广东省自然科学基金标书.docx

1、广东省自然科学基金标书顺 序 号05004715类 别A申报学科代 码 1C03010502广东省自然科学基金自由申请项目重点博士启动申 请 书项 目 名 称：多巴胺受体对吗啡诱导的信号传导和基因表达的调控作用申 请 者：张 璐所 在 单 位： 南方医科大学（原第一军医大学）基础部邮 政 编 码： 510515通 讯 地 址： 广州同和南方医科大学申请者电话： 020-6传 真： 电 子 邮 件： 申 请 日 期： 2005-3-5广 东 省 自 然 科 学 基 金 管 理 委 员 会 二一 年 制填 报 说 明 一、填写申请书前 ，请先查阅广东省自然科学基金有关项目申请办法及规定。申请书各项

2、内容 ，应实事求是，逐条认真填写。表达要明确、严谨，字迹清晰易辨。外来语要同时用原文和中文表达 。第一次出现的缩写词 ，须注出全称。二、申请书请用A4复印纸，于左侧装订成册。第三页起各栏空格不够时，请自行加页 。一式八份（至少一份为原件），由所在单位审查签署意见后，按申报通知送广东省自然科学基金管理委员会办公室 。 三、封面右上角“顺序号”由各单位根据广东省自然科学基金管理委员会办公室的要求填写；“项目类别”栏由申请者填写, 申请“省自然科学基金自由申请项目”此栏为“A”, “省自然科学基金重点项目”为“C”，“省自然科学基金博士启动项目”为“D”。一、简表研究项目情况名称多巴胺受体对吗啡诱导

3、的信号传导和基因表达的调控作用类别A. 自由申请项目研究类型A. 基础研究C. 重点项目AB. 应用基础研究AD博士启动项目申报学科名称1神经毒理学代码1C03010502名称2分子神经生物学代码2C010601申请金额6万元研究期限2006年1月至 2007年12月所用实验室实验室全称南方医科大学广东省功能蛋白质组学重点实验室实验室类别A. 国家重点B. 部门开放实验室编号C. 省重点实验室C申请者情况姓名张璐性别A. 男身份号码4402x民族名称汉B. 女B代码01专业技术职务名称副教授学位A.博士B.硕士C.学士最终学位授予国国(地区)名中国其他身份A. 院士B. 博士生导师C. 在站博

4、士后D. 留学回国人员D代码012A代码156所在单位全称南方医科大学（原第一军医大学）代码系(所)基础部项目组情况主要成员（不含申请者）姓名身份证号码专业技术职务所在单位全称及代码项目中的分工签章人员统计总人数高级中级初级在站博士后在读博士生在读硕士生参加单位数411121研 究 内 容 和 意 义摘 要 阿片类毒品成瘾的核心问题是长期使用阿片类药物后，中枢神经系统产生可塑性变化，而这种可塑性变化的基础是基因和分子水平的变化。本研究针对阿片类毒品成瘾时细胞内信号传导通路和基因诱导表达的变化，应用D1与D3多巴胺受体基因敲除小鼠模型，采用分子生物学、细胞生物学、免疫组织化学等综合性手段研究阿片

5、类药物吗啡对MAPK信号传导通路的激活作用，并对D1和D3多巴胺受体在吗啡诱导的MAPK信号传导通路、早期反应基因c-fos和CREB、晚期反应基因表达中的调控作用进行系统研究，从而在分子水平上阐明阿片类毒品成瘾的发生机制，为该领域的基础研究和临床治疗提供新的理论和方法。主题词（主题词应反映研究内容，主题词数量不多于三个，各主题词之间以逗号分隔）多巴胺受体，吗啡，基因表达简 表 填 写 要 求一、简表内容必须逐项认真填写，采用国家公布的标准简化汉字。简表中所有代码，以国家自然科学基金规定的代码为准填写。二、凡选择性栏目，将相应提示符、等之一填入该栏的右下角。三、部分栏目填写要求：项目名称应确切

6、反映研究内容和范围，最多不超过个汉字（包括标点符号）。基础研究指以认识自然现象、探索自然规律为目的，不直接考虑应用目标的研究活动。应用基础研究指有广泛应用前景,但以获取新原理、新知识、新方法为主要目的的研究。申报学科申请项目所属的最基础学科。 如涉及多学科可填写两个，先填写主学科。申请金额以万元为单位，用阿拉伯数字表示。研究期限研究期限一般从申请的次年月算起。终止时间为完成年度的月。所用实验室系指研究项目将利用的实验室。留学回国人员指在国外取得学位或访问学者一年以上的回国人员。所在单位名称及代码按单位公章填写全称。首次申请广东省自然科学基金的单位，尚未编入单位代码，其代码应向广东省自然科学基金

7、管理委员会办公室申请后填写。参加单位数指研究项目组主要成员所在单位数，包括主持单位和合作单位(合作者所在单位)，以阿拉伯数字表示。项目组主要成员指在项目组内对学术思想、技术路线的制订与理论分析及对项目的完成起重要作用的人员，本人应在申请书上亲自签名。 二、立论依据1目的意义吸毒是全世界广泛关注的问题。据公安部门的最新资料，我国登记在案的吸毒人数达105万人，但实际人数远远高于此。广东省吸毒现象在全国较为突出。至年底，广东省累计登记在册的吸毒人员达万人，这些吸毒人员一年至少吸掉亿元。在我国，毒品问题主要是海洛因等阿片类（opiate）毒品，因此开展对阿片类毒品成瘾机理的研究，寻找有效的治疗阿片成

8、瘾的药物，具有深远的社会意义。毒品成瘾(drug addiction)指不择手段、不记后果地强制性地获取、使用某种毒品(drug)。阿片成瘾的形成是一个综合性的过程，受多种因素调控，既受心理性的、社会性因素影响，也受基因遗传性因素影响。阿片成瘾一旦形成，即可能成为一种终生性的状态。成瘾者不择手段地攫取(crave)毒品，具有极高的复发性(relapse)，甚至在戒断(abstinence)多年后仍有可能复发(relapse)，造成很大的社会问题。阿片成瘾的形成是一个循序渐进的过程，在此过程，机体在分子、细胞学水平发生了代偿性变化，进而导致成瘾的一系列症状（Koob et al, 1998; W

9、hite and Kalivas, 1998; Nestler, 2001; Hyman and Malenka, 2001; Laakso et al, 2002）。阿片类药物成瘾的核心问题是长期使用阿片类药物后，中枢神经系统产生可塑性变化，而这种可塑性变化的基础是基因和分子水平的变化。激活多巴胺系统是包括阿片类、可卡因在内的多种毒品成瘾性的共同神经生物学特点。多巴胺受体在毒品介导的基因表达调控中发挥重要作用。以往关于多巴胺受体与成瘾性的关系多集中在可卡因类毒品，对于多巴胺受体在阿片类毒品成瘾性中的分子机制尚不甚明了。本研究拟应用D1与D3多巴胺受体基因敲除动物模型研究多巴胺受体对阿片类毒品

10、诱导的细胞内信号传导及基因表达的调控作用，它有两方面的意义：一方面是探讨阿片类毒品作用下细胞内信号传导及基因表达变化，为阿片类成瘾提供分子机制；另一方面探讨不同多巴胺受体亚型对细胞内信号传导及基因表达的作用，可进一步在分子水平上阐明多巴胺受体在阿片成瘾中的作用，为该领域的基础研究和临床治疗提供新的理论和方法。2国内外研究现状多巴胺信号通路与多巴胺受体 神经解剖学基础：机体包括三条多巴胺传导通路：黑质纹状体通路(nigrostriatal pathway)，起源于中脑黑质(substantia nigra)的多巴胺合成神经元，投射到远侧纹状体尾壳核（dorsal striatum,caudopu

11、tamen）该通路主要参与感觉传动的协调与运动的起始，该通路的退行性变化可导致Parkinson疾病；中脑边缘(mesolimbic)多巴胺通路, 起源于腹侧背盖区(ventral tegmental area, VTA), 主要投射到腹侧纹状体伏核(nucleus accumbens, Nac)，该通路主要参与动机(motivation)行为； 第三条通路中脑皮质(mesocortical) 多巴胺通路起源于VTA，投射到前大脑皮质区(prefrontal cortex)，该通路与学习和记忆有关。神经生物学共点： 激活中脑边缘系统多巴胺系统是多种毒品成瘾性的共同神经生物学特点。在毒品的作用下

12、，腹侧背盖区(ventral tegmental area, VTA)多巴胺神经元的放电活动增强, 从而导致伏核区(nucleus accumbens, NAc)及其他一些神经核的多巴胺释放增强。并且，不同的药物有其相对独特的特点：可卡因(cocaine)主要作用于突触前多巴胺转运体(transporters)，从而使得突触间隙的多巴胺素显着增高；而阿片类(opiate)毒品通过抑制腹侧背盖区的?-氨基丁酸能(GABA)神经元，从而使得NAc的多巴胺释放明显升高，影响多巴胺传导通路的功能。多巴胺受体：迄今，已克隆出5种多巴胺受体，分为两大类：D1 类和D2类。D1 类受体包括D1和D5受体，而

13、D2类受体包括D2、D3和D4受体。D1类受体与激动型Gs蛋白结合，激活酰苷环化酶及增高cAMP含量；而D2类受体与拮抗型Gi蛋白结合，抑制酰苷环化酶及降低cAMP含量。D1 多巴胺受体是体内分布最广泛的受体，主要分布于纹状体、伏核与嗅球，同时在边缘系统、下丘脑与丘脑中也有表达。D3 多巴胺受体主要分布于NAc，嗅球与Calleja岛，同时在CPu也有一定的表达。多巴胺受体与毒品诱导的基因表达调控阿片类、可卡因等毒品通过多巴胺受体影响细胞内信号传导通路，而影响基因的表达，这些基因表达的变化参与神经元可塑性(neuron plasticity)的形成，并最终导致成瘾后行为学上的改变。在分子水平上

14、，这种量变到质变是个多步骤过程。早期反应基因(immediate early gene, IEG)的诱导表达: 单一毒品注射即可在短时间内诱导早期反应基因表达。fos与jun家族编码早期反应基因。Fos家族包括c-Fos, FosB, Fra-1, Fra-2；Jun家族包括c-Jun, JunB 和JunD。Fos与Jun家族蛋白形成二聚体活化蛋白1(activator protein-1, AP-1)，AP-1进一步与靶基因调控区中相应的AP-1位点结合，调节基因的转录。多巴胺受体参与毒品成瘾性的发生与发展(Xu et al., 1994a; Xu et al., 1994b; Xu et

15、 al., 1997; Xu et al., 2000; Carta et al., 2000; Caine et al., 2002)。并且，多巴胺受体通过调控Fos家族而参与对毒品成瘾的调节(Graybiel et al, 1990; Nestler 2000)。例如急性可卡因刺激可以通过D1多巴胺受体诱导c-Fos的表达；给予动物双侧伏核注射c-fos的反义核酸，可降低急性可卡因刺激引起的的自主活动（locomotion）的增强(Heilig et al, 1993).；应用D1多巴胺受体基因敲除小鼠，我们发现在急性可卡因作用下，c-Fos, FosB, Fra-2 和JunB在D1多巴

16、胺受体基因敲除小鼠中的诱导表达丧失，并且D1和D3多巴胺受体对c-fos起到相反的调节作用。类似地，吗啡也可以诱导NAc和Cpu区c-fos 和junB的表达，并且D1多巴胺受体拮抗剂可以抑制这种作用，提示多巴胺受体参与介导阿片类毒品诱导的早期反应基因的诱导表达(Liu J et al.,1994; Bontempi B et al 1997)。晚期反应基因的诱导表达：毒品的长期作用下，并在早期反应基因变化的基础上，机体的基因发生相对长期的变化。我们应用D1多巴胺受体基因敲除小鼠发现慢性可卡因作用下?FosB的诱导表达丧失，同时G?olf、?-catenin和BDNF的表达也发生了变化，这提示

17、D1多巴胺受体在可卡因诱导的基因表达调控中起关键作用(zhang D et al, 2002)。有趣的是，我们发现D1和D3多巴胺受体对下游的长期诱导靶基因Neogenin和SynaptotagminVII起到相反的调节作用(Zhang L et al, 2004)。这些基因的长期变化，参与神经元可塑性的形成，并进一步参与毒品药物后的行为学变化。MAPK 信号通路在毒品成瘾性中的作用丝裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinases, MAPKs)是真核细胞介导细胞外信号到细胞内反应的主要信号传导系统，由于其对生物系统功能调节具有普遍意义，近年来已成为细胞

18、内信号传导研究的热点(Pelech,1996; Kyriakis,1996)。哺乳动物细胞至少存在四条MAPK信号传导通路，即ERK (extracellular-regulated protein kinase)、JNK(SAPK)(c-Jun N-terminal kinase or stress-activated protein kinase)、ERK5(BMK1)和p38 MAPK通路(Pelech,1996; Kyriakis,1996; Downey,1998)。近年来，ERK通路在神经系统中的功能研究引人注目，该通路参与介导神经元分化、凋亡、神经元突触可塑性及长时程增强(lon

19、g-term potentiation)等重要的生理、病理反应。并且越来越多的实验提示，ERK通路在毒品成瘾性的发生、发展过程中起重要作用。急性可卡因刺激可以激活小鼠Cpu区ERK激酶，ERK抑制剂可阻断可卡因对小鼠的奖赏效应(Valjent et al., 2000)；而慢性可卡因刺激导致VTA区ERK激酶活性持续增强(Berhow et al., 1996)。应用D1与D3基因敲除小鼠模型，我们发现可卡因作用下ERK激酶在野生型小鼠中呈现时间依赖性的激活，ERK的活化在D3基因敲除小鼠中增强，而在D1基因敲除小鼠中丧失，即D1和D3多巴胺受体对ERK起反向调控作用(Zhang L, et

20、al., 2004)。上述现象提示毒品对ERK通路的激活作用可能参与毒品成瘾后机体神经可塑性的长期变化。毒品成瘾的转录调控机制基因表达的转录调控在毒品成瘾性的发生发展中起重要的作用。慢性、长期的使用毒品，导致细胞核功能变化，进而通过影响细胞内信号传导通路而导致某些特定基因转录速率改变。进一步，这些基因诱发神经元功能活动发生变化，并使得神经通路功能活动变化，最终导致行为学上复杂的改变。众多的转录因子参与神经元基因表达的调控，但迄今，有两类转录因子在毒品成瘾性中的作用研究的较为透彻，即cAMP反应元件结合蛋白(cyclic-AMP response element binding protein,

21、 CREB)和?FosB。CREB: CREB的结合序列是cAMP反应元件(cAMP response element, CRE)。CRE存在于许多基因的调控序列之中，其核心序列为TGACGTCA。CREB 多种细胞内信号传导通路的交会点，CREB可以被PKA、CaMKIV及生长因子Ras蛋白激酶通路激活，使得其133位丝氨酸磷酸化活化，进而活化的CREB与 CRE结合形成二聚体，激活基因的转录反应( Mayr B et al,2001; Lonze BE et al,2002)。?FosB：?FosB属于Fos家族成员，由fosB基因编码，经过化学修饰，为FosB的异构体，分子量在35-37

22、kDa。在毒品的作用下，在1-4小时之内Fos家族成员被迅速激活，主要发生在伏核和尾壳核(caudoputamen)，4-12小时后蛋白恢复基础水平。相反地，急性毒品刺激仅轻微地升高FosB的表达量。随着长期、反复地施用毒品，由于FosB在体内的高度稳定性，FosB的含量逐步聚集，并成为主导成分。D1和D3多巴胺受体在毒品成瘾性中的作用D1受体是体内分布最广泛的受体，而D3受体的分布较为局限。D1与D3受体在NAc与Cpu区共定位于同一神经元。有趣的是，D1与D3多巴胺受体在毒品成瘾性的发生、发展过程中既有相互对立的又有相互协调的作用。应用基因敲除动物模型发现， D1多巴胺受体的敲除可导致小鼠

23、对急性可卡因的自主活动丧失，而D3受体的敲除使小鼠自主活动增强。而基因表达检测发现，D1与D3受体对NAc区P物质(substance P)的表达起协同调控作用，而对Calleji岛c-fos基因表达起反向调控作用。进一步，我们应用D1与D3基因敲除小鼠模型，对D1和D3受体在可卡因诱导的ERK信号通路、早期反应基因、晚期反应基因表达中的作用进行了系统研究，发现D1与D3多巴胺受体对ERK通路起反向调控作用，即D1受体促进ERK的激活而D3受体抑制ERK的激活，并且D1和D3多巴胺受体对早期反应基因c-fos的诱导表达也起反向调控作用；与此相应地，在可卡因长期作用下晚期反应基因Neogenin

24、和SynaptotagminVII的表达也在D1与D3受体基因敲除模型中呈现出相反的变化。而这种基因表达的相反性变化模式有可能是其自主活动反向变化的基础 (Zhang L et al., 2004)。本实验的整体构思在上述研究基础上，我们设想阿片类毒品可能通过多巴胺受体信号通路而调控MAPK通路，进而调控早期与晚期靶基因的诱导表达，并进一步参与阿片类毒品成瘾的发生与发展。本研究拟应用D1与D3多巴胺受体基因敲除动物模型，总体构思如下：1、确定阿片类毒品对MAPK信号通路的激活作用及D1与D3多巴胺受体在阿片诱导的MAPK激活中的作用。2、探讨D1与D3多巴胺受体对阿片类作用下的早期靶反应基因和

25、晚期靶反应基因的调控整体构思见下图： Opiate 多巴胺受体： D1 receptor / D2 receptor （） D3 receptor MAPK： ERK, JNK, p38早期反应基因： CREB, or c-fos 晚期反应基因： Target genes Neuroadaptation3本项目的特色和创新之处（1）在我国，毒品问题主要是海洛因等阿片类（opiate）毒品，因此开展对阿片类毒品成瘾机理的研究，寻找有效的治疗阿片成瘾的药物，无疑具有深远的社会意义和巨大的市场前景。阿片类药物成瘾的核心问题是长期使用阿片类药物后，中枢神经系统产生可塑性变化，而这种可塑性变化的基础是基

26、因和分子水平的变化。本研究以阿片成瘾为研究模型，可进一步在分子水平上阐明阿片成瘾的发生机制，为该领域的基础研究和临床治疗提供新的理论和方法，具有重要的理论与实践意义。（2）吗啡是阿片的主要活性成分，有着强大的药理学活性和极强的成瘾性。其药理活性极其诱人，而其成瘾性又限制了其临床应用。半个多世纪来，人们一直试图合成新的阿片类化合物，希望能保留吗啡强大的镇痛作用，同时没有成瘾性。然而时至今日，这一设想尚未成功。因此人们从成瘾的生物学角度出发，探讨吗啡成瘾的神经生物学机制，为最终解决阿片类毒品成瘾提供新的思路。（3）激活多巴胺系统是包括鸦片类、可卡因在内的多种毒品成瘾性的共同神经生物学特点。但以往关

27、于多巴胺受体在毒品成瘾性的分子机制多集中在可卡因类的研究上， 而对于多巴胺受体在阿片类药物中分子调控机制，尚不明了。故本研究针对多巴胺受体，研究其对阿片类诱导的细胞内信号传导通路和基因表达的调控作用，为该领域补充材料（4）D1受体是体内分布最广泛的受体，而D3受体的分布较为局限。D1与D3多巴胺受体在毒品成瘾性的发生、发展过程中既有相互对立的又有相互协调的作用。但关于D1和D3多巴胺受体在阿片成瘾中起何作用，如何发挥作用，尚不明了。本研究系统地探讨D1和D3多巴胺受体对阿片类药物诱导的基因表达变化，可以填补这一空白。（5）传统地研究受体的功能是应用受体的拮抗剂与激活剂，但由于拮抗剂与激活剂缺乏

28、特异性，对于研究受体功能是一缺陷。本研究应用D1和D3基因敲除小鼠模型，特异地针对某一特定的受体，特异性强，克服了传统方法的局限，可以提供更切实可靠的结果。（6）MAPK传导通路是当今世界上的研究热点。探讨MAPK通路在药物依赖中作用的研究才刚刚起步。本研究系统地探讨阿片类对MAPK通路的影响，对于揭示MAPK和阿片依赖具有指导意义。4参考文献Aston-Jones G, Rajkowski J, Cohen J. Role of locus coeruleus in attention and behavioral flexibility. Biol Psychiatry, 1999; 46

29、(9): 1309-20Barrot M, Olivier JD, Perrotti LI, DiLeone RJ, Berton O, Eisch AJ, Impey S, Storm DR, Neve RL, Yin JC, Zachariou V, Nestler EJ. CREB activity in the nucleus accumbens shell controls gating of behavioral responses to emotional stimuli. Proc Natl Acad Sci U S A, 2002; 99(17): 11435-40. Epu

30、b 2002 Aug 06.Berhow MT, Hiroi N, Nestler EJ (1996) Regulation of ERK (extracellular signal regulated kinase), part of the neurotrophin signal transduction cascade, in the rat mesolimbic dopamine system by chronic exposure to morphine or cocaine. J Neurosci 16:4707-4715.Bibb JA, Chen J, Taylor JR, Svenningsson P, Nishi A, Snyder GL, Yan Z, Sagawa ZK, Ouimet CC, Nairn AC, Nestler EJ, Greengard P. Effects of chronic exposure to cocaine are regulated by the neuro