BDFACSCalibur流式细胞仪培训手册.docx

1、BDFACSCalibur流式细胞仪培训手册BD FACalbur流式细胞仪FACS10 Handbo本课程介绍表面抗原流式分析有关之基础工作原理。如希望进一步了解流式细胞技术应用,请至本公司网站订阅FASinormtin电子报c:iknowdocsharedatacur_workhttp：。如需要本课程手册，欢迎至本公司网站下载 。如需要免疫荧光染色方法，请至本公司网站下载 c:iknowdocsharedatacur_workhttp：。一、BDFACSalibu基本结构1.仪器本体：1. 电源开关：在D FCSCabur仪器右侧下方，先启动仪器本体，再打开计算机.2.光学系统：BD AC

2、SCalibur 基本配有一支波长488 m 的氩离子雷射以BD ACSCalibu基本型为例FS Did 只收488 nm波长散射光SC MT 只收488nm波长散射光FL PT 荧光光谱峰值落在绿色范围(波长554 m）FL2 P 荧光光谱峰值落在橙红色范围（波长56406 m）L3 M 荧光光谱峰值落在深红色范围（波长 60nm）3 仪器面板：仪器前方面板的右下方有三个流速控制键、及三个功能控制键。流速控制：O： 样品流速：12 /minME:样品流速:5 l mnI： 样品流速：60 l/n功能控制:RU：此时上样管加压,使细胞悬液从进样针进入流动室。(正常显示绿色；黄色时表示仪器不正

3、常，请检查是否失压。)TNDBY：无样品或暖机时之正常位置,此时鞘液停止流动，雷射功率自动降低。IME：去除流动室中的气泡,流动室施以反向压力，将液流从流动室冲入样品管,持续一定时间后,以鞘液回注满流动室。RIME结束,仪器恢复TADBY状态。4. 储液箱抽屉:在主机左下方之储液箱抽屉。可向前拉开，内含鞘流液筒、废液筒、鞘液过滤器Sheath ier，及空气滤网Air filter。请注意气路减压阀ENT TOGGLE之位置.鞘液筒：位于抽屉左侧，容积升。装八分满鞘液筒,仪器可以运行大约 3小时。筒上装有液面感应器，鞘液用完时，仪器软件上会有显示.鞘液筒盖上有金属环扣，保证鞘液筒密闭.废液筒：

4、位于抽屉右侧，容积升.筒上装有液面感应器,废液盛满时，仪器软件上会有显示。注意废液可能有潜在的生物传染性。鞘液过滤器:2过滤器,去除鞘液中的杂质,保证进入流动室的鞘液是干净的。气路减压阀：沿箭头方向移动阀门开关，鞘液筒减压,气压恢复正常.在鞘液筒添加鞘液时，需要减压。空气过滤网:用于过滤冷却雷射的空气.5. 上样品区:上样品区是样本管的上样位置。它包括三个部分，一个是进样针Sae nctio ube,将样本输入流动室，还有就是支撑架 ube Sppt Am、和液滴存留系统Droletaiment St。进样针:是一根不锈钢管，将细胞从样本针中吸入流动室.进样管外有一套管,是液滴保留系统的一部分

5、。支撑架：用于支撑样本管、并负责启动液滴存留系统。支撑架有三个位置：位于样本管之下的中位,样本管左侧或右侧。液滴存留系统:系统由支撑架、真空帮浦和外套管组成。当支撑架位于左侧或右侧位置时，真空帮浦就会启动,将液体从外管吸入废液筒内。上样时,须注意将支撑架位于中位,以避免过多样品被抽吸到废液筒内（当支撑架位于中位，真空帮浦停止工作）。更换样品时,让仪器保持RUN的模式，使得进样针可以反冲;切换到STADBY模式前，确保液路已冲洗彻底以免碎片沈积到流动室中。12 Mcintsh计算机与打印机：准备您的细胞样品1.理想样品浓度调至11 X 105 clsml?一般实验只需0。5的样品.2.细胞样品务

6、必放至BDFALCON 3252 试管中，否则无法上机。3.上机前务必去除样品中之细胞团块，以防止管路堵塞？可使用附滤网B LCON试管 （C. No.35223） 或355 的尼龙筛网。4.供流式分析的样品是单细胞悬浮液，而且大部分样品都需经荧光染色。表面抗原荧光染色的方法大致有两种：直接免疫荧光、间接免疫荧光染色.研究生可至本公司网站下载染色方法 m.tw/bb105-4-1.html直接免疫荧光染色Lysed No - Wash PrcdueLysed Wash ocedur, SilTET HLA-B2Perphera Bloo Mononuce Cell Procedureukemi

7、a anLyphoa Procedu 1Leukmia and Lymphorocue 2， BellClonlity Asa间接免疫荧光染色滴定抗体浓度常用试剂5.如因特殊因素无法下载上述实验方法，请eal:c:iknowdocsharedatacur_workmilo：或 c:iknowdocsharedatacur_workmalto:。二、开机、关机标准操作21AC alir 开机1.开启细胞仪电源.2.开启其它周边配备电源,如打印机及MO机.3.开启计算机.4.确认鞘流液筒有八分满的FACSlo，确实旋紧 (鞘液筒容量为）。5.将废液倒掉，并在废液筒中加入0家用漂白水 （废液筒容量为

8、4L）。6.将减压阀方向调在加压（Pesze)位置.7.排除液流管路与过滤器中的气泡。8.取下样品管，执行PRI 功能两次。9.使用m PBS，HIH RUN 两分钟。10.可开始分析样品。2 AS Calibu 关机关机前必要动作:清洗进样管和外套管，防止进样管堵塞、或有染料残留。1.将样品支持架左移，取 2 m FACSClean(0%lah)上样品,让仪器的真空系统抽取约 m的液体。2.将样品支持架回正，按 HI RUN，然后让 FACSClen 清洗管路10分钟。3.按Sandby，取下样品管,执行 PRIM功能两次。4.取 l dH2O,重复上述步骤1-3。5.注意最后只留约 1 m

9、l d2O 在试管中。6.按 ANDBY 五分钟,使风扇冷却雷射后，关闭细胞仪（必要动作,以保护雷射光源。）7.倒掉废液,并回填200ml漂白水。8.将减压阀放在VENT 漏气位置。将鞘流液筒充填至八分满。9.退出软件“File”“Qui”（如有对话选项,选择“Dotave”）。确认退出计算机中所有应用软件，所有数据数据已储存备份。10.关闭计算机。“pca“hdn。三、上机分析流程建议首次试机避免进行大量试验，仅需准备下列样品。()egative Cotrl（不加任何抗体)。（2）CDI(L单染)。（3)CD1PE(L2单染）.（4）CDFIT /CD19PE（F1/FL2双染）.31lib

10、ur 开机1 先开启细胞仪本体再打开计算机。秘技:如顺序相反,仪器和计算机之间无法建立正常通讯，无法执行“coectto ctometr。 解决之道,两者都关机、然后以正确方式重开.2. 向前拉开储液箱抽屉，检查鞘液筒、废液筒水量，如需充填鞘液，将减压阀方向调在E位置（箭头方向）。3 仪器会对鞘流液筒打气加压,请确认筒盖确实旋紧。秘技2：将减压阀方向调在加压（向前)位置。减压阀如在VET（箭头方向）位置,按RN功能键时将显示橙黄色(表示仪器不正常，请检查是否失压)，正常为绿色显示。3.2开启CellQues 软件、编辑实验文件4. 在苹果菜单下点击CLQuest 启动软件。桌面会出现一Unil

11、e 实验文件,可点击实验文件的右上角的放大钮,将实验文件窗口放大。5。 从工具板中点击散点图图示。在实验文件的空白区点击,拖曳对角线至适当大小，然后放开鼠标。出现散点图对话方框.6 在出现的散点图对话方框中点击Plt Source，选择Acuisiti (收取) ，确认X和Y轴参数预设为SC-H 124、SC-104。在颜色方框中点击Mtiolor Gatig（收取样品时,门内细胞将出现颜色)。点击O.此时实验文件会出现FSC/SC散点图。7. 说明:散点图(Dotplot），又称二维散点图是流式分析最常用图谱,它可以显示两个独立参数的相互关系。在图中,横坐标X轴为为荧光1强度的相对值,单位是

12、道数,纵坐标Y轴则通常表示荧光2或光散射强度的相对值。仪器使用者可因应实验需求来修改所有图谱中显示之参数。第一图和Y轴参数分别设为FCH 14、SCH 024；第二图和Y轴参数分别设为FL1- 1024、F2H10。修改动作为轻击图谱上X和轴参数,并依需要选择之（FC:细胞大小，SSC：细胞折射率,L1:FITC绿色荧光，L2：PE橙色荧光，FL3:PerCP红色荧光）。8. 从屏幕上方Plot菜单中选择ot lo功能，可复制一个同样大小的散点图，在出现的对话方框内选择X轴:F1H1024，Y轴：L2024。点击K，FL1F2的散点图出现。完成后可将重制图移至原图右方。9。 在工具板中选择四象

13、限工具，在FL/F2散点图上拖动Qudrnt的中心将它设定在（x，）=（101,101）处，这些象限将指定阴性阳性区域。建立仪器和计算机之间通讯1. 从Aqure菜单中选择onect totomte,此时会出现Acqiiion Control 对话方框。如果无法选择Cnet toCytomtr,参考秘技 1。如果没见到custiCotro 对话，可到屏幕上方Windos菜单中选择Sow Acquiition ontrol。仪器设置文件注意:实验数据质量，取决于最适化仪器设定文件。仪器设定文件不能在数据收取后再更改,研究人员必须在第一次就使用正确的仪器设定文件。仪器设定文件(Intumentse

14、tings),含信号器高压（teor/ Aps),阈值（hreshold）,荧光补偿（Cmpesation）等仪器条件的组合。一般而言,仪器设定的顺序为Detecto/Ap hreshod- Cpenton。11。检查现有仪器条件,从Cytoeter菜单中选择DetectosAms。出现 DetetorsAms窗口.在DettorAs窗口确认FS与SC为LI(线性放大），其它L13为G(对数放大）,将其拖至空白区。12。 从Comter菜单中选择Threshld，出现heod 窗口在hesho 窗口：确认FSC为设阈参数,初步确认预设阈值52.将其拖至空白区。3 从Cytmt菜单中选择Comp

15、esaon,确认所有预设数值皆为零.将其拖至空白区。33 上样品、设置仪器14 使仪器处于igh U,支撑架左移,上阴性对照管样品，支撑架回位。确认Acquisition Contrl 窗口中 Stp前需打叉或打勾 （即不储存数据)，点击cquir。调节FS/SC探测器(电压)5. 观察FS/SC图的变化.FSC电压（Voltae)预设为E00，可调节 Ap Gain从1.09. 使主要细胞群得以清楚显示(如细胞较大，将FSC电压设置于-1;较小细胞，将FC电压设置于E01）。调节C电压使主要细胞群得以清楚呈现。调节FSC/SC图的原则，在于能得到一独立离散的细胞族群，该细胞群不与其它族群、细

16、胞碎片有重迭现象。调整定位后，点击Aquisitn Cont 窗口中的ause.tin 圈选细胞检品中,常含有大小不同、性质相异的细胞群体。我们常用前方散射与侧方散射的二维位图，即散射光图谱(catterPlot),来圈选出不同细胞群的范围，选择性显示出有意义的细胞群体，如下图圈选白血球之淋巴细胞族群。 在工具板中选择多边形的Reion,在FS/SSC散点图上划定淋巴细胞R1 区域（如下图）。分析样品时,区域内细胞应会呈现成红色，可移动或改变形状来圈选有意义的细胞。如果要删除R区域,您可以在工具栏中点选ates egionlist ，以鼠标点选R1,再按eet 键删除 区域。删除R1区域后，可

17、用绘图工具板，重画1。1. 选取希望的FL1/FL2散点图，从ots菜单中选择Forma dot pot。在出现的对话方框内,将NoGate 改选 G1R1.点击OK。 调节1、FL2的探测器(电压）18 点击cqisiton ontrol 窗口中的strt。在Detectorps 窗口中调节F1、2的电压，使NegiveContro细胞群着落在所选直方图或散点图之100-10处.19 在hreold 窗口，适当地提高F阈值2,以去除碎片或低阶噪音.唯需注意不要切掉主要细胞族群。0。 点击Acuisition Cntol 窗口中的Pause、Abr.移去阴性对照管，关闭etector/mps、

18、hreshld窗口，我们已设定好有意义细胞群之自体荧光.调节荧光补偿说明:最适化的最后一步是调节光谱重迭.（如是单色荧光实验可跳过此步骤）如是色样本，必要时需调节FL2-F1,FFL(若3色样本，必要时需调节FL2%FL、FL%FL2、L3%FL、2-3的补偿)。21。 Hih RU，换上单染C-FTC管。点击Acquisiti Ctrol窗口中的Acquir。调节FL2-F使FITC阳性细胞在FL1L2散点图的右下象限.补偿调节可通过点击来选择或直接拖动滑标上下移动。调节完毕，点击AcquisitioCnrol窗口中的Paue。22。移去单染C，换上单染CD19管。点击cquiition o

19、nol窗口中的Restart。调节FL1-FL2使PE+细胞在FL1/FL2散点图的左上象限。调节完毕，点击Acqution Cotro窗口中的ause。23。 最后以CD-FT/CD19PE双染样本上机，点击Acquisiton Cotol窗口中的Restart，确定三群细胞工整垂直。当您已完成2色荧光之光谱重迭时，点击Acquisiti Conr窗口中的Puse、ort。2. 移去样本管,换上dO管,让仪器暂且处于ndby状态.关闭Cmpesation窗口。您已完成2色荧光之最适化。3.收集实验数据决定储存细胞总数2 预设之储存细胞总数为1000。如需修改，从Aqire菜单中选择cquis

20、ition & Storae，并在出现的窗口功,确认CollectionCrteria从000 Al，再点击OK。 26. 找个档案匣准备储存数据.从cqre菜单中选择Pamte Dscripn,出现Parmete Dcriton对话方框。点击lde，并在随后出现之对话方框，选择urFode或新建活页夹，点击此对话方框的Selct You Fler。27 命名即将储存之文件名：点击Paamete Dcrptio对话方框的File，出现文件名编辑窗口。在CutPex中：输入文件名，点击此对话方框的OK.日期为最常用之文件名系统.2 Opion：如有需要，可选择或在P-P后的空格中输入相关参数名。

21、如1:Size, P：Granlai, P：D3 FI。输入参数名会存入实验档案中,显示在图谱上。计数器Counters。 从cire菜单中选择Counter。 窗口会显示样品分析速率、与总数进度。收集实验数据3. 你可以开始收集实验数据了。HIGH RUN，将第一管样品放到检测区,在cquiitionntrol窗口中,将 tp 改成 Setup，此时eluest会自动显示 our Folder：2003123100为资料文件名。点击“Acuire”便可启动样品之分析测定与数据储存。当计算机成功地收取足够数据，会自动储存数据文件0012。01，并会以“嘟”声告知,CelQuet会自动升幂附加档

22、名成203123。02。等待下一指示。31 你可以换上下一管样品，点击“Acqire” 启动样品之分析测定与数据储存。可继续分析直到所有检品都分析完毕.3.实验数据之储存与备份:32。 不建议长期使用硬盘储存数据数据，可考虑以烧光盘（如配有 CD-RW)、口袋硬盘(Flah rve）来备份大量实验数据，以免占用原有硬盘的内存,影响数据处理速度。可将备份后之数据,拿到另一苹果计算机或个人P进行离机分析。3.确认所有档案皆己备份后，以鼠标圈选欲删除数据，将其拖拉至r筒。退出软件3检品分析完毕后，记得从屏幕上方 Fle指令栏选择 SvAs,储存实验文件，以备日后使用,不需每次重新编辑。35. 从屏幕

23、上方 ometer 指令栏，选择Iruent ettin，出现nruentSettng窗口。点系pint打印此次实验条件,可贴入实验笔记留底，再点击Sae以储存此一实验的仪器条件,供日后再使用。点系SAE后会出现文件保存对话方框,选择文件目录及文件名（例：You Flder:Yr tng1）,点击Save。点击Don。36. 检品分析完毕后,用鼠标从屏幕上方 Acuir 指令栏中，选取Disconectto Cyomr 以断绝计算机与仪器间之联机。之后如不分析数据,您可退出软件“e“it”(遇有选项永远选择“ont sve”),进行关机程序. 管路清洗7。 以2ml 10 漂白水取代样品，将样

24、品架置于左位以外管吸除约1 l，再将样品架置于中位HI RN 十分钟。改用 2 ml DI atr.重复上述程序,样品架上留约 1 D water.按STANDY五分钟.关主机、关计算机四、数据分析FCS li od数据文件:说明：FS list mde数据文件是流式细胞仪的标准格式档案（FCS。)。该文件含有从流式细胞仪收取的平均1，000个细胞数的资料，含有46个参数。一般软件无法打开ist mod数据文件，需藉助如CllQuest， iist,WiDI， 等Flow分析软件，才可开启、绘图、并进行分析统计.41 开启一CelQue实验文件1 从屏幕上方File 菜单中选择New。桌面会出

25、现一Untile实验文件，可点击实验文件的右上角的放大钮,将实验文件窗口放大。4。2散点图之统计分析（双色）2.从工具板中点击散点图图示。在实验文件的空白区点击，然后拖动对角线至适当大小.lot 拖曳完成后可以在右方看到Dot Po对话框。3在DoPot方框中，lot Sre应预设为nalsis,可点击 Sele Fi 钮,并用随后之方框来开启预存之 Sample is,它们的路径位于Mac H:D Appcatns：CllQust Flder：Sampe Fes.连续双击鼠标来打开次目录，找到档案后，点击e来开启OM00档案。X 与 参数项会出现默认值FH 25 与 SC-H 256，在lo

26、方框中点击Muliolor Gang，确认无误之后,点击OK 便完成了一个RM0 的 C/SSC散点图。4。 工具板中选择多角形区隔工具，将Crr 移至S/SSC散点图上，并沿着淋巴球聚落周边画出范围，连点击两次可关闭该区域。你已完成 R1区域的界定,我们将以此区域来圈选淋巴细胞。（如果要删除1区域,您可以在工具栏中点选Gate Regio list，以鼠标点选R,再按lete 键删除1 区域。删除R1区域后，可用绘图工具板，重画1。）5从Plots菜单中选择o Pot可复制一个同样大小的散点图，屏幕上会出现一 Dot t对话方框.点击Paametr钮来显示 NORM00档案中所有的参数项 (FSC, C, FL1， FL2)将X 参数项改成L1- 25 m