波生坦对大鼠颈动脉再狭窄的影响及其病理机制.docx

1、波生坦对大鼠颈动脉再狭窄的影响及其病理机制波生坦对大鼠颈动脉再狭窄的影响及其病理机制（作者:_单位: _邮编: _） 作者：吴桂平 张彦红 付鑫 李颖 曲晓婷 王涤非【摘要】 目的 探讨波生坦对大鼠颈动脉再狭窄的影响及其病理机制。方法 选取Wistar大鼠65只，随机分为假手术组、损伤组及波生坦组。损伤组及波生坦组模拟临床经皮冠状动脉形成术（PTCA）过程行左颈总动脉球囊损伤致内膜剥落，波生坦组给予波生坦100 mgkg-1d-1灌胃（术前1 d直至处死）。观测术后不同时相点的内膜，中膜动态增殖情况，并采用免疫组化法检测 平滑肌肌动蛋白( SMA)和抗增殖细胞核抗原（PCNA）。结果 损伤组术

2、后28 d新生内膜增生达峰值，波生坦组术后14 d内膜增生达峰值。术后14、28、45 d波生坦组内膜面积较损伤组明显减小（P0.001）。术后14 d的波生坦组内膜PCNA的阳性率与损伤组比较显著降低（P0.01）。术后14 d actin的阳性表达率较损伤组明显增加（P0.01）。结论 波生坦组可通过抑制血管内膜过度增殖及减少血管平滑肌细胞的增殖，转型和迁移而有效预防PTCA术后再狭窄的发生。 【关键词】 波生坦；再狭窄；动脉成形术；血管平滑肌细胞；大鼠 【Abstract】 Objective To investigate the effect and pathogenetic stud

3、y of Bosentan on carotid artery restenosis in rat. Methods 65 Wistar rats were divided randomly into 3 groups: sham, injury and Bosentan groups. The balloon catheter injury was performed on left common carotid artery of rat by imitating the process of percutaneous transcoronary angioplasty (PTCA) in

4、 injury and Bosentan groups. 100 mgkg-1d-1 Bosentan was administrated intragastricly to rats of Bosentan group (from 1 day to being killed). The process of neointimal and media hyperplasia was observed and actin and proliferation cell nuclear antigen (PCNA) expressions were determined. Results Arter

5、ial neointima hyperplasia reached summit at 28 days in injury group and at 14 days in Bosentan group. Neointimal and media area of Bostentan at different time (14th ,28th ,45th day) were significantly decreased compared with injury group (P0.001). The positive rate of PCNA increased statistically in

6、 Bosentan group than that of injury group at 14th day (P0.01). The positive rat of actin cell increased significantly in Bosentan group compared with injured group (P0.01) at 14th day. Conclusions Bosentan can effectively prevent artery restenosis by inhibiting neointimal hyperplasia and reducing th

7、e proliferation, migration, transconformation of vascular smooth muscle cells. 【Key words】 Bosentan; Restenosis; Angioplasty; Vascular smooth muscle cell; Rat经皮冠状动脉介入治疗冠心病血管重建治疗的术后再狭窄发生率仍较高，从而影响了治疗效果，因而探寻再狭窄的防治成为当前冠心病防治研究的热点。再狭窄的形成是一个复杂的病理生理过程，其主要的机制为扩张动脉血管腔炎症反应，血管内皮损伤诱发的血管重构和血管平滑肌细胞的过度增殖与迁移1。内皮素（ET

8、）是由内皮细胞合成，具有强大的缩血管和促进血管平滑肌细胞的作用。波生坦是一种非肽类非选择性内皮素受体阻断剂。关于波生坦对大鼠颈动脉再狭窄的影响的研究国内外尚无报道。本试验通过观察波生坦对大鼠颈动脉再狭窄的影响并研究其病理机制，为冠状动脉成形术术后再狭窄的防治提供新的思路。1 材料与方法1.1 实验动物健康雄性Wistar大鼠65只，体重330460 g，购自中国医科大学实验动物室。1.2 实验试剂、药品与器材波生坦(商品名：全可利片）：购自爱克泰隆药品公司。2F经皮冠状动脉成形术（PTCA）球囊导管（1.5 mm20 mm），购自Cordis 公司。抗增殖细胞核抗原（PCNA）单抗（福建迈新）

9、。抗 平滑肌肌动蛋白（ SMA）单抗（上海长岛生物公司）。免疫组化SP试剂盒（福建迈新）。伊文氏蓝。DAB显色试剂盒（北京中科生物技术有限公司）。1.3 分组、药物干预与模型制备健康雄性Wistar大鼠65只，随机分为假手术组15只，损伤组25只，波生坦组25只，波生坦组大鼠自术前1天直至处死予波生坦100 mgkg-1d-1灌胃，假手术组和损伤组给予等量蒸馏水灌胃直至处死。参照Clowes2方法将损伤组与波生坦组实验大鼠禁食8 h后，腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，尾静脉注射肝素100 U/kg，沿中线切开颈部皮肤，在颈前三角区暴露左颈总动脉、颈内及颈外动脉，轻轻分离颈外动脉，结扎颈外动脉远段，用丝

10、线暂时阻断颈总动脉近心端血流，自颈外动脉血管壁剪一“V”形小切口，置入导丝并插至近膈肌水平，沿导丝送入PTCA球囊导管至颈总动脉约3 cm，肝素盐水充盈球囊，予152 kPa压力扩张30 s，缓慢回抽球囊至颈动脉分叉处，重复3次剥脱内膜，结扎颈外动脉近段，查看颈总动脉及颈内动脉搏动良好后缝合皮下组织与皮肤。术后常规肌注青霉素40万U/d，共3 d，预防感染。假手术组仅暴露分离左颈总，颈内，颈外动脉，随即缝合皮下组织及皮肤，喂食普通饲料，自由饮水。1.4 取材术后1、7、14、28、45 d分批取材，首先经尾静脉注射5%伊文氏蓝 生理盐水标记无内膜覆盖血管。30 min后用4%多聚甲醛以13.3

11、 kPa进行灌注固定，解剖并游离左右侧颈总动脉，切取左侧颈总动脉中段蓝染区，共同行低温石蜡垂直定向包埋，并以5 m厚度切片，常规HE 染色。1.5 免疫组织化学法标记定量平滑肌细胞（VSMC）的增殖 分别以抗 SMA,抗PCNA抗体进行免疫组化染色标记VSMC，增殖细胞，采用SP法进行免疫组织化法染色。1.6 动脉壁内膜、中膜面积的测量按照组织学划分，内膜弹力膜以内为血管内膜，内外弹力膜之间为中膜。在5物镜下将完整的血管横切面HE 染色图像摄入计算图像分析系统中（江苏捷达图像分析软件），分别测量血管内膜面积，随机选取动脉蓝染段3个切面分析，取平均值。同时采用计算机图像分析系统测定内膜、中膜细胞

12、总数及PCNA染色阳性细胞数，计算14 d内膜、中膜增殖细胞阳性率。1.7 统计学处理采用统计学软件包SPSS11.0，数据以xs表示。组间比较采用t检验，自身前后比较采用对照t检验。2 结 果2.1 一般状况65只大鼠分别因术中呼吸骤停死亡2例，术后出血死亡1例，插入球囊致动脉断裂未完成造模2例，60只大鼠成功建模，假手术组15只，损伤组22只，波生坦组23只。 2.2 术后动脉壁动态增生的观测及内膜面积比较光镜下，术后1 d，正常大鼠颈动脉内膜为单层内皮细胞，中膜为环形排列波浪状弹性膜和平滑肌细胞组成，球囊损伤后1 d动脉内膜剥脱，球囊损伤后7 d可见新生内膜形成，中膜亦有所增厚，术后14

13、 d损伤组内膜继续增厚，至28 d内膜增生达高峰，此后内膜有缩小趋势，但差异不显著，中膜变化不明显，而波生坦组术后14 d内膜增生达高峰值，波生坦组增生内膜面积在术后14、28、45 d与损伤组比较，差异显著（P0.01），见表1，图1。表1 不同时间血管内膜面积比较（略)2.3 术后各组血管壁PCNA阳性细胞的变化术后7 d假手术组无PCNA阳性细胞，其他两组新生内膜可见少量PCNA阳性细胞，而中膜可见大量PCNA阳性细胞，术后14 d损伤组新生内膜可见大量PCNA阳性细胞，而波生坦组PCNA阳性细胞较7 d增加，但较损伤组明显减少(P0.01)，见表2。术后14 d，两组中膜PCNA阳性细

14、胞减少，见表2，图2。与损伤组比较波生坦组PCNA阳性细胞减少有显著差异（P0.01）。2.3 术后各血管壁平滑肌 SMA表达情况假手术组血管壁平滑肌 SMA几乎无表达。术后损伤组和波生坦组术后内膜及中膜均呈少量阳性表达，术后14 d， SMA阳性表达较前增加，28 d后变化不明显，术后14 d波生坦 SMA阳性表达率较损伤组增加有显著差异（P0.01），表2，图2。表2 术后14 d各组血管PCNA和 SMA表达比较(略)3 讨 论 冠脉介入治疗术后再狭窄的发生是复杂的病理生理过程，是血管局部损伤后所发生的一种修复反应，其中血管内皮损伤诱发的血管重构和血管平滑肌细胞过度增殖和迁移是导致PTC

15、A术后再狭窄的主要病理基础2。 内皮素具有强烈的缩血管作用和促进血管平滑肌增生的作用，在缺氧、应激、动脉粥样硬化、高血压等病理状态下ET 1水平显著升高3,PTCA过程中会有不同程度的内皮剥脱与损伤，Wang等4发现，大鼠颈动脉球囊形成术后ET 1、ET 3、ETA及ETB mRNA存在时间依赖性增高。目前已有相关研究表明PTCA术后血浆ET浓度升高，且局部升高更为明显5，再狭窄的发生率伴随着ET及其受体表达的增多，所以有理由认为抑制ET受体可以减少再狭窄的发生。 本实验通过建立大鼠颈动脉球囊损伤模型，对动脉损伤后不同时期血管的增生以及波生坦对其影响进行了连续的观察。在术后动脉壁动态增生方面，

16、球囊损伤后7 d即可见新生内膜增生形成，术后14 d损伤组、波生坦组内膜继续增厚，至28 d损伤组新生内膜增生达高峰。临床PTCA术后患者血管再狭窄发生时间主要在术后36个月，4个月内约占50%6，这一规律与在实验中大鼠颈动脉损伤模型术后内膜增生有着相同的趋势，即提示应尽早通过抑制内膜的增生以降低再狭窄的发生发展。波生坦组在损伤术后7、14、28及45 d增生内膜面积与损伤组比较明显减少，且波生坦组术后14 d时膜增生已达峰值，提示波生坦对损伤动脉具有明显的抑制内膜增生的作用。 PCNA是一种与细胞增殖有关的参与 DNA合成的核蛋白，是仅能在增殖细胞中合成和表达的核内多肽链。因此，PCNA的合

17、成及表达与细胞的增殖状态，分化活跃程度密切相关，是反映细胞增殖功能的敏感的检测指标7，8。本实验证明动脉损伤后7 d新生内膜及中膜即有PCNA阳性细胞，至术后14 d新生内膜PCNA阳性细胞进一步大量增加，但波生坦组在术后14 d内膜、中膜细胞增殖率较损伤组显著减少，提示波生坦可在术后早期即对血管壁平滑肌细胞增殖具有抑制作用。 VSMC是一种多功能性间叶细胞，其功能主要是通过收缩和松弛来维持血管壁的张力，通过增生和细胞外基质合成来维持血管完整性。VSMC增殖、迁移最终导致新生内膜形成。在人体发育过程中，VSCM具有两种表型，收缩型和合成型。当血管壁发生损伤时VSCM即由收缩型向合成型发生逆向转

18、化，VSMC表型转化是PTCA术后再狭窄，动脉粥样硬化血管重塑的共同病理学基础。 SMA是VSMC表型转化的敏感指标，其表达减少标志着细胞由收缩型向合成增殖型转化9，PTCA术后内皮细胞受损，术中机械性刺激加之生长因子共同作用，动脉中膜静止的VSMC原癌基因被激活，发生去分化，由高分化非增殖型收缩表型向低分化增殖型合成表型转变，向血管内膜迁移，增殖并分泌细胞外基质，形成过度增殖的新生内膜，导致管腔狭窄。本实验证实术后7 d，损伤血管内膜，中膜 SMA均呈现阳性表达，术后14 d损伤血管 SMA阳性表达大量增加，波生坦组较损伤组表达明显增加，提示波生坦能有效抑制平滑肌细胞由收缩型向增殖型转化，减

19、少新生内膜的形成。 综上，本实验证实波生坦通过抑制动脉粥样新生内膜的过度增殖，减少血管平滑肌细胞的增殖，转型及迁移，可有效预防PTCA术后再狭窄，如果相关大规模临床实验最终证实该作用，将有助于提高冠脉介入术的疗效。【参考文献】 1 Holvoet P, Sinnaeve P. Angio associated migratory cell protein and smooth muscle cell migration in development of restenosis and atherosclerosisJ.J Am Coll Cardiol,2008;52(4):312 4. 2

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