新方法能力验证确认报告水质 叶绿素a的测定 分光光度法 HJ 897.docx

1、新方法能力验证确认报告水质 叶绿素a的测定 分光光度法 HJ 897XXXX有限公司新项目方法验证能力确认报告项目名称：水质 叶绿素a的测定 分光光度法HJ 897-2017项目负责人：项目审核人：项目批准人：批准日期： 年 月 日水质 叶绿素a的测定 分光光度法HJ 897-2017方法验证能力确认报告1.方法依据及适用范围本方法依据水质 叶绿素a的测定 分光光度法（HJ 897-2017）。本方法适用于适用于地表水中叶绿素 a 的测定。本方法测定丙酮提取液中叶绿素 a 的检出限为 0.04 mg/L。当取样体积为 200 ml，丙酮提取液体积为 10 ml 时，本方法的检出限为 2 g/L

2、，测定下限为 8 g/L。警告：丙酮对人体健康有一定危害，操作时应在通风橱中进行，佩戴防护器具，避免接触皮肤和衣物。2.方法原理及干扰将一定量样品用滤膜过滤截留藻类，研磨破碎藻类细胞，用丙酮溶液提取叶绿素，离心分离后分别于 750 nm、664 nm、647 nm 和 630 nm 波长处测定提取液吸光度，根据公式计算水中叶绿素 a 的浓度。3.主要仪器、设备及试剂除非另有说明，分析时均使用符合国家标准的分析纯试剂，实验用水为新制备的去离子水或蒸馏水。3.1试剂和材料3.1.1丙酮（CH3COCH3）。3.1.2碳酸镁（MgCO3）。3.1.3丙酮溶液：9+1。在 900 ml 丙酮中加入 1

3、00 ml 实验用水。3.1.4碳酸镁悬浊液。称取 1.0 g 碳酸镁，加入 100 ml 实验用水，搅拌成悬浊液（使用前充分摇匀）。3.1.5玻璃纤维滤膜：直径 47 mm，孔径为 0.45 m0.7 m。3.2主要仪器和设备3.2.1分光光度计，配备10mm比色皿，1台，型号：XXXX，编号：XXXXXXXX，检定证书编号：XXXX，检定有效期限：XXXX年XX月XX日。3.2.2采样瓶：500 ml 具磨口塞的棕色玻璃瓶。3.2.3玻璃研钵。3.2.4离心机，型号：XXXX，编号：XXXXXXXX。3.2.5玻璃刻度离心管：15 ml。3.2.6针式滤器：0.45 m 聚四氟乙烯有机相针

4、式滤器。3.2.7一般实验室常用器皿和设备。4.样品的采集与制备4.1样品采集按照 GB/T 14581、HJ/T 91 和 HJ 494 中的相关规定进行样品的采集。样品的采集一般使用有机玻璃采水器或其他适当的采样器采集水面下0.5m样品，湖泊、水库根据需要可进行分层采样或混合采样，采样体积为1 L或 500 ml。如果样品中含沉降性固体（如泥沙等），应将样品摇匀后倒入 2 L 量筒，避光静置 30 min，取水面下 5 cm 样品，转移至采样瓶。在每升样品中加入 1 ml 碳酸镁悬浊液，以防止酸化引起色素溶解。注：如果水深不足 0.5 m，在水深 1/2 处采集样品，但不得混入水面漂浮物。

5、4.2样品保存样品采集后应在 0 4 避光保存、运输，24 h 内运送至检测实验室过滤（若样品24 h 内不能送达检测实验室，应现场过滤，滤膜避光冷冻运输），样品滤膜于-20 避光保存，14 d 内分析完毕。注：样品采集后，如条件允许，宜尽快分析完毕。4.3试样的制备4.3.1过滤在过滤装置上装好玻璃纤维滤膜。根据水体的营养状态确定取样体积，见表 1，用量筒量取一定体积的混匀样品，进行过滤，最后用少量蒸馏水冲洗滤器壁。过滤时负压不超过 50 kPa，在样品刚刚完全通过滤膜时结束抽滤，用镊子将滤膜取出，将有样品的一面对折，用滤纸吸干滤膜水分。注：仅当富营养化水体的样品无法通过玻璃纤维滤膜时，可采

6、用离心法浓缩样品，但转移过程中应保证提取效率，避免叶绿素a的损失及水分对丙酮溶液浓度的影响。表1参考过滤样品体积营养状态富营养中营养贫营养过滤体积（mL）10020050010004.3.2研磨将样品滤膜放置于研磨装置中，加入 3 ml4 ml 丙酮溶液，研磨至糊状。补加 3 ml4 ml 丙酮溶液，继续研磨，并重复 12 次，保证充分研磨 5 min 以上。将完全破碎后的细胞提取液转移至玻璃刻度离心管中，用丙酮溶液冲洗研钵及研磨杵，一并转入离心管中，定容至 10 ml。注：叶绿素对光及酸性物质敏感，实验室光线应尽量微弱，能进行分析操作即可，所有器皿不能用酸浸泡或洗涤。4.3.3 浸泡提取将离

7、心管中的研磨提取液充分振荡混匀后，用铝箔包好，放置于 4 避光浸泡提取 2 h以上，不超过 24 h。在浸泡过程中要颠倒摇匀 23 次。4.3.4离心将离心管放入离心机，以相对离心力 1000 g（转速 3000 r/min4000 r/min）离心 10 min。然后用针式滤器过滤上清液得到叶绿素 a 的丙酮提取液（试样）待测。4.4空白试样的制备用实验用水按照与试样的制备相同的步骤进行实验室空白试样的制备。5.分析步骤5.1试样测定将试样移至比色皿中，以丙酮溶液为参比溶液，于波长 750 nm、664 nm、647 nm、630 nm 处测量吸光度。注：750 nm 波长处的吸光度应小于

8、0.005，否则需重新用针式滤器过滤后测定。5.2空白试验按照与试样测定（5.1）相同的步骤进行实验室空白试样（4.4）的测定。6.结果计算与表示6.1结果计算试样中叶绿素 a 的质量浓度（mg/L），按照下式进行计算：式中：1试样中叶绿素 a 的质量浓度，mg/L；A664试样在 664 nm 波长下的吸光度值；A647试样在 647 nm 波长下的吸光度值；A630试样在 630 nm 波长下的吸光度值；A750试样在 750 nm 波长下的吸光度值。样品中叶绿素 a 的质量浓度（g/L），按照下式进行计算：式中：样品中叶绿素 a 的质量浓度，g/L；1试样中叶绿素 a 的质量浓度，mg/

9、L；V1试样的定容体积，ml；V取样体积，L。6.2 结果表示当测定结果小于 100 g/L 时，保留至整数位；当测定结果大于等于 100 g/L 时，保留三位有效数字。7.方法能力验证7.1检出限按照样品分析的全部步骤，实验室重复测定7次空白试样。在仪器最佳稳定状态下测定空白值，统计其标准偏差并计算其检出限，检出限=t(n-1,0.99)S（其中t(n-1,0.99)=3.143），结果如下表2所示：表1方法检出限测定数据空白试样1234567样品浓度（g/L）平均值（g/L）标准偏差S（g/L）检出限MDL（g/L）由表1可知，当取样体积为 200 ml，丙酮提取液体积为 10 ml 时，

10、实验室检出限为x.xxg/L（测定下限为4倍检出限）小于方法检出限2 g/L（测定下限8 g/L），符合标准方法要求。注：方法检出限测定次数最少7次，可以适当增加测定次数，t值取值见HJ 168-2010。7.2精密度和准确度实验室分别对叶绿素 a质量浓度为5g/L、11g/L、25g/L的标准样品（标准样品编号：XXXXXXXX、XXXXXXXX、XXXXXXXX，有效日期：XXXXXXXX、XXXXXXXX、XXXXXXXX）进行6次重复测定，结果如表2所示：表2方法精密度和准确度测定数据标准样品测定结果标准值（g/L）51125样品浓度（g/L）123456平均值（g/L）相对误差RE（

11、%）标准偏差S（g/L）相对标准偏差RSD（%）由表2可知，本实验室空白加标样品6次测试结果所得的相对误差RE为x.x%xx%，准确度符合要求；相对标准偏差RSD为x.x%xx%，精密度符合标准方法要求。实验室实验室分别对叶绿素 a质量浓度为11g/L、25g/L的标准样品（标准样品编号：XXXXXXXX、XXXXXXXX，有效日期：XXXXXXXX、XXXXXXXX、）进行加标回收测定，测定结果如表3所示：表3实验室加标回收测定数据标准样品测定结果标准值（g/L）1125加标量（g/L）928样品浓度（g/L）123456平均值（g/L）加标回收率（%）由表3可知，本实验室加标回收测定结果为

12、x.x%和x.x%，符合方法标准要求。8.监测实例本单位实验室两组人员分别对某河道地表水进行采样监测，同时进行实际样品加标测定，标准品浓度值为xxx g/L，标准品编号为：XXXXXXXX，有效期限：XXXX年XX月XX日，加标浓度为XX g/L（浓度接近实际样品浓度）。测定结果如下表4和表7所示：表4：监测实际样品及加标回收测定数据实际样品测定结果人员1人员2实验室空白实际样品加标样品实际样品加标样品样品浓度（g/L）相对误差（%）/实际加标回收率（%）/注：实验室空白结果须小于方法检出限。由表4可知，本实验室两组人员测定结果相对误差为XX%，符合实验室人员比对分析质量控制要求；实际样品加标回收率分别为x.x%和x.x%，符合方法标准要求。9.结论通过验证，依据本方法依据水质 叶绿素a的测定 分光光度法（HJ 897-2017）对地表水中叶绿素a的监测，本实验室设备、人员能力、方法的检出限、精密度、准确度等均满足标准方法要求。