液相色谱柱安装与使用说明及故障诊断.docx

1、液相色谱柱安装与使用说明及故障诊断液相色谱柱安装与使用说明液相色谱仪由高压液体泵、检测器及液相色谱柱等三部分组成，其中液相色谱柱的正确安装和使用，是液相色谱工作的关键；也是液相色谱工作者获得正确可靠的实验数据的必经之路。 一、液相色谱柱的安装： 1、液相色谱柱的结构： a、空柱由柱接头、柱管及滤片组装而成。 柱接头采用低死体积结构，柱接头是两端螺纹组件，一端是为7/16英寸外螺纹，另一端是316英寸的内螺纹(国内外已规范化)。716英寸外螺纹与14英寸柱管(6.35mm)连接，中间放置压坏用于密封。316英寸的内螺纹与116英寸(1.57mm)的连接管连接，中间也放置压环用于柱接头的密封。为了

2、尽量减少柱外死体积，在安装色谱柱时，用1.57mm连接管通过空心螺钉压环后要尽量插到底，然后再拧紧空心螺钉。压环被空心螺钉挤压变形后紧箍在连接管上(连接管通过压环后露出的管长度应严格控制在25mm长或其他固定尺寸)。 在两端柱接头内，柱管两端各放置一片不锈钢滤片(或滤网)，用于封堵柱填料不被流动相冲出柱外而流失。空柱各组件均为316#不锈钢材质，能耐受一般的溶剂作用。但由于含氯化物的溶剂对其有一定的腐蚀性，故使用时要注意，柱及连接管内不能长时间存留此类溶剂，以避免腐蚀。 b、柱填料： 液相色谱柱的分离作用是在填料与流动相之间进行的，柱子的分类是依据填料类型而定。 正相柱：多以硅胶为柱填料。根据

3、外型可分为无定型和球型两种，其颗粒直径在310 m的范围内。另一类正相填料是硅胶表面键合CN，-NH2等官能团即所谓的键合相硅胶。 反相柱：主要是以硅胶为基质，在其表面键合十八烷基官能团(ODS)的非极性填料。也有无定型和球型之分。 常用的其他的反相填料还有键合C8、C4、C2、苯基等，其颗粒粒径在310 m之间。 2，色谱柱的安装： a、拆开柱包装盒，确认色谱柱的类型、尺寸、出厂日期以及柱内贮存的溶剂。 b、拧下柱两端接头的密封堵头放回包装盒供备用。 c、 按柱管上标示的流动相流向，将色谱柱的入口端通过连接管与进样阀出口相连接(如条件允许，建议在柱前使用保护柱)；柱的出口与检测器连接。连接管

4、是外径为1.57mm、内径为0.1-0.3mm的不锈钢管。连接管的两端均有空心螺钉及密封用压环。在接管时一定要设法降低柱外死体积。连接管通过空心螺钉、压环后尽量用力插到底，然后顺时针拧紧空心螺钉，直到拧不动为止，再用扳手继续顺时针拧14-12圈，切记不要用力过大。如色谱柱通过流动相加压后有漏液现象，请用扳手继续顺时针拧14圈，直至不漏液为止。 二、液相色谱柱的使用： 色谱柱在使用前，最好进行柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化的参考。但要注意：柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同；另外，在做柱性能测试时是按照色谱柱出厂报告中的条件进行(出厂测试所使用

5、的条件是最佳条件)，只有这样，测得的结果才有可比性。1、样品的前处理： a、最好使用流动相溶解样品。 b、使用予处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。c、使用0.45m的过滤膜过滤除去微粒杂质。 2、流动相的配制： 液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的，因此要求流动相具备以下的特点： a、流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中(或长时间保留在柱中)。 b、流动相具有一定惰性，与样品不产生化学反应(特殊情况除外)。 c、流动相的黏度要尽量小，以便在使用较长的分析柱时能得到好的分离效果；同时降低柱压降，延长液体泵的使用寿命(可运用提高

6、温度的方法降低流动相的黏度)。 d、流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。如使用UV检测器，最好使用对紫外吸收较低的溶剂配制。 e、流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡，导致实验无法进行。 f、在流动相配制好后，一定要进行脱气。除去溶解在流动相中的微量气体既有利于检测，还可以防止流动相中的微量氧与样品发生作用。 3、流动相流速的选择： 因柱效是柱中流动相线性流速的函数，使用不同的流速可得到不同的柱效。对于一根特定的色谱柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。对内径为4.6mm的色谱柱，流速一般选择1mlmin，对于内径为4.0mm柱，流速0.8mlmin为佳。 当选用最佳流速时，分析时间可能延

7、长。可采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析时间(如使用反相柱时，可适当增加甲醇或乙腈的含量)。 注意： 1由于甲醇廉价，对于反相柱推荐使用甲醇体系(必须使用乙腈的场合除外)。 2对于正相柱推荐使用沸程为30-60的石油醚或提纯后的己烷作流动相，没有提纯的己烷不得使用。用水最好使用超纯水(电阻率大于18兆欧)，去离子水及双蒸水中含有酚类杂质，有可能影响分析结果。 3含水流动相最奸在实验前配制，尤其是夏天使用缓冲溶液作为流动相不要过夜。最好加入叠氮化钠，防止细菌生长。 4流动相要求使用0.45 m滤膜过滤，除去微粒杂质。 5使用HPLC级溶剂配制流动相，使用合适的流动相可延长色谱柱的使用寿命，

8、提高柱性能。 4、柱性能测试：启动液相色谱仪：a、流动相流速设定为1mlmin。 b、UV检测器波长设定为254nm。使用出厂测试时使用的流动相组成及测试样品。记录并计算测试结果。 泵的操作与维护正如人的心脏一样,高效液相色谱仪中的高压恒流泵必须能可靠的运转.但是要做到长时间低维护的可靠运转,就需要对泵有足够的了解,并注意与之有关的事项.1.通常的设计 目前作为商品出售的高压恒流泵多为往复式柱塞泵,结构原理如图1所示.凸轮与连杆将电机的圆周运动转变为柱塞杆的线性运动,在有单向阀的结构中,柱塞杆将常压下储液瓶中的流动相吸至泵腔后再送出,其耐压可达41MPa.通过改变凸轮的形状和电机的转速及柱塞杆

9、的尺寸可以将流动相的脉动降至最小.如果对泵的各个部分都有清楚的认识,将来排出操作过程中出现的故障就很简单了.单向阀:泵头通常由两部分组成-单向阀和密封圈-柱塞杆.图2是单向阀的示意图.该单向阀一般由阀体塑料或陶瓷阀座和红宝石球组成.在压力的作用下宝石球离开阀座(图2-a),流动相流过单向阀;反之,在反向力的作用下,宝石球回到阀座上(图2-b),此时流动相不再流过单向阀.显然宝石球与阀座之间的配合必须非常适合才能防止流动相的泄漏.为了保证单向阀不发生泄漏,一些单向阀中安装了两套宝石球和阀座,也有一些单向阀是将宝石球用一个合适的弹簧压在阀座上.在不同的应用领域,单向阀阀体的材料有所不同,例如考虑生

10、物兼容性的系统,单向阀的阀体往往采用金属钛,而不用不锈钢.为了降低成本和减少维护费用,一些生产厂商还采用了可置换式的卡套式塑料单元件,当然其功能仍保持不变.柱塞杆与密封圈:柱塞杆在泵头内做前后的往复运动,完成将流动相吸入泵头然后再输出的过程.柱塞杆的典型材料蓝宝石,不锈钢或其他材质的柱塞杆往往用于一些特殊的领域.泵头内的密封圈是防止流动相从柱塞杆的周围流走而设计的.图3是柱塞杆的运动过程示意图. 在吸液过程中(图3-b),由于柱塞杆的运动而在泵腔内形成负压.此时因色谱柱的,泵头外的压力显然高于泵头内,在这两种压差下出口单向阀的宝石球落回到阀座上;而对于入口单向阀,因为外界大气压大于泵腔内的压力

11、,宝石球离开阀座,流动相顺利的进入泵腔. 与此相反的输液过程见图3-b.由于柱塞杆的运动使压力增加,入口单向阀的宝石球落回到阀座,入口单向阀处于关闭状态;当泵头内的压力继续增加,并且超过了泵头外的色谱柱的反压时,出口单向阀开启,流动相输出.HPLC故障及排除方法诊状 可能的原因 解 决 方 法 (一)保留时间变化1.柱温变化柱恒温2.等度与梯度间未能充分平衡至少用10倍柱体积的流动相平衡柱3.缓冲液容量不够用25mmol/L的缓冲液4.柱污染每天冲洗柱5.柱内条件变化稳定进样条件,调节流动相6.柱快达到寿命采用保护柱(二)保留时间缩短1.流速增加检查泵,重新设定流速2.样品超载降低样品量3.键

12、合相流失流动相PH值保持在37.5检查柱的方向4.流动相组成变化防止流动相蒸发或沉淀5.温度增加柱恒温(三)保留时间延长1.流速下降管路泄漏,更换泵密封圈,排除泵内气泡2.硅胶柱上活性点变化用流动相改性剂,如加三乙胺,或采用碱至钝化柱3.键合相流失同前(二)34.流动相组成变化同前(二)45.温度降低同前(二)5(四) 出现肩峰或分叉1.样品体积过大用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的15%2.样品溶剂过强采用较弱的样品溶剂3.柱塌陷或形成短路通道更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件4.柱内烧结不锈钢失效更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品5.进样器损坏更换进样器转子(五)鬼峰1.进样阀残余峰每

13、次用后用强溶剂清洗阀,改进阀和样品的清洗2.样品中未知物处理样品3.柱未平衡重新平衡柱,用流动相作样品溶剂 (尤其是离子对色谱)4.三氟乙酸(TFA)氧化(肽谱)每天新配,用抗氧化剂5.水污染(反相)通过变化平衡时间检查水质量，用HPLC级的水(六) 基线噪声1.气泡(尖锐峰)流动相脱气,加柱后背压2.污染(随机噪声)清洗柱,净化样品,用HPLC级试剂3.检测器灯连续噪声更换氘灯4.电干扰(偶然噪声)采用稳压电源,检查干扰的来源(如水浴等)5.检测器中有气泡流动相脱气,加柱后背压(七)峰拖尾1.柱超载降低样品量,增加柱直径采用较高容量的固定相2.峰干扰清洁样品,调整流动相3.硅羟基作用加三乙胺

14、,用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度降低流动相PH值,钝化样品4.同前(四)4同前(四)45.同前(四)35.同前(四)36.死体积或柱外体积过大连接点降至最低,对所有连接点作合适调整,尽可能采用细内径的连接管7.柱效下降用较低腐蚀条件,更换柱,采用保护柱(八)峰展宽1.进样体积过大同(四)12.在进样阀中造成峰扩展进样前后排出气泡以降低扩散3.数据系统采样速率太慢设定速率应是每峰大于10点4.检测器时间常数过大设定时间常数为感兴趣第一峰半宽的10%5.流动相粘度过高增加柱温,采用低粘度流动相6.检测池体积过大用小体积池,卸下热交换器7.保留时间过长等度洗脱时增加溶剂含量也可用梯度洗脱8.柱外体

15、积过大将连接管径和连接管长度降至最小9.样品过载进小浓度小体积样品 色谱柱的使用和维护卡套柱是默克公司推出的新型环保色谱柱技术，它具有以下的特点： 换柱方便：不需要任何工具，仅用双手手指即可以轻松换柱 防止渗漏：避免了柱头频繁拆卸而造成的渗漏 经济实惠：每次只需要购买柱芯，可以节约4060%的费用 适用性强：可以和任何品牌的液相色谱仪器连接使用 每天用足够的时间来平衡色谱柱，您就会在处理问题方面获得最大的补偿，而且您的色谱柱的寿命也会变得更长！-一定得做！ 新的色谱柱在使用之前应该在您自己的液相色谱仪上进行性能测试，即使用色谱柱附带的检验报告上的测试条件和样品来测定该色谱柱的柱效。并且，在以后

16、的使用中，应时常对色谱柱进行测试。 HPLC日常维护办法之二：漏液通常可以通过拧紧或更换管路接头来解决漏液的问题。但值得注意的是过份拧紧会导致金属接头的漏液和塑料接头的磨损。如果通过稍微拧紧接头不能解决漏液的问题，就必须将接头取下，检查是否损坏（例如，卡套损坏、密封表面有杂质）；损坏的接头应该更换掉。A、 接头处漏液原 因解决方法1、接头松动1、拧紧2、接头磨损2、更换3、接头过紧3、a、拧松，再重新拧紧 b、更换4、接头被污染4、a、拆下清洗 b、更换5、部件不匹配5、使用同一品牌的配件B、 泵漏液原 因解决方法1、单向阀松动1、a、拧紧单向阀（不必拧的过紧） b、更换单向阀2、接头松动2、

17、拧紧接头（不必拧的过紧）3、混合器密封损坏3、a、更换混合器密封 b、更换混合器4、泵密封损坏4、维修或更换泵密封件5、压力传感器损坏5、维修或更换压力传感器6、脉冲阻尼器损坏6、更换脉冲阻尼器7、比例阀损坏7、a、检查隔膜，如果漏液立即更换 b、检查手紧接头，损坏的立即更换8、放空阀的损坏8、a、拧紧放空阀 b、更换放空阀C、 进样阀漏液原 因解决方法1、转子密封损坏1、重新安装或更换进样阀2、定量环阻塞2、更换定量环3、进样口密封松动3、调整4、进样针头尺寸不合适4、使用恰当的进样针5、废液管中产生虹吸5、保持废液管高于废液液面6、废液管阻塞6、更换或疏通废液管D、 色谱柱漏液原 因解决方

18、法1、尾端接头松动1、拧紧接头2、卡套内有填料2、拆下、清洗卡套、重新安装3、筛板厚度不合适3、使用合适的筛板（参考下表）筛板选择指导物质粒径筛板孔径3-4u0.5u5-20u2uE、 检测器漏液原 因解决方法1、流通池垫片损坏1、a、避免过大的背景压力（压力降） b、更换垫片2、流通池窗破碎2、更换窗口3、手紧接头漏液3、拧紧或更换4、废液管阻塞4、更换废液管5、流通池阻塞5、重新安装或更换 HPLC日常维护办法之三：谱图的各种问题液相色谱系统的许多问题都能在谱图上反映出来。其中有一些问题可以通过改变设备参数得到解决；而其他的问题必须通过修改操作程序来解决。对于色谱柱和流动相的正确选择是得到

19、好的色谱图的关键。A、 峰拖尾原 因解决方法1、筛板阻塞1、a、反冲色谱柱 b、更换进口筛板 c、更换色谱柱2、色谱柱塌陷2、填充色谱柱3、干扰峰3、a、使用更长的色谱柱 b、改变流动相或更换色谱柱4、流动相PH选择错误4、调整PH值。对于碱性化合物，低PH值更有利于得到对称峰5、样品与填料表面的溶化点发生反应图5、a、加入离子对试剂或碱性挥发性修饰剂 b、更改色谱柱B、 峰前延原 因解决方法1、柱温低1、升高柱温2、样品溶剂选择不恰当2、使用流动相作为样品溶剂3、样品过载3、降低样品含量4、色谱柱损坏4、见A1、A2C、 峰分叉原 因解决方法1、 保护柱或分析柱污染图1、取下保护柱再进行分析

20、。如果必要更换保护柱。如果分析柱阻塞，拆下来清洗。如果问题仍然存在，可能是柱子被强保留物质污染，运用适当的再生措施。如果问题仍然存在，入口可能被阻塞，更换筛板或更换色谱柱。2、样品溶剂不溶于流动相2、改变样品溶剂。如果可能采取流动相作为样品溶剂。D、 峰变形原 因解决方法1、样品过载1、减少样品载量E、 早出的峰变形原 因解决方法1、样品溶剂选择不恰当1、a、减少进样体积 b、运用低极性样品溶剂F、 早出的峰拖尾程度大于晚出的峰原 因解决方法1、柱外效应1、a、调整系统连接（使用更短、内径更小的管路） b、使用小体积的流通池G、 K增加时，脱尾更严重原 因解决方法1、二级保留效应，反相模式1、

21、a、加入三乙胺（或碱性样品） b、加入乙酸（或酸性样品） c、加入盐或缓冲剂（或离子化样品） d、更换一支柱子 2、二级保留效应，正相模式2、a、加入三乙胺（或碱性样品） b、加入乙酸（或酸性样品） c、加入水（或多官能团化合物） d、试用另一种方法3、二级保留效应，离子对3、加入三乙胺（或碱性样品）H、 酸性或碱性化合物的峰拖尾原 因解决方法1、缓冲不合适1、a、使用浓度50-100mM的缓冲液 b、使用Pka等于流动相PH值的缓冲液I、 额外的峰原 因解决方法1、样品中有其他组份1、正常2、前一次进样的洗脱峰2、a、增加运行时间或梯度斜率 b、提高流速3、空位或鬼峰3、a、检查流动相是否纯

22、净 b、使用流动相作为样品溶剂 c、减少进样体积J、 保留时间波动原 因解决方法1、温控不当1、调好柱温2、流动相组分变化2、防止变化（蒸发、反应等）3、色谱柱没有平衡3、在每一次运行之前给予足够的时间平衡色谱柱K、 保留时间不断变化原 因解决方法1、流速变化1、重新设定流速2、泵中有气泡2、从泵中除去气泡3、流动相选择不恰当3、a、更换合适的流动相 b、选择合适的混合流动相L、 基线漂移原 因解决方法1、柱温波动。（即使是很小的温度变化都会引起基线的波动。通常影响示差检测器、电导检测器、较低灵敏度的紫外检测器或其它光电类检测器。）1、控制好柱子和流动相的温度，在检测器之前使用热交换器图2、流

23、动相不均匀。（流动相条件变化引起的基线漂移大于温度导致的漂移。）2、使用HPLC级的溶剂，高纯度的盐和添加剂。流动相在使用前进行脱气，使用中使用氦气。3、流通池被污染或有气体3、用甲醇或其他强极性溶剂冲洗流通池。如有需要，可以用1N的硝酸。（不要用盐酸）4、检测器出口阻塞。（高压造成流通池窗口破裂，产生噪音基线）4、取出阻塞物或更换管子。参考检测器手册更换流通池窗。5、流动相配比不当或流速变化5、更改配比或流速。为避免这个问题可定期检查流动相组成及流速。6、柱平衡慢，特别是流动相发生变化时6、用中等强度的溶剂进行冲洗，更改流动相时，在分析前用10-20倍体积的新流动相对柱子进行冲洗。7、流动相

24、污染、变质或由低品质溶剂配成7、检查流动相的组成。使用高品质的化学试剂及HPLC级的溶剂8、样品中有强保留的物质（高K值）以馒头峰样被洗脱出，从而表现出一个逐步升高的基线。8、使用保护柱，如有必要，在进样之间或在分析过程中，定期用强溶剂冲洗柱子。9、使用循环溶剂，但检测器未调整。9、重新设定基线。当检测器动力学范围发生变化时，使用新的流动相。10、检测器没有设定在最大吸收波长处。10、将波长调整至最大吸收波长处M、 基线噪音（规则的）原 因解决方法1、在流动相、检测器或泵中有空气1、流动相脱气。冲洗系统以除去检测器或泵中的空气。2、漏液图2、见第三部分。检查管路接头是否松动，泵是否漏液，是否有

25、盐析出和不正常的噪音。如有必要，更换泵密封。3、流动相混合不完全3、用手摇动使混合均匀或使用低粘度的溶剂4、温度影响（柱温过高，检测器未加热）4、减少差异或加上热交换器5、在同一条线上有其他电子设备5、断开LC、检测器和记录仪，检查干扰是否来自于外部，加以更正。6、泵振动6、在系统中加入脉冲阻尼器N、 基线噪音（不规则的）原 因解决方法1、 漏液图1、见第三部分。检查接头是否松动，泵是否漏液，是否有盐析出和不正常的噪音。如有必要，更换密封。检查流通池是否漏液。2、流动相污染、变质或由低质溶剂配成2、检查流动相的组成。3、流动相各溶剂不相溶3、选择互溶的流动相4、检测器/记录仪电子元件的问题4、

26、断开检测器和记录仪的电源，检查并更正。5、系统内有气泡5、用强极性溶液清洗系统6、检测器内有气泡6、清洗检测器，在检测器后面安装背景压力调节器7、流通池污染（即使是极少的污染物也会产生噪音。）7、用1N的硝酸（不能用磷酸）清洗流通池8、检测器灯能量不足8、更换灯9、色谱柱填料流失或阻塞9、更换色谱柱10、流动相混合不均匀或混合器工作不正常10、维修或更换混合器，在流动相不走梯度时，建议不使用泵的混合装置O、 宽峰原 因解决方法1、流动相组成变化1、重新制备新的流动相2、流动相流速太低2、调节流速3、漏液（特别是在柱子和检测器之间）3、见section 3。检查接头是否松动、泵是否漏液、是否有盐

27、析出以及不正常的噪音。如果必要更换密封。4、检测器设定不正确4、调整设定5、柱外效应影响a、柱子过载b、检测器对反应时间或池体积响应过大c、柱子与检测器之间的管路太长或管路内径太大d、记录仪响应时间太长图5、 a、 小体积进样（例如：10ul而不是100ul）以1：10或1：100的比例稀释样品b、减少响应时间或使用更小的流通池c、 使用内径为0.007-0.01的短管路d、减少响应时间6、缓冲液浓度太低6、增加浓度7、保护柱污染或失效7、更换保护柱8、色谱柱污染或失效，塔板数较低8、更换同样类型的色谱柱。如果新柱子可以提供对称的色谱峰，则用强溶剂冲洗旧柱子。9、柱入口塌陷9、打开柱入口，填补

28、塌陷或更换柱子10、呈现两个或多个未被完全分离的物质的峰10、选择其它类型的色谱柱以改善分离效果11、柱温过低11、提高柱温。除非特殊情况，温度不宜超过7512、检测器时间常数太大12、使用较小的时间常数P、 分离度降低原 因解决方法1、流动相污染或变质（引起保留时间变化）1、重新配置流动相2、保护柱或分析柱阻塞图2、去掉保护柱进行分析。如果必要则更换保护柱。如果分析柱阻塞，可进行反冲。如果问题仍然存在色谱柱可能被强保留的污染物损坏，建议使用恰当的再生程序。如果问题仍然存在，进口可能阻塞了，更换入口处的筛板或更换色谱柱。Q、 所有的峰面积都太小原 因解决方法1、检测器衰减设定过高1、减少衰减的设定2、检测器时间常数设定太大2、设定较小的时间常数3、进样量太少3、增大进样量4、记录仪连接不当4、使用正确的连接R、 所有的峰面积都太大原 因解决方法1、检测器衰减设定过低1、采取较大的衰减2、进样过多2、减少进样量3、记录仪连接不正确3、正