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1、分子生物重点汇总分子生物学 闭卷一、名词解释8个41、有机溶剂沉淀法2、基因组（genome）：是一个细胞或一种生物体的整套遗传物质，包括基因和非编码DNA。即该生物体的一套染色体中的完整的DNA序列。3、LC-MS4、gene therapy基因治疗：（狭义）将具有正常功能的基因置换或增补患者体内有缺陷的基因，从而达到治疗疾病的目的。（广义）将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，最终达到治疗疾病的目的。5、Real-time （荧光定量）PCR：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。6、基因诊断：即

2、分子诊断，指通过分子生物学和分子遗传学技术，直接检测遗传物质结构和表达是否异常，从而对人体的健康状态和疾病做出诊断的方法。7、分子标记物：8、逆转录PCR P207二、问答题8个：8，8，8，8，10，8，101、酵母双杂交技术的原理和应用？13、14考题P412、蛋白质分离纯化的基本原则？常用有哪些方法？3、基因诊断的方法哪些？杜氏肌营养不良（DMD)的基因诊断可采用什么方法？原理与步骤如何？P78 基因诊断的方法有：PCR；核酸杂交；基因芯片；bDNA；NASBA；测序。杜氏肌营养不良（DMD)的诊断方法：多重PCR4、pUC载体常用的筛选方法是什么?原理与步骤？5、寡核苷酸探针的设计原则

3、？1) 探针长度：一般要求在1050bp。 2) GC含量为4060。 3) 探针分子中应避免互补序列。 4) 避免同一碱基连续出现，一般不能多于4个，如GGGG-或 -CCCC-。 5) 借助计算机相应软件与已知的各种基因序列进行同源性比较。 6、Ct值的含义与作用。意义：确定初始模板的浓度。初始 DNA量越多, 荧光达到某一值（域值）时所需要的循环数越少Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数就可计算出样品中所含的模板量7、阅读文献4原题。8、骨髓干细胞的特点。【1】名词解释加灰为作业涉及的13年考题，加框为新增作业题1、生物大分子:具有较大的分子量，由简单的小分子（核苷

4、酸或氨基酸）排列组成，蕴含丰富信息并且具有复杂的空间结构。2、蛋白质组（proteome）：指由一个基因组，或一个细胞、组织表达的所有蛋白质。3、Probe：核酸探针：是指带有某些标记物（如放射性同位素、荧光物质等）的特异性核酸序列片段，可与互补片段结合成双链结构，从而检测互补链的位置。4、基因芯片（gene chip）：又称DNA微阵列（microarray），是由大量DNA或寡核苷酸探针密集排列所形成的探针阵列，其工作的基本原理是通过杂交检测信息。5、DNA-chip:DNA芯片。指通过微阵列技术将高密度DNA片断阵列通过高速机器人或原位合成方式以一定的顺序或排列方式使其附着在如玻璃片等固

5、相表面作为探针，荧光标记的样品DNA/RNA借助碱基互补作用与探针进行杂交，从而进行大量的基因表达及检测等方面的研究。6、SNP单核苷酸多态性：指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，是决定个体差异最主要的遗传物质。它是人类可遗传的变异中最常见的一种，占所有已知多态性的90%以上，与疾病的发生、药物的作用均相关。7、有机溶剂沉淀法：是沉淀法的一种，不同溶解度的产生是由于溶质分子之间及溶质与溶剂分子之间亲和力的差异而引起的，溶解度的大小与溶质和溶剂的化学质及结构有关，溶剂组分的改变或加入某些沉淀剂以及改变溶液的pH值、离子强度和极都会使溶质的溶解度产生明显的改变。根据这种原理

6、，有机溶剂多用于蛋白质和酶、多糖、核酸以及生物小分子的分离纯化。8、气相色谱-质谱联用仪（GC-MS ）：是一种结合气相色谱和质谱的特性，在试样中鉴别不同物质的方法。GC：气相色谱的流动相为惰性气体，气-固色谱法中以表面积大且具有一定活性的吸附剂作为固定相。当多组分的混合样品进入色谱柱后，由于吸附剂对每个组分的吸附力不同，经过一定时间后，各组分在色谱柱中的运行速度也就不同。吸附力弱的组分容易被解吸下来，最先离开色谱柱进入检测器，而吸附力最强的组分最不容易被解吸下来，因此最后离开色谱柱。如此，各组分得以在色谱柱中彼此分离，顺序进入检测器中被检测、记录下来。MS：是一种测量离子荷质比（电荷-质量比

7、）的分析方法，其基本原理 是使试样中各组分在离子源中发生电离，生成不同荷质比的带正电荷的离子，经加速电场的作用，形成离子束，进入质量分析器。在质量分析器中，再利用电场和磁场使发生相反的速度色散，将它们分别聚焦而得到质谱图，从而确定其质量。9、代谢组学：是研究一个细胞、组织或器官中所有小分子代谢组分集合的科学。代谢组学研究的目的是定量分析一个生物系统内所有代谢物的含量。其特点有：1)关注于内源性小分子化合物。2)对生物体系中的小分子化合物进行定性定量研究3)内源性小分子化合物的上调和下调指示了与疾病、毒性、基因修饰或环境因子的影响。4)内源性化合物的特点用来表征疾病和药物筛选。其优点是：1基因和

8、蛋白表达的有效微小变化会在代谢物上得到放大，从而使检测更容易；2其技术不需要建立全基因组测序及大量表达序列标签的数据库；3代谢物的种类要远小于基因和蛋白的数目；4各生物体系的代谢产物都是类似的，其研究采用的技术更通用。1. 毛细管电泳：是以毛细管为分离通道、采用高压直流电场为驱动力的的新型液相分离技术，通过离子化合物的质荷比（m/z）不同造成迁移速率不同来实现分离。它适用于普通反相色谱柱不易保留的离子性代谢物的分离分析。 2. NMR核磁共振：是磁矩不为零的原子核，在外磁场作用下自旋能级发生蔡曼分裂，共振吸收某一定频率的射频辐射的物理过程。核磁共振波谱学是光谱学的一个分支，其共振频率在射频波段

9、，相应的跃迁是核自旋在核蔡曼能级上的跃迁。3. gene therapy基因治疗：（狭义）将具有正常功能的基因置换或增补患者体内有缺陷的基因，从而达到治疗疾病的目的。（广义）将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，最终达到治疗疾病的目的。4. stem cell：一种具有复制能力、可以形成各种组织的早期未分化细胞。根据不同时期其功能特点常分为胚胎干细胞(ES，全能性)、多能干细胞、专能干细胞（AS、HSC、NSC、MSC）。5. CRISPR/Cas system：CRISPR/Cas系统广泛分布于细菌和古生菌基因组中, 是在进化过程中形成的一种迄今发现的唯一具有适应性、继承性的免

10、疫系统，使细菌能摄取外来基因片段、整合、遗传，降解入侵病毒或质粒DNA，抵挡再次入侵。6. 断裂基因:是真核生物的结构基因，由若干个编码区和非编码区互相间隔开但又连续镶嵌而成，去除非编码区再连接后，可翻译出由连续氨基酸组成的完整蛋白质，这些基因称为断裂基因.7. 酚抽提法(SDS法）：以含EDTA、SDS及无DNA酶的RNA酶裂解缓冲液破碎细胞，经蛋白酶K处理后，用pH8.0的Tris饱和酚抽提DNA，重复抽提至一定纯度后，根据不同需要进行透析或沉淀处理获得所需的DNA样品的方法。酚抽提法提取基因组DNA中各试剂的作用: 1、EDTA:抑制 DNA 酶活性,降低细胞膜稳定性2、SDS：降解细胞

11、膜，乳化脂化和蛋白质并沉淀，抑制DNA/RNA酶3、无DNA酶的RNA酶：水解RNA，避免DNA消化4、蛋白酶K：水解蛋白质，消化DNA酶和细胞中的蛋白质5、酚：使蛋白质变性沉淀，抑制DNA酶活性6、PH8.0Tris溶解：保证提后DNA进入水相，避免滞留于蛋白质层。1. 凝胶过滤层析：凝胶是一种具有多孔、网状结构的分析筛，利用这种凝胶分子筛对大小、形状不同的分子进行层析分离，称为凝胶层析。 其原理是：当样品溶液通过凝胶柱时，相对分子量较大的物质由于直径大于凝胶网孔而只能沿着凝胶颗粒间的孔隙，随着溶液流动，因此流程较短，向前移动速度快而首先流出层析柱；相对分子量较小的物质直径小于凝胶网孔，可自

12、由的进出凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中，它们从凝胶内扩散到胶粒孔隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断的进入与溢出，使流量增长，移动速率慢而最后流出层析柱；而中等大小的分子将在大、小分子物质之间被洗脱，这样经过层析柱后，使混合物中的各物质按其分子大小不同而被分离。2. 巢式PCR（聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)）：是指利用对引物，第一对引物的序列在模板外侧，它做PCR的扩增产物作为第二对引物退火的模板，第二对引物相对第一对引物在模板的内侧，再做PCR，由此提高灵敏度和特异性的PCR技术。3. Real-time （荧光定量）PCR：在PCR反应体系中加入荧光基

13、团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。4. 变性(denaturation) ：在某些理化因素的作用下，维系DNA分子二级结构的氢键和碱基堆积力受到破坏，DNA由双螺旋变成单链，作为与引物结合及TapDNA聚合酶延伸的模板，此反应过程称为变性。5. 复性（renaturation) ：指变性 DNA 在适当条件下，二条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象，它是变性的一种逆转过程。6. 解链温度（融解温度，Tm,melting temperature)：DNA的变性从开始解链到完全解链是在一个相当窄的温度内完成的,使50%的DNA发生变性

14、时的环境温度即称之Tm。7. 增色效应：DNA变性后对260nm紫外光吸收增加的现象。8. 减色效应：变性DNA复性后对260nm紫外光吸收减少的现象。9. 退火（annealing）：当温度由高温缓慢下降时，热变性的DNA单链在碱基互补的基础上重新形成氢键开始复性的过程，称之为“退火”。由于反应体系中引物浓度远远大于模板DNA浓度，且引物结构简单，这极大地限制了变性后模板DNA单链之间的互补结合。 编码序列称外显子(exon)，非编码序列称内含子(intron)。有些真核病毒的部分序列，对某一个基因来说是内含子，而对另一个基因而言却是外显子。2013年作业涉及：1基因诊断：即分子诊断，指通过

15、分子生物学和分子遗传学技术，直接检测遗传物质结构和表达是否异常，从而对疾病作出判断的方法。2无义突变：是编码某一氨基酸的 三联体密码经 碱基替换后，变成不编码任何氨基酸的终止密码UAA、UAG或UGA。虽然无义突变并不引起氨基酸编码的错误，但由于终止密码出现在一条mRNA的中间部位，就使翻译时多肽链的终止就此终止，形成一条不完整的多肽链。 3动态突变：动态突变也可称为基因组不稳定性(genomicinstability)。 在研究与人类神经系统遗传性疾病相关的基因时，发现患者基因中某种三核苷酸的重复拷贝数急剧增加，这种突变导致了疾病的发生。这种三核苷酸重复拷贝数增加，不仅可发生在上代的生殖细胞

16、中而遗传给下一代，而且在当代的体细胞中也可发生，并同样具有表型效应。除此之外，一个个体的不同类型细胞或同一类型的不同细胞中，三核苷酸重复拷贝数也可以是不同的。重复拷贝数改变后的基因的可突变性，将不同于拷贝数改变前的基因。这不同于以往发现的基因突变，所以称之为动态突变(dynamicmutation)。4表观遗传：表观遗传是指在基因的核苷酸序列不发生改变的情况下，基因表达可遗传的变化的现象，例如DNA甲基化，基因组印记，母体效应，基因沉默，核仁显性，休眠转座子激活和RNA编辑等。 5miRNA：是由2125个核苷酸组成的非编码RNA；它通过与靶基因的3-UTR的配对，促进mRNA的降解或抑制mR

17、NA的翻译从而抑制其靶基因的表达；它在生物体生长发育、细胞增殖、分化、凋亡以及人类各种疾病的发生发展过程中发挥重要的调控作用。6C值悖论（C value paradox）：生物体的进化程度与基因组大小之间不完全成比例的现象称为C值矛盾7开放阅读框架 (open reading frame，ORF)：在DNA链上，由蛋白质合成的起始密码开始，到终止密码为止的一个连续编码序列。 1）编码区 能够编码产生蛋白质的序列，包括外显子与内含子； 2）前导区 位于编码区上游，相当于mRNA5端非编码区； 3）调节区 包括启动子和增强子等基因编码区的两侧；【2】 问答题1. 什么是循环microRNA？它与机

18、体病理生理有什么联系？作为分子诊断标志物的优缺点有哪些？【2013作业3】 2008年首次提取并检测出体液中miRNAs，并被后来的研究所证实.Chen的研究证明无论健康人，癌症患者或是糖尿病患者血清中都存在大量miRNAs，Gilad等检测出人体尿液、唾液、羊水以及胸水中同样存在大量miRNAs。人体体液中含有miRNAs的证实为miRNAs的研究开辟了新的途径。循环miRNAs能够反映人体多种生理学和病理学的改变。研究证实健康人血清中细胞外miRNAs水平是稳定的。健康状况下血清miRNAs表达将与循环血细胞中相同，且会随生理状况、疾病的类型和病程的不同而发生改变。因此循环miRNAs水平

19、的改变可能预示人体生理学和病理学的改变。 随着研究的深人，人们发现作为稳定的以血浆为基础的生物标记物，循环miRNAs的关键性的调控能力和有效性正在被越来越多的证据所验证.其对于早期妊娠、药物引起肝损伤、双相性精神障碍病人、早期败血症、2型糖尿病，乙肝病毒阳性、多种癌症以及心血管疾病的诊断及治疗具有重要的临床意义。2.以DNA的分离纯化为例，阐述核酸分离纯化的基本原则，DNA不纯常因有哪3种物质？【2013作业2】（1）DNA分离纯化的基本原则：一是保持核酸碱基序列的完整性。二是尽量清除其它分子的污染，保证核酸制品的纯度。 （2）注意事项：保持核酸的完整性。在整个操作过程中应尽量避免各种有害因

20、素对核酸的破坏。1）温度不要过高(04)；高温破坏氢键；2）控制pH值范围(pH值4-10);极端酸碱破坏磷酸二酯键。3）保持一定离子强度; 4）减少物理因素对DNA的降解，物理因素主要是机械剪切力、高温。5）对无法避免的有害因素，应采取多种措施，尽量减轻各种有害因素对DNA完整性的破坏。总结核酸纯化注意事项：1）核酸样品中是否存在过高浓度的金属离子和对酶有抑制作用的有机溶剂； 2）其它生物大分子如蛋白质、脂类和多糖分子的污染应降至最低程度； 3）排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子时应去除RNA，提取RNA分子时应去除DNA。1. 什么原因易引起DNA降解，该如何解决？答：原因分析： 材

21、料不新鲜或反复冻融;未很好抑制内源核酸酶的活性；提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断；外源核酸酶污染；对应对策：1）.尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融；将DNA分装保存于缓冲液中，避免反复冻融2）.液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液3）.在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，可增加裂解液中螯合剂的含量4）.细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔5）.所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌2. 试分析PCR出现非特异性扩增产物的原因及解决方法？答：造成PCR非特异性产物的常见原因及其预防措施：（）引物特异性不高，引物用量过多，应调换产物或降低引物用量；（）TaqDNA聚合酶质量不

22、好或用量偏高，应降低酶量或使用质量较好的酶；（）Mg2+浓度过高，可适当调整其浓度；（）退火温度过低，退火及延伸时间偏长，可提高退火温度，减少退火及延伸时间，或者采用二温循环PCR进行扩增；（）热循环次数过多，适当增加模板用量，减少循环次数。3.简述PCR技术的基本原理及其反应体系的一般组成？【2013作业2】答：（1）PCR的基本原理它包括三个基本步骤:(1)变性(Denature):目的双链DNA片段在94下解链;(2)退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(50左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对;(3)延伸(Extension):DNA模板引物结合物在TaqDNA聚合酶的作

23、用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟，23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。PCR反应的特点：特异性强、灵敏度高、简便、快速、对标本的纯度要求低。PCR是在试管中进行的DNA复制反应，基本原理是依据细胞内DNA半保留复制的机理，以及体外DNA分子于不同温度下双链和单链可以互相转变的性质，人为地控制体外合成系统的温度，以促使双

24、链DNA变成单链，单链DNA与人工合成的引物退火，然后耐热DNA聚合酶以dNTP为原料使引物沿着单链模板延伸为双链DNA。PCR全过程每一步的转换是通过温度的改变来控制的。需要重复进行DNA模板解链、引物与模板DNA结合、DNA聚合酶催化新生DNA的合成，即高温（90-95）变性、低温（40-60）退火、中温（70-75）延伸3个步骤构成PCR反应的一个循环，此循环的反复进行，就可使目的DNA得以迅速扩增。（2）PCR反应体系的一般组成 1）模板0.12ug：DNA（质粒DNA或基因组DNA）或RNA（总RNA、mRNA、rRNA、tRNA、病毒RNA）； ）人工合成的引物10100pmol：

25、两段寡核苷酸序列，决定RCP的特异性 ）四种dNTP底物各200umol/L：dATP、dTTP、dGTP、dCTP ）DNA聚合酶：不耐热的Klenow片段、耐热的Taq DNA聚合酶2.5u ）合适的因子：一般组成：50mM KCl, 10-50mM, Tris-Cl (室温pH8.3) ，1.5mM/L MgCl2，适宜的温度控制。 6)10扩增缓冲液 10ul 加双或三蒸水至100ul（3）PCR的反应条件：模板：DNA（质粒DNA或基因组DNA）或RNA（总RNA、mRNA、rRNA、tRNA、病毒RNA）；缓冲液 Tris-HCl缓冲液 KCl 促进引物的退火，浓度太高时会抑制Ta

26、q DNA聚合酶活性。 加入BSA或明胶有利于保护TaqDNA聚合酶活性。 必要时加入适量二甲基亚砜(DMSO)或甲酰胺利于破坏模板二级结构，提高PCR反应特异性。镁离子：浓度1.5-2.0 mmol/L，Taq DNA聚合酶活性需要Mg 2+。Mg 2+浓度过高又使酶催化非特异性扩增增强。Mg 2+浓度还会影响引物的退火、模板与PCR产物的解链温度。 底物dNTPs：浓度20-200umol/L；升高浓度可加快反应速度，也增加碱基的错配率和实验成本；降低浓度会导致反应速度下降，可提高反应的特异性。4种dNTP必须以等摩尔浓度配制，以减少PCR反应的错配误差。Taq DNA聚合酶：浓度1-2.

27、5u/100ul，具有良好的热稳定性，75-80时具有最高的聚合酶活性。引物：浓度0.1-0.5umol/L，浓度偏高会引起错配或非特异性扩增、生成引物二聚体，使目的DNA产率下降。退火温度与引物Tm值有关，引物Tm值在55-80范围较为理想。反应温度和循环次数。1. PCR与细胞内DNA复制的异同点。（不少于5点） 答：相同点：原理相同，都是利用碱基配对互补的原则而且复制的时候都是半保留复制，都需要引物，底物都是dNTP。 不同点： 1。所处的反应环境不同：一个体内一个体外 2。复制方式不同：PCR不会产生冈崎片断；一个细胞只在有丝和减数分裂的时候进行DNA复制而PCR可以反复进行。 3。所

28、需酶原料不同： 4。复制起始点不同：细胞中的DNA复制受到许多复杂的因子的调控 5。两者进行的温度不同 6。PCR产物短小，DNA复制不精确; 体内DNA复制是整体染色体的复制 7。终止方式不同：4.Taqman技术的原理？【2013作业2】 利用Taq酶天然的53核酸外切酶活性，裂解双链DNA5端的核苷酸，释放出单个或寡核苷酸，裂解的最佳底物是被置换了的具有叉样结构的单链DNA,水解部位发生于结合了置换部位的磷酸二酯键处。基于Taq酶的此种特性，设计合成一个能与PCR产物杂交的探针，探针的5端标记一个荧光分子，3端标记另一个荧光分子，其中3端的荧光分子能够吸收5端荧光分子的荧光信号，但当有特

29、异的PCR产物时，该探针与模板退火，即产生了适合于核酸外切酶活性的底物，从而激活TaqDNA聚合酶的5外切酶活性，将探针5端连接的荧光分子从探针上切割下来，破坏了两荧光分子之间的FRET，从而发出荧光，切割的荧光分子数与PCR数量成正比例。因此，根据PCR反应液的荧光强度即可计算出初始模板的数量。5.蓝白斑筛选（IPTG-Xgal）实验原理(-互补)？实验中所用质粒的结构特点？ Blue/white screen: 蓝白斑筛选实验。即-半乳糖苷酶基因失活筛选。其原理是：pUC质粒含Ampr，可供菌落筛选，质粒载体带有大肠杆菌乳糖操纵子的lacZ基因，该基因含一段编码-半乳糖苷酶氨基末端145个

30、氨基酸肽的DNA片断，IPTG可诱导此片断合成，此片断能与宿主细胞所编码的缺陷型-半乳糖苷酶实现基因内互补，形成完整的半乳糖苷酶。该酶能催化无色底物Xgal生成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝，形成蓝色菌落。pUC载体的lacZ基因中含有MCS(多克隆位点)，当外源基因插入lacZ基因中MCS，lac肽基因阅读框架被破坏，细菌内将无半乳糖苷酶活性，结果重组克隆呈白色菌落，这种颜色变化是鉴定和筛选基因的最直观有效的方法。6.miRNA的调控机制？ 作用机制:1、miRNA与靶基因mRNA 3-非翻译区通过不完全配对结合降低mRNA稳定性或抑制靶基因的翻译. 2、miRNA也可与5-非翻译区和

31、编码区序列结合调节靶基因的表达. 3、有文献报道,miRNA可与mRNA3-非翻译区的其他部位结合,升高mRNA的稳定性. 功能:miRNA主要通过抑制它的靶基因来起调控作用。miRNA的作用遍及生命体的发生、生长、发育、分化和死亡的过程。有人预测结果发现，miRNA的靶基因多数是参与转录、信号转导、肿瘤发生的基因。虽然miRNA的作用也是特异的，特别是5端的28个碱基，特异性的靶向与它的靶基因，但是与siRNA不同的是miRNA的特异性并不是那么强，在生物体内往往一个miRNA作用于多个靶基因。7.根据阅读作业xxx回答：【2013作业4】1. 简述真核生物基因组的结构与功能特点。答：真核生物基因组远大于原核生物基因组，结构复杂，基因数庞大，具有多个复制起点；真核生物基因组的化学本质为DNA，大多与蛋白质结合形成染色质，基本结构单位是核小体。每一种真核生物都有一定的染色体数目；基因组DNA与蛋白质结合成染色体，储存于细胞核内；真核基因不存在操纵子结构，功能相关基因分散在不同的染色体上，基因都由一个结构基因与相关的调控区组成，转录产物为单顺反子，即一分子mRNA只能翻译成一种蛋白质。而细菌和病毒的结构基因多为多顺反子；基因组中非编码区（占90以上）多于编码区；真核基因