授在同树种的雌蕊柱头上，并做好隔离，授粉一定时间后检查花粉萌发情况，或统计结实情况等。间接测定法有培养基法、染色法等。（1）活体授粉法在同树种的雌蕊柱头上用待测花粉直接授粉，并套袋隔离，观察其雌花的发育。如果胚珠能够正常发育并能收获种子，说明该花粉具有生命力，否则就没有生命力。一般

23、为快速取得实验结果，可通过切下柱头用苯胺蓝染色制片，于显微镜下检查花粉萌发情况。染色与软化液配制染色液配制：称取0.1g苯胺蓝溶于100ml的蒸馏水中，配制成0.1%的苯胺蓝水溶液。软化液配制：称取32g氢氧化钠溶于100ml的蒸馏水中，配制成8mol/L的氢氧化钠溶液。染色与观察将待检测花粉直接授在同种的雌蕊柱头上，并套袋隔离。因树种不同，隔5-72h采集已授过粉的雌蕊柱头，于8mol/L的氢氧化钠溶液（或60温水）软化10-15min，水洗10min，用苯胺蓝染色液染色10min或过夜，于载玻片上将花柱撕开压片。在显微镜下观察，若花粉具有生命力，即可观察到花粉管（染成蓝色）深入到柱头组织；

24、若花粉失去生命力，则无花粉管伸入柱头组织。由于雌蕊柱头本身具备花粉萌发的最适条件，因此采用活体授粉法检测花粉生活力最为可靠，但该方法只能定性而不能定量，即不能统计花粉萌发率。（2）培养基法培养基法是在适宜的条件下，用蔗糖等制备的培养基培养花粉，在显微镜下统计花粉萌发率。培养基配制在小烧杯中加10ml蒸馏水，然后加入0.2g琼脂，并作好液面标记；加热至沸后，继续加热至琼脂溶解；随后加入和1g蔗糖至溶解, 补充因蒸发损失的水分至标记处，搅拌均匀，即配制成10%蔗糖（或者葡萄糖）+2%琼脂的固体培养基。如需要添加硼离子等，可以用0.001g硼酸溶液代替蒸馏水。液体培养液只是在上述固体培养基中不添加琼

25、脂，其余配制方法相同。液体培养基配制时最好也煮沸几分钟，以达到灭菌消毒的目的。花粉播种与培养用酒精将载玻片和培养皿擦拭消毒；待酒精蒸发干后，用滴管吸取或玻璃棒蘸取少量培养基，趁热滴在悬滴载玻片的凹槽内，待培养基冷凝后，用解剖针粘取少许花粉均匀播撒在培养基上，注意不可过多，以免难于观察；将制好的片子置于垫有吸水纸的培养皿中，用蒸馏水浸润吸水纸保湿，培养皿加盖于恒温箱中培养，并做好标记。杨树、柳树、榆树、杜仲等适宜温度为20左右，松类适宜温度为25左右。不同植物种类花粉萌发所需时间不同，杨树、柳树等可于12h后观察，松属等树种花粉需要13d才能萌发。储藏过的花粉和过干的花粉萌发需要的时间要长些。观

26、察在光学显微镜下观察统计花粉萌发情况，可随机取5个视野，统计萌发花粉数与观察花粉总数，计算花粉萌发率，即花粉生活力（表3-2）。一般规定花粉管伸长的长度等于或者超过花粉短轴时，即可计算为萌发花粉。花粉生活力（%）=萌发花粉数/观察花粉总数100（3）染色法染色法的基本原理是，在具有生活力的花粉内存在过氧化氢酶，可以促进过氧化氢分解，同时使还原剂氧化着色。使用还原剂为无色联苯胺和-奈乙酚等处理，具有生活力的花粉，联苯胺和-奈乙酚氧化后呈现红色或玫瑰红色，如花粉已经失去活力，则不会发生变色反应，花粉也就保持原来颜色。染色液配制将0.2g联苯胺溶于100ml 50%的乙醇中,棕色瓶中暗处保存备用；;

27、将0.15g-奈乙酚溶于100ml乙醇中, 棕色瓶中暗处保存备用；将0.25g碳酸氢钠溶于100ml蒸馏水中, 白色瓶中保存备用。将以上三种溶液等量混合配制成“甲液”，棕色瓶中暗处保存备用。实验前配制“乙液”，即0.3%的过氧化氢溶液，现配现用。染色与观察在载玻片上撒少许花粉，用吸管滴一滴“甲液”，片刻后再滴入一滴“乙液”，35min后于显微镜下观察。其中，凡红色或玫瑰红色的皆为有生活力的花粉，而不着色的，则为无生活力的花粉；每次观察5个视野，计算花粉生活力（表3-2）。花粉生活力（%）= 着色花粉数/观察花粉总数100此外，还可以用氯化2,3,5-三苯基四唑(TTC)染色观察。一般用0.01

28、-0.1% TTC溶液处理花粉，在3035温度下避光放置12小时，有活力的花粉因氧化还原反应变成红色。五、作业以小组为单位，每组分别用两种方法完成2-3种树木的花粉生命力鉴定，并分别计算其花粉生活力；每位同学独立完成一份实验报告。表3-2 花粉生活力测定结果记录表载玻片号处理条件观察各视野的花粉生活力（%）平均（%）12345培养基染色法实验四 树木有性杂交不同树种或同一树种不同种源、家系、无性系间的交配，即基因型不同的类型或个体间的交配叫杂交。杂交主要利用基因重组产生的优良遗传变异类型，获得杂种优势。树木人工杂交的目的是通过杂交综合双亲的优良性状，并利用杂种优势，提高树种的生长量，改进产品质量，增强林木抗逆性。一、实验目的掌握树木有性杂交技术。二、试验材料 杨树、油松、杜仲、国槐等树种。三、实验用具 冰箱、干燥器、授粉器、毛笔或带橡皮铅笔、吊签、记号笔、镊子、放大镜、羊皮纸袋、70%酒精、硅胶、小培养皿、记录本、铅笔等。四、实验方法与步骤1亲本选配观察并结合查阅资料，了解杂交树种的生物学特性，如开花时间、花期、开花授粉还是闭花受精，以及有无配子败育问