分子生物学实验设计报告绿色荧光蛋白的克隆表达.docx

1、分子生物学实验设计报告绿色荧光蛋白的克隆表达分子生物学实验设计报告绿色荧光蛋白的克隆表达陶成秋 20杨晨 20一、引言基因标记技术是近年来发展起来的分子生物学技术。荧光蛋白基因在标记基因方面由于具有独特的优点而广受科学家们的关注。荧光蛋白是海洋生物体内的一类发光蛋白，分为绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和红色荧光蛋白。绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白，共27kD，由238个氨基酸构成。当受到紫外或蓝光激发时，GFP发射绿色荧光。它产生荧光无需底物或辅因子，发色团是其蛋白质一级序列固有的

2、。基因克隆技术包括把来自不同物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构建成新的重组DNA，然后送入受体生物中去表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。采用重组DNA技术，将不同来源的DNA分子在体外进行特异性切割，重新连接，组装成一个新的杂合DNA分子。在此基础上，这个杂合分子能够在一定的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代分子。研究绿色荧光蛋白在大肠杆菌体内的基因克隆和表达。通过质粒重组形成所需要的重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入大肠杆菌体内，通过酶切、PCR及用IPTG诱导检测是否在大肠杆菌体内诱导表达成功。根据电泳结果及荧光现象得出结论，重组质粒在大肠杆菌体

3、内成功诱导表达。二、实验流程 碱法提质粒 酶切鉴定，琼脂糖凝胶电泳，PCR-聚合酶链式反应飞废话 pET-28a-GFP重组质粒转化到表达菌BL21 重组绿色荧光蛋白（GFP）的诱导表达 三、具体实验方案实验一、质粒DNA的提取1.实验原理：1）质粒 (Plasmid)是一种染色体外的遗传因子，大小在1kb200kb之间，是具有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒具有自主复制能力，能使子代保持他们恒定的复制数，可表达它携带的遗传信息。它可以独立游离于细胞质内，也可以整合到细菌染色体中，它离开宿主细胞就不能复制，而它控制的许多生物学功能也是对宿主细胞的补偿。2）

4、从大肠杆菌中抽提质粒DNA的方法很多，可以在实验中根据不同的需要采用不同的方法。碱变性法抽提质粒DNA的基本原理是根据染色体DNA和质粒DNA分子量的巨大差异而达到分离的。十二烷基磺酸钠（SDS）是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性碱变性法因其抽提效果好，收得率高，获得的DNA可用于酶切、连接与转化，因而被各实验室广泛采用。抽提过程中在加入溶液II后，碱性条件使DNA的氢键断裂，宿主染色体双螺旋结构解开而变性，而闭合环状的质粒DNA的两条链不会完全分离，当加入溶液III中和后，宿主DNA相对分子质量大，还没来得及复性，就在冰冷的条件下与SDS、蛋白质、高分子量的R

5、NA等缠绕在一起而沉淀下来，而质粒DNA由于能够迅速配对恢复原来的构型而溶解在TE溶液中。2.实验目的：掌握碱裂解法抽提质粒DNA的原理和方法。3. 实验用品：3.1材料：转化好的感受态细胞（含pET-28a-GFP重组质粒），离心管，EP管架，取液器吸头，常用玻璃器皿（三角瓶、量筒、试剂瓶等）3.2试剂：1）溶液50 mL, 葡萄糖 , 50 mmol/L , 25 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0) , 10 mmol/L EDTA (pH 8.0) , 用前加溶菌酶4mg/L.121高压灭菌 15 min后置于04贮存；2）溶液100 mL, 0.2 mol/L NaOH

6、,SDS, 1% (W/V)用时由母液2 mol/L NaOH、10%(W/V) SDS稀释现配；3）溶液100 mL, 60 mL KOAc (5 mol/L), 11.5 mL冰乙酸, 28.5 mL H2O .该溶液钾离子浓度为3 mol/L, 醋酸根离子浓度为5mol/L；4）酚-氯仿(1:1,V:V)；5）TE缓冲液：10mmol/LTris-HCl pH8.0, 1mmol/LEDTA pH8.0, 其中含RNAase20ug/mL.6）70%乙醇，无水乙醇；7）液体LB培养基（pH7.0）, 10 g/L胰蛋白胨, 5 g/L酵母提取物 , 10 g/L NaCl , 1 mL/

7、L NaOH(1 mol/L)； 8）氨苄青霉素25mg/mL贮备液3.3仪器设备：恒温水浴锅，高压灭菌锅，超净工作台，移液器，高速离心机，制冰机，漩涡振荡器4.实验方法：1) 将带有质粒pUC18的大肠杆菌接种在液体培养基中（加氨苄青霉素50 g/mL），370C培养过夜。2) 取培养菌液1.5mL置Eppendorf小管中，10000rpm2min，弃上清液。3) 加入100 l溶液I，漩涡器上充分混匀，在室温下放置10 min。4) 加入200l新配制的溶液，轻轻翻转23次，使之混匀，冰上放置5 min。5) 加入150l冰冷的溶液，盖紧后，温和颠倒3-5次使混匀，产生白色絮状物，冰上放

8、置15 min。6) 10000rpm 5 min，取上清液于另一干净的离心管中。 7) 向上清液中加入等体积（约400l）酚：氯仿/异戊醇（25：24:1，v/v），振荡混匀，10000rpm 10 min，将上清液转移至新的离心管中。8) 加入等体积（约370l）氯仿/异戊醇（24:1），混匀，10000rpm 2min ,取上清液于新离心管中。9) 向上清液加入2倍体积无水乙醇，混匀， -200C放置1h。10) 12000rpm 5 min，倒去上清液，吸干液体。11) 加800l 70%乙醇，离心12000rpm 1 min，倒尽上清液，吸水纸吸干液体，室温自然干燥30min，直至变

9、得透明无乙醇味。12) 加20l ddH2O ，混匀使DNA溶解完全，取5l做电泳检测，剩余的溶液放置-200C保存备用。5. 实验结果预测：加入溶液1浑浊；加入溶液2变澄清；加入溶液3出现白色絮状沉淀；加入氯仿抽提溶液分层。若成功提取，需经限制性内切核酸酶酶切及琼脂糖凝胶电泳检测之后才能观察出结果。6. 实验结果讨论：1) 溶液I 中EDTA的作用： EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配 在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。在溶液I中加入高达 10 mM 的EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。所以加入溶液I后变

10、浑浊2）溶液II中NaOH和SDS的作用：NaOH能溶解细胞也能使DNA变性，SDS也能溶解细胞，所以本步骤中的SDS是为了下一步做准备。而加入溶液II、后也变澄清了。3）十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate）遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾（potassium dodecyl sulfate, PDS），而PDS是水不溶的，因此发生了沉淀。蛋白质也易与SDS结合，所以沉淀中还有蛋白质，由于大肠杆菌的DNA太长，即使不与SDS结合也被PDS一同沉淀了。实验二、质粒DNA的检测1.实验原理:1.1质粒DNA的限制内切核酸酶酶切限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识

11、别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链DNA。它可分为三类：类和类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰（甲基化）作用且依赖于ATP的存在。类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而类酶在识别位点上切割DNA分子，然后从底物上解离。类由两种酶组成： 一种为限制性内切核酸酶（限制酶），它切割某一特异的核苷酸序列； 另一种为独立的甲基化酶，它修饰同一识别序列。类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。绝大多数类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列（如EcoR识别六个核苷酸序列：5- GAATTC-3），有少数酶识别更长的序列或

12、简并序列。类酶切割位点在识别序列中，有的在对称轴处切割，产生平末端的DNA片段（如Sma：5-CCCGGG-3）；有的切割位点在对称轴一侧，产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性末端，如EcoR切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。示意图：5GAATTC3 5 G AATTC33CTTAAG 5 3 CTTAA G5在分子克隆中常用II型限制性内切酶，Bam HI 和Hind III 都属于II型限制性内切酶，这类酶的特点是具有能够识别双链分子上的特异核苷酸顺序的能力，能在这个特异核苷酸序列内，切断的双链，形成一定长度和顺序的片段。Bam HI 和Hind III的识别序列和切口是：Bam H

13、I：GGATCCHind III： AAGCTTG、A等核苷酸表示酶的识别序列，箭头表示酶切口。限制性内切酶对环状质粒DNA有多少切口，就能产生多少个酶切片段，因此鉴定酶切后的片段在电泳凝胶中的片段数，就可以推断切口的数目，从片段的迁移率就可以大致判断酶切片的大小差别。用已知相对分子质量的线状DNA为对照，同归电泳迁移率的比较，就可以粗略地测出分子形状相同的未知DNA的相对分子质量。1.2琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。其分析原理与其他支持物电泳最主要区别是：它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动

14、时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。但由于其孔径相当大，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道，现广泛应用于核酸的研究中。蛋白质和核酸会根据pH不同带有不同电荷，在电场中受力大小不同，因此跑的速度不同，根据这个原理可将其分开。电泳缓冲液的pH在69之间，离子强度0.020.05为最适。常用1%的琼脂糖作为电泳支持物。琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广。普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围为0.2-20kb，利用脉冲电泳，可分离高达107bp的DNA

15、片段。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速率向正极方向移动。1.3PCR-聚合酶链式反应聚合酶链式反应即PCR技术，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法。它的特异性是由两个人工合成的引物序列决定的。引物就是与待测扩增DNA片段两侧互补的寡核苷酸。双链DNA分子在临近沸点的温度下加热时便会分离成两条单链DNA分子（变性），两引物分别于两条DNA的两侧序列特异复性，在适宜条件下，DNA聚合酶以单链DNA为模板，

16、利用反应混合物中的4种脱氧三核苷酸（dNTP），在引物的引导下，按53方向复制互补DNA，即引物的延伸。这种变性复性延伸的过程就是一个PCR循环。在合适条件下，这种循环不断重复，前一个循环的产物DNA可作为后一循环的模板DNA参与DNA的合成，使产物DNA的量按照2n方式扩增。理论上讲经过30次的循环反应，DNA扩增倍数为106109。因此能用微量样品获取目的基因。2.实验目的:分析鉴定所建质粒，检测eGFP基因是否成功连接到pET-28a载体3.实验用品3.1材料：上一步实验所提取的质粒（pET-28a-GFP重组质粒），Bam H I，Not I，酶解缓冲液，DNA模板，4种dNTP，引物

17、2，Taq酶，琼脂糖，DNA相对分子质量标准物，EP管，取液器吸头，一次性手套，琼脂糖，白搪瓷盘，锥形瓶，胶铲，封口膜，胶布，剪刀，吸头，小指管3.2试剂：1)酶反应终止液（10X）：4mol/L尿素，45%甘油，50mmol/LEDTA，1%溴酚蓝，0.1%二甲苯腈兰2)酚-氯仿3)无水乙醇，70%乙醇4)TE缓冲液5)50TAE电泳缓冲母液（50 mL）, 12.1 g Tris-碱, 2.85 mL冰醋酸,5 ml 0.5 mol/L EDTA (pH 8.0)6)6DNA电泳缓冲液, 0.25 %溴酚蓝, 40%（W/V）蔗糖水溶液7)标准质量的DNA8)溴乙锭（EB）储存液 0.5

18、g/mL9)10X 缓冲液，500mmol/L KCl, 100mmol/L Tris-HCl(pH 8.3,室温)，15mmol/LMgCl2, 0.1%明胶;10)4XdNTP: 各1mmol/L11)Tag酶 1U/L12)DNA模板 1ng/L3.3仪器设备：取液器，恒温水浴锅，台式高速离心机，电泳仪，电泳槽，样品槽模板(梳子)，有机玻璃内槽，水平仪，紫外检测仪，微波炉，凝胶自动成像仪，PCR热循环仪，琼脂糖凝胶电泳系统4.实验方法4.1质粒DNA的限制内切核酸酶酶切1）取提取的质粒8 l于另一微量离心管中，加入2 l Bam H I和Not I的酶切混合液，轻弹管外混匀反应物。2）离

19、心，使溶液聚集在管底部。3）置于37水浴中酶解2h，加入总体积1/10的酶反应终止液，混匀以停止酶解反应。酶解样品置于冰箱中备用。4）取大量质粒，用Bam H I酶解2h后取5ul，电泳检查，如果完全酶切，用酚抽提，乙醇沉淀，溶于20ulddH20中，20保存备用。（见下一步骤）4.2琼脂糖凝胶电泳检测DNA1）称取0.3g琼脂糖，置于锥形瓶中，加入30mL1TAE缓冲液，微波炉加热直至琼脂糖溶解。待胶液冷却到650C（不烫手为宜），加入1l Gold view混匀，搅拌器上搅拌排除气泡。2）轻缓倒入封好两端和加上梳子的电泳胶板中，静置冷却30分钟以上。3）胶板放入电泳槽中（样品孔位于负极），

20、注入1TAE缓冲液淹没过胶板5mm。4）用取液器将提取的质粒DNA5 l与1 l上样缓冲液（ 6 ）混匀，加入胶板的样品小槽内。5）接通电泳槽与电泳仪的电源，设置电泳数据U=100 V, I=30 mA。6）当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1-2 cm处，停止电泳。7）将电泳后的凝胶浸入溴乙锭（EB）染色液中，染色至少15min观察在琼脂糖凝胶中的DNA带。（视情况，可省略）8）在凝胶成像分析系统中观察结果。4.3PCR-聚合酶链式反应1) 将PCR管放置在冰盒上，按如下表格加入PCR反应体系各成分PCR反应体系各成分的量模板0.1 lP1(20 mM)0.2 lP2(20 mM)0.2 ldNT

21、Ps(10 mM)0.4 lTaqs(5 U/l)0.2 l10PCR buffer2 lddH2O16.9 lTotal20 l2) 将PCR管放入PCR仪中，设定PCR仪的循环参数。预变性95 3 min，变性95 30 s，退火60-55 30 s，延伸72 1 min 10个循环，每个循环降0.5 。变性95 30 s，退火55 30 s，延伸72 1 min 20个循环，72 延伸 2 min。3) PCR扩增完毕后，取出PCP管放在冰盒上。4) 电泳检测。配置2%琼脂糖凝胶，取10L扩增产物电泳。电泳结束后，用EB染色15min，紫外灯下观察结果。5.实验结果预测：含目的基因的重组

22、质粒，得到有两条带，前面第一条带为GFP基因片段，第二条带为质粒载体，则成功构建了重组质粒pET-28a-GFP。若eGFP基因成功连接到pET-28a载体，PCR扩增后产物经过电泳检测，可以看到明显的一条亮带，其大小约为750 bp。其前面不明显的弥散的条带为引物二聚体。6.实验结果讨论：1）有时会发现质粒不能被限制酶所切割，可能是由于从细菌沉淀或从核酸沉淀中去除所有上清液时注没有去除干净。可通过酚/氯仿再次抽提，以清除杂质来解决问题。2）染色体DNA与质粒DNA分离的主要依据是什么？在一定电场强度下，DNA分子的迁移取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型(相对分子质量不同的DNA片

23、段泳动速度不一样)，且DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子：一般来说，其中闭环结构泳动最快，其次为线性结构，最慢的可能是单链开环。3）若得到了多条带，可能的原因有哪些？提取的质粒中还残留有大肠杆菌DNA的小片段；酶切时的酶量不够；4）应温度和时间对PCR的影响：如果实验中温度低于95，对DNA变性有很大影响，如果变性不完全，DNA双链会很快复性而减少产量，温度太高影响Tag酶活性。退火温度一般为5572，温度高会增强对不正确退火引物的识别，同时能降低3端不正确核苷酸错误延伸。72是引

24、物延伸条件，因为这个温度接近于M13为基础延伸条件。5）设计合理的PCR循环次数来避免由于产物的堆积等因素造成的平台效应。平台效应的因素包括：dNTP或引物等不断消耗；反应物的稳定度（dNTP或酶）；最终产物阻化作用（焦磷酸盐，双链DNA）；非特异性或引物的二聚体参与竞争作用。实验三、pET-28a-GFP重组质粒转化到表达菌BL-211.实验原理:细菌处于外源DNA的生理状态叫感受态。转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组DNA分子导入细菌的过程。其原理是细菌处于0，在有氯化钙存在的低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形。转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-磷酸钙复合物粘附于细胞表面，经42

25、短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型得到表达，然后将此细菌培养物涂在含有抗生素的选择培养基上。2.实验目的:将pET-28a-GFP重组质粒转化到表达菌BL-21上3.实验用品：感受态BL-21、重组质粒pET-28a-GFP、抗生素的LB液体培养基、四支EP管、IPTG、涂布器、平板等IPTG配成浓度为400 mM水溶液，-20 保存备用；液体LB培养基（pH7.0）胰蛋白胨 10 g/L酵母提取物 5 g/LNaCl 10 g/L NaOH(1 mol/L) 1 mL/L4.实验方法：1、取出感受态细胞DH5a让

26、其在冰上自然解冻，每200 l解冻的感受态细胞加入整管连接产物，混匀后冰浴30min。2、420C热冲击60秒，立即置于冰浴5min。3、再在感受态细胞混合物中加入0.8mL的LB培养基，于370C摇床中培养1h。4、 1h 后，6000r/min 离心3min，去掉上清（约留200L的培养液），摇匀菌块。5、用玻璃涂布器将溶液均匀涂布在含Kana的LB固体培养基上，正置培养皿半小时后，370C培养箱中倒置培养皿过夜。6、第二天早上观察结果。5.实验结果预测：含抗生素培养基平板中长出的菌落就是转化子6.实验结果讨论：首先此实验需要注意四个方面的问题：（1）转化率与外源DNA的浓度在一定范围内成

27、正比，但当加入的外源DNA的量过度或体积过大时，则会使转化率下降（2）防止杂菌和其他外源DNA的污染（3）整个操作过程均应在冰浴低温和无菌条件下进行，所用器皿，如离心管、EP管等均应彻底洗净，并经高压灭菌处理，所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其他试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂 DNA的转入，为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。（4）菌液涂平皿操作时，应避免反复来回涂，因为感受态细胞的细胞壁有了变化，过多的机械挤压涂布会使细胞破裂，影响转化率。实验四、重组绿色荧光蛋白（GFP）的诱导表达1.实验原理：载体具有一段大肠杆菌半乳糖苷酶的启动子及其编码的肽链的DNA序列，此结

28、构称为lacZ基因。lacZ基因编码的肽链与失去了正常氨基端的半乳糖苷酶突变体互补，这种现象称之为-互补。由-互补而形成的有功能活性的半乳糖苷酶，可以用X-gal（5-溴-4-录-3-吲哚-半乳糖苷）显色测定出来。因此，任何携带着lacZ基因的质粒载体转化了染色体基因组存在着此种半乳糖苷酶突变的大肠杆菌细胞后，便会产生出有功能活性的半乳糖苷酶，在IPTG诱导后，在含有X-gal的培养基平板上形成蓝色菌落。而当有外源DNA片段插入到位于lacZ 中的 多克隆位点后，就会破坏肽链的阅读框，从而不能合成与受体菌内突变的半乳糖苷酶相互补的活性肽，而导致不能形成有活性的半乳糖苷酶，因此，用紫外线照射后，

29、含有重组质粒载体的克隆就是绿色菌落。2.实验目的：对转化子进行删选鉴定3.实验用品： GFP重组菌液体LB培养基（pH7.0）胰蛋白胨 10 g/L酵母提取物 5 g/LNaCl 10 g/L NaOH(1 mol/L) 1 mL/LIPTG配成浓度为400 mM水溶液，-20 保存备用；4.实验方法：1、取出感受态细胞BL21让其在冰上自然解冻，每200l解冻的感受态细胞加入5l pET-28a-EGFP质粒 ，混匀后冰浴30min。2、420C热冲击90秒，立即置于冰浴5min。3、再将感受态细胞混合物转入0.8mL的LB培养基，于370C摇床中培养1h。期间将200L的24mg/ml I

30、PTG涂布在含Kana的LB培养基上，待用。4、 1h 后，6000r/min 离心5min，去掉上清（约留200l的培养液），摇匀菌块。5、用玻璃涂布器将溶液均匀涂布在含IPTG和Kana的LB固体培养基上，正置培养皿半小时后，370C培养箱中倒置培养皿过夜。6、第二天早上观察结果。5.实验结果预测： 在日光灯和紫外光下，携带重组质粒pET-28a-GFP的大肠杆菌BL-21用IPTG诱导表达后呈现绿色，说明含外源基因GFP的质粒在大肠杆菌BL-21体内成功表达；而没有经IPTG诱导的菌体则不发出绿色荧光。6.实验结果讨论：最后经过IPTG诱导表达，如果本组中未有一管表达成功，可能的原因：（

31、1）在转化过程中，由于操作不当，使重组质粒本身转化进入BL-21的量很少，故经IPTG诱导表达量就很少。（2）pET-28a质粒在菌体中的拷贝数本来就很低，和其他质粒相比量会少一些，可以多摇一段时间，16-18h都可以，略微提高抗生素的浓度，有助于提高拷贝数，加入IPTG后，有助于提高表达量。（3）由于表达菌株BL-21没有end-A突变，质粒的完整性和保真性都不如DH5，因为裂解时会有大量多糖干扰，质和量都不如DH5，pET质粒拷贝数很低，故重组质粒转化BL-21的效率相对较低；DH5是重组酶缺陷型，质粒在细胞内相对稳定，而BL-21为非重组酶缺陷型，转化进入其中的重组质粒不能稳定存在，故GFP诱导表达量就相对较低。四、实验总结和讨论本实验是一个综合性很强的实验，与我们平时的实验相比对我们的要求更多更严。