第四章免疫球蛋白.docx

1、第四章免疫球蛋白第四章 免疫球蛋白抗体（antibody，Ab）是介导体液免疫的重要效应分子，是B细胞接受抗原刺激后增殖分化为浆细胞所产生的糖蛋白，主要存在于血清等体液中，通过与相应抗原特异性地结合，发挥体液免疫功能。早在十九世纪后期，von Behring和Kitasato就发现白喉或破伤风毒素免疫动物后可产生具有中和毒素作用的物质，称之为抗毒素（antitoxin），随后引入抗体一词来泛指抗毒素类物质。1937年Tiselius和Kabat用电泳方法将血清蛋白分为白蛋白以及1、2、和 球蛋白等组分，并发现抗体活性主要存在于 区，故相当长一段时间内，抗体又被称为 球蛋白（丙种球蛋白）（图4-

2、1）。1968年和1972年世界卫生组织和国际免疫学会联合会的专门委员会先后决定，将具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白统一命名为免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）。免疫球蛋白可分为分泌型（secreted Ig，sIg）和膜型（membrane Ig, mIg）。前者主要存在于血液及组织液中，具有抗体的各种功能；后者构成B细胞膜上的抗原受体。第一节 免疫球蛋白的结构一、免疫球蛋白的基本结构X射线晶体衍射结构分析发现，免疫球蛋白由四肽链分子组成，各肽链间有数量不等的链间二硫键。在结构上Ig可分为三个大小大致相同的片段，其中两个大小完全一致的片段位于分子的上方，通过一易弯曲的区

3、域与主干连接，形成一“Y”字型结构（图42），组成Ig单体，是免疫球蛋白分子的基本单位。（一）重链和轻链任何一类天然免疫球蛋白分子均含有四条多肽链，其中，分子量较大的称为重链(heavy chain，H)，而分子量较小的为轻链(light chain，L)。同一天然Ig分子中的两条H链和两条L链的氨基酸组成完全相同。1重链 分子量约为5075kD，由450550个氨基酸残基组成。各类免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不尽相同，因而其抗原性也不同。据此，可将免疫球蛋白重链分为五类（class）或五个同种型（isotype），即链、链、 链、链和链，其相应的Ig分别为IgM、IgD、IgG

4、、IgA和IgE。不同类的重链具有不同的特征，如链内二硫键的数目和位置、连接寡糖的数量、结构域的数目以及铰链区的长度等均不完全相同。即使是同一类Ig重链其铰链区氨基酸组成和二硫键的数目、位置也不同，据此又可将同一类Ig分为不同的亚类（subclass）。如人IgG可分为IgG1IgG4；IgA可分为IgA1和IgA2。IgM、IgD和IgE尚未发现有亚类。2轻链 分子量约为25 kD，由214个氨基酸残基构成。轻链根据其恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同有两型 （type），分别为（kappa）型和（lambda）型。一个天然Ig分子上两条轻链的型别总是相同的，但同一个体内可存在分别带有或轻链的

5、抗体分子。五类Ig中每类Ig都可以有链或链，两型轻链的功能无差异。不同种属生物体内两型轻链的比例不同，正常人血清免疫球蛋白:约为2:1，而在小鼠则为20:1。:比例的异常可能反映免疫系统的异常，例如人类免疫球蛋白链过多，提示可能有产生链的B细胞肿瘤。根据链恒定区个别氨基酸的差异，又可分为1、2、3和4 四个亚型（subtype）。（二）可变区和恒定区通过分析针对不同抗原特异性的相应免疫球蛋白重链和轻链的氨基酸序列，发现重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸的序列变化很大，其他部分氨基酸序列则相对恒定。免疫球蛋白轻链和重链中靠近N端氨基酸序列变化较大的区域称为可变区（variable region

6、，V），分别占重链和轻链的1/4和1/2；而靠近C端氨基酸序列相对稳定的区域，称为恒定区（constant region，C区），分别占重链和轻链的3/4和1/2（图4 2）。1可变区 重链和轻链的V区分别称为VH和VL。VH和VL各有3个区域的氨基酸组成和排列顺序具有更高程度变易性，称为高变区（hypervariable region，HVR）或互补决定区（complementarity determining region，CDR），分别用HVR1(CDR1)、HVR2(CDR2)和HVR3(CDR3)表示，一般CDR3变化程度更高。VH的3个高变区分别位于2931、4958和95102位

7、氨基酸，VL的3个高变区分别位于2835、4956和9198位氨基酸。VH和VL的3个CDR共同组成Ig的抗原结合部位（antigen-binding site），决定着抗体的特异性，负责识别及结合抗原，从而发挥免疫效应。V区中CDR之外区域的氨基酸组成和排列顺序相对不易变化，称为骨架区（framework region，FR）。VH或VL各有四个骨架区，分别用FR1、FR2、FR3和FR4表示（图4 3）。2恒定区 重链和轻链的C区分别称为CH和CL。不同型（ 或 ）轻链其CL的长度基本一致，但不同类重链其 CH的长度不一，IgG、IgA和IgD重链C区有CH1、CH2和CH3三个结构域，I

8、gM和IgE重链C区有CH1、CH2、CH3和CH4四个结构域。同一种属的个体，所产生针对不同抗原的同一类别Ig，尽管其V区各异，但其C区氨基酸组成和排列顺序比较恒定，其免疫原性相同。例如：针对不同抗原的人IgG抗体，它们的V区不同，所以只能与相应的抗原发生特异性结合，但C区是相同的，均含 重链，因此抗人IgG抗体（第二抗体）均能与之结合。再如，针对同一抗原表位的人IgG和IgM抗体，它们的V区是相同的，所以均能与该抗原特异性结合，但重链C区是不同的，分别为 和 链。（三）铰链区铰链区（hinge region）位于CH1与CH2之间，含有丰富的脯氨酸，因此易伸展弯曲，能改变两个结合抗原的Y形

9、臂之间的距离，有利于两臂同时结合两个不同的抗原表位。铰链区易被木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等水解，产生不同的水解片段（见水解片段部分）。五类Ig或亚类的铰链区不尽相同，例如IgG1、IgG2、IgG4和IgA的铰链区较短，而IgG3和IgD的铰链区较长。IgM和IgE无铰链区。（四）结构域Ig分子的两条重链和两条轻链都可通过链内二硫键折叠为数个球形结构域（domain），每个结构域一般具有其相应的功能。轻链有VL和CL两个结构域；IgG、IgA和IgD重链有VH、CH1、CH2和CH3四个结构域；IgM和IgE重链有VH、CH1、CH2、CH3和CH4五个结构域。这些结构域的功能虽不同，但其结构相似。

10、每个结构域约由110个氨基酸组成，其氨基酸的序列具有相似性或同源性，二级结构为几股多肽链折叠形成的两个反向平行的 片层（anti-parallel sheet），两个 片层中心的两个半胱氨酸残基由一个链内二硫键垂直连接，可稳定结构域，形成一个“ 桶状（ barrel）”结构（图4 4）。这种折叠方式称为免疫球蛋白折叠（immunoglobulin fold）。具有这类独特折叠结构的分子不仅有Ig，其他许多膜型和分泌型分子也含有该类结构，因此，这类分子被统称为免疫球蛋白超家族（immunoglobulin superfamily，IgSF）。二、免疫球蛋白的其他成分Ig轻链和重链除上述基本结构外

11、，某些类别的Ig还含有其他辅助成分，如J链和分泌片。（一）J链J链（joining chain）是一富含半胱氨酸的多肽链，由浆细胞合成，主要功能是将单体Ig分子连接为二聚体或多聚体。2个IgA单体由J链连接形成二聚体，5个IgM单体由二硫键相互连接，并通过二硫键与J链连接形成五聚体（图4-5）。IgG、IgD和IgE常为单体，无J链。（二）分泌片分泌片（secretory piece，SP）又称为分泌成分（secretory component，SC），是分泌型IgA分子上的一个辅助成分，为一种含糖的肽链，由黏膜上皮细胞合成和分泌，并结合于IgA二聚体上，使其成为分泌型IgA（SIgA），并一

12、起被分泌到黏膜表面。分泌片具有保护分泌型IgA的铰链区免受蛋白水解酶降解的作用，并介导IgA二聚体从黏膜下通过黏膜等细胞转运到黏膜表面。三、免疫球蛋白的水解片段在一定条件下，免疫球蛋白分子肽链的某些部分易被蛋白酶水解为各种片段（图4-6）。木瓜蛋白酶（papain）和胃蛋白酶（pepsin）是最常用的两种Ig蛋白水解酶，并可籍此研究Ig的结构和功能，分离和纯化特定的Ig多肽片段。（一）木瓜蛋白酶水解片段木瓜蛋白酶水解IgG的部位是在铰链区的重链链间二硫键近N端侧，可将Ig裂解为2个完全相同的Fab段和1个Fc段（图4 6）。Fab段即抗原结合片段（fragment of antigen bin

13、ding，Fab），相当于抗体分子的两个臂，由一条完整的轻链和重链的VH和CH1结构域组成。一个Fab片段为单价，可与抗原结合但不发生凝集反应或沉淀反应。Fc段即可结晶片段（fragment crystallizable，Fc），相当于IgG 的CH2和CH3结构域。Fc无抗原结合活性，是Ig与效应分子或细胞相互作用的部位。（二）胃蛋白酶水解片段胃蛋白酶作用于铰链区的重链链间二硫键近C端侧，水解Ig后可获得1个F(ab)2片段和一些小片段pFc（图4 6）。 F(ab)2是由2个Fab及铰链区组成，由于Ig分子的两个臂仍由二硫键连接，因此F(ab)2片段为双价，可同时结合两个抗原表位，故与抗原

14、结合可发生凝集反应和沉淀反应。由于F(ab)2片段保留了结合相应抗原的生物学活性，又避免了Fc段抗原性可能引起的副作用，因而被广泛用作生物制品。如白喉抗毒素、破伤风抗毒素经胃蛋白酶水解后精制提纯的制品，因去掉Fc段而减少超敏反应的发生。胃蛋白酶水解Ig后所产生的pFc最终被降解，无生物学作用。第二节 免疫球蛋白的异质性尽管所有的免疫球蛋白分子在结构上均由V区和C区组成，但不同抗原甚至同一抗原刺激B细胞产生的免疫球蛋白，在其特异性以及类型等诸方面均不尽相同，呈现出明显的异质性（heterogenecity）。免疫球蛋白的异质性可表现为：不同抗原表位刺激机体所产生的不同类型的免疫球蛋白分子，其识别

15、抗原的特异性不同，其重链类别和轻链型别也有差异；不同抗原表位诱导的同一类型的免疫球蛋白（如IgG），其识别抗原的特异性不同。导致免疫球蛋白异质性的因素包括内源性因素和外源性因素。 一、免疫球蛋白的类型（一）类（class）在同一种属的所有个体内，Ig重链C区所含抗原表位不同，据此可将重链分为 、 、 、 、 链五种，与此对应的Ig分为五类，即IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。（二）亚类（subclass）同一类免疫球蛋白其重链的抗原性及二硫键数目和位置不同，据此又可将Ig分为亚类。人IgG有IgG1IgG4四个亚类；IgA有IgA1和IgA2两个亚类；IgM、IgD和IgE尚未发现亚类。

16、（三）型（type）在同一种属所有个体内，根据Ig轻链C区所含抗原表位的不同，可将Ig轻链分为两种： 和 ，与此对应的免疫球蛋白分为 型和 型。（四）亚型（subtype）同一型免疫球蛋白中，根据其轻链C区N端氨基酸排列的差异，又可分为亚型。例如： 链190氨基酸为亮氨酸时，称OZ(+)；为精氨酸时，称OZ( )。二、外源因素所致的异质性免疫球蛋白的多样性自然界存在的外源性抗原数目繁多，包括蛋白质、多糖、脂类等。每一种抗原分子的结构又十分复杂，含有多种不同的抗原表位。含多种不同抗原表位的抗原刺激机体免疫系统，导致免疫细胞的活化，产生多种不同特异性的抗体。理论上，每一种抗原表位可诱导产生一种特异

17、性抗体。因此，这些抗原可刺激机体产生的抗体总数是巨大的，包含针对各种抗原表位的许多不同抗原特异性的抗体，以及针对同一抗原表位的不同类型的抗体。多样性抗原的存在是导致免疫球蛋白异质性（即特异性）的外源因素，是免疫球蛋白异质性的物质基础。抗体的这种异质性，反映出机体对抗原精细结构的识别和应答。三、内源因素所致的异质性免疫球蛋白的血清型免疫球蛋白既可与相应的抗原发生特异性的结合，其本身又可激发机体产生特异性免疫应答。其结构和功能基础是在免疫球蛋白分子中包含有多种不同的抗原表位，呈现出不同的免疫原性。Ig分子上有三类不同的抗原表位，分别为同种型、同种异型和独特型抗原表位（图4-7）。（一）同种型（is

18、otype）不同种属来源的抗体分子对异种动物来说具有免疫原性，可刺激机体产生抗该异种抗体的免疫应答。这种存在于同种抗体分子中的抗原表位即为同种型，是同一种属所有个体Ig分子共有的抗原特异性标志，为种属型标志，存在于Ig 的C区。（二）同种异型（allotype）同一种属但不同个体来源的抗体分子也具有免疫原性，也可刺激机体产生特异性免疫应答。这种存在于同种但不同个体中的免疫原性，称为同种异型，是同一种属不同个体间Ig分子所具有的不同抗原特异性标志，为个体型标志，存在于Ig 的C区或V区。（三）独特型（idiotype，Id）即使是同一种属、同一个体来源的抗体分子，其免疫原性亦不尽相同，称为独特型

19、，是每个免疫球蛋白分子所特有的抗原特异性标志，其表位又称为独特位（idiotope）。抗体分子每一Fab段约有56个独特位，它们存在于V区（图4-8）。独特型在异种、同种异体甚至同一个体内均可刺激产生相应抗体，即抗独特型抗体（anti-idiotype antibody，AId或Ab2）。第三节 免疫球蛋白的功能免疫球蛋白的功能与其结构密切相关。免疫球蛋白的V区和C区的氨基酸组成和顺序的不同，决定了它们功能上的差异；许多不同的免疫球蛋白在V区和C区结构变化的规律性，使得免疫球蛋白的V区和C区在功能上存在共性。V区和C区的作用，构成了免疫球蛋白的生物学功能（图4-9）。一、Ig V区的功能识别并

20、特异性结合抗原是免疫球蛋白分子的主要功能，执行该功能的结构是免疫球蛋白V区，其中CDR在识别和结合特异性抗原中起决定性作用。免疫球蛋白分子有单体、二聚体和五聚体，因此结合抗原表位的数目也不相同。Ig结合抗原表位的个数称为抗原结合价。单体Ig可结合2个抗原表位，为双价；分泌型IgA为4价；五聚体IgM理论上为10价，但由于立体构型的空间位阻，一般只能结合5个抗原表位，故为5价。免疫球蛋白的V区与抗原结合后，在体内可结合病原微生物及其产物，具有中和毒素、阻断病原入侵、清除病原微生物等免疫防御功能。B细胞膜表面的IgM和IgD等Ig构成B细胞的抗原识别受体，能特异性识别抗原分子。在体外可发生各种抗原

21、抗体结合反应，有利于抗原或抗体的检测和功能的判断。二、Ig C区的功能（一）激活补体IgG1、IgG2和 IgG3以及IgM与相应抗原结合后，可因构型改变而使其CH2和CH3结构域内的补体结合点暴露，从而通过经典途径激活补体系统，产生多种效应功能，其中IgM、IgG1和IgG3激活补体系统的能力较强，IgG2较弱。IgA、IgE和IgG4本身难于激活补体，但形成聚合物后可通过旁路途径激活补体系统。通常，IgD不能激活补体。（二）结合Fc段受体 IgG、IgA和IgE抗体，可通过其Fc段与表面具有相应受体的细胞结合，产生不同的生物学作用。1. 调理作用 （opsonization） 指抗体如Ig

22、G（特别是IgG1和IgG3）的Fc段与中性粒细胞、巨噬细胞上的IgG Fc受体结合，从而增强吞噬细胞的吞噬作用（图4-9）。例如，细菌特异性的IgG抗体可以其Fab段与相应的细菌抗原结合后，以其Fc段与巨噬细胞或中性粒细胞表面相应IgG Fc受体结合，通过IgG的Fab段和Fc段的“桥联”作用，促进吞噬细胞对细菌的吞噬。2. 抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用（antibody-dependent cell mediated cytotoxicity，ADCC） 指具有杀伤活性的细胞如NK细胞通过其表面表达的Fc受体（FcR）识别包被于靶抗原（如细菌或肿瘤细胞）上抗体的Fc段，直接杀伤靶细胞（图

23、4-9）。NK细胞是介导ADCC的主要细胞（详见第十四章）。抗体与靶细胞上的抗原结合是特异性的，而表达FcR的细胞其杀伤作用是非特异性的。3. 介导型超敏反应 IgE为亲细胞抗体，可通过其Fc段与肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面的高亲和力IgE Fc受体（FcRI）结合，并使其致敏。若相同变应原再次进入机体与致敏靶细胞表面特异性IgE结合，即可促使这些细胞合成和释放生物活性物质，引起型超敏反应（详见第十七章）。（三）穿过胎盘和黏膜在人类，IgG是惟一能通过胎盘的免疫球蛋白。胎盘母体一侧的滋养层细胞表达一种IgG输送蛋白，称为新生Fc段受体（neonatal FcR，FcRn）。IgG可选择性与FcR

24、n结合，从而转移到滋养层细胞内，并主动进入胎儿血循环中。IgG穿过胎盘的作用是一种重要的自然被动免疫机制，对于新生儿抗感染具有重要意义。另外，分泌型IgA可通过呼吸道和消化道的黏膜（图4-10），是黏膜局部免疫的最主要因素。此外，免疫球蛋白还对免疫应答有调节作用（详见第十六章）。第四节 各类免疫球蛋白的特性与功能一、IgGIgG于出生后3个月开始合成，35岁接近成人水平。是血清和胞外液中含量最高的Ig，约占血清总Ig的75%80%（表4-1）。人IgG有4个亚类，分别为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。IgG半寿期约2023天，是再次免疫应答产生的主要抗体，其亲和力高，在体内分布广泛，具

25、有重要的免疫效应，是机体抗感染的“主力军”。IgG1、IgG3、IgG4可穿过胎盘屏障，在新生儿抗感染免疫中起重要作用。IgG1、IgG2和IgG3的CH2能通过经典途径活化补体，并可与巨噬细胞、NK细胞表面Fc受体结合，发挥调理作用、ADCC作用等。人IgG1、IgG2和IgG4可通过其Fc段与葡萄球菌蛋白A（SPA）结合，藉此可纯化抗体，并用于免疫诊断。某些自身抗体如抗甲状腺球蛋白抗体、抗核抗体，以及引起II、III型超敏反应的抗体也属于IgG。 表4-1 人免疫球蛋白的主要理化性质和生物学功能性 质IgMIgDIgGIgAIgE分子量（kD）950184150160190重链 亚类数2无

26、42无C区结构域数43334辅助成分J无无J, SP无糖基化修饰率10%9%3%7%13%主要存在形式五聚体单体单体单体/二聚体单体开始合成时间胚胎后期任何时间生后3个月生后46个月较晚合成率(mg/kg/d)70.433650.016占血清Ig量比例510%0.3%75%85%10%15%0.02%血清含量（mg/ml）0.71.70.039.512.51.52.60.0003半衰期（天）1032362.5结合抗原价5222，42溶细菌作用+?+?胎盘转运 + 结合嗜碱性粒细胞 +结合吞噬细胞 + 结合肥大细胞 +结合SPA + 介导ADCC + 经典途径补体激活+ + 旁路途径补体激活 +

27、IgG4+IgA1+ 其他作用初次应答早期防御B细胞标志二次应答抗感染黏膜免疫型超敏反应抗寄生虫二、IgMIgM占血清免疫球蛋白总量的5%10，血清浓度约1mg/ml。单体IgM以膜结合型（mIgM）表达于B细胞表面，构成B细胞抗原受体（BCR）。分泌型IgM为五聚体，是分子量最大的Ig，沉降系数为19S，称为巨球蛋白（macroglobulin），一般不能通过血管壁，主要存在于血液中。五聚体IgM含10个Fab段，具有很强的抗原结合能力；含5个Fc段，比IgG更易激活补体。天然的血型抗体为IgM，血型不符的输血，可致严重溶血反应。IgM是个体发育过程中最早合成和分泌的抗体，在胚胎发育晚期的胎

28、儿即能产生IgM，故脐带血IgM升高提示胎儿有宫内感染（如风疹病毒或巨细胞病毒等感染）。IgM也是初次体液免疫应答中最早出现的抗体，是机体抗感染的“先头部队”；血清中检出IgM，提示新近发生感染，可用于感染的早期诊断。膜表面IgM是B细胞抗原受体的主要成分。只表达mIgM是未成熟B细胞的标志。三、IgAIgA有血清型和分泌型两种。血清型为单体，主要存在于血清中，仅占血清免疫球蛋白总量的10%15。分泌型IgA（secretory IgA，SIgA）为二聚体，由J链连接，含由上皮细胞合成的SP，经上皮细胞分泌至外分泌液中。SIgA合成和分泌的部位在肠道、呼吸道、乳腺、唾液腺和泪腺，因此主要存在于

29、胃肠道和支气管分泌液、初乳、唾液和泪液中。SIgA是外分泌液中的主要抗体类别，参与黏膜局部免疫，通过与相应病原微生物（细菌、病毒等）结合，阻止病原体黏附到细胞表面，从而在局部抗感染中发挥重要作用。SIgA在黏膜表面也有中和毒素的作用。新生儿易患呼吸道、胃肠道感染可能与IgA合成不足有关。婴儿可从母亲初乳中获得SIgA，为一重要的自然被动免疫。四、IgD正常人血清IgD浓度很低（约30 g/ml），仅占血清免疫球蛋白总量的0.2。IgD可在个体发育的任何时间产生。五类Ig中，IgD的铰链区较长，易被蛋白酶水解，故其半寿期很短（仅3天）。IgD分为两型：血清IgD的生物学功能尚不清楚； 膜结合型I

30、gD（mIgD）构成BCR，是B细胞分化发育成熟的标志，未成熟B细胞仅表达mIgM，成熟B细胞可同时表达mIgM和mIgD，称为初始B细胞（naive B cell）；活化的B细胞或记忆B细胞其表面的mIgD逐渐消失。五、IgEIgE是正常人血清中含量最少的Ig，血清浓度极低，约为510-5 mg/ml。主要由黏膜下淋巴组织中的浆细胞分泌。IgE分子量为160kD，IgE的重要特征为亲细胞性，其CH2和CH3结构域可与肥大细胞、嗜碱性粒细胞上的高亲和力FcR结合，当结合再次进入机体的抗原后可引起型超敏反应。此外，IgE可能与机体抗寄生虫免疫有关。第五节人工制备抗体抗体的上述生物学特性使得其在疾

31、病的诊断、免疫防治及其基础研究中发挥着重要作用，人们对抗体的需求也随之增大。人工制备抗体是大量获得抗体的有效途径。以特异性抗原免疫动物，制备相应的抗血清，是早年人工制备抗体的主要方法。1975年，Khler和Milstein建立的单克隆抗体（monoclonal antibody，mAb）技术，使得规模化制备高特异性、均一性抗体成为可能。但鼠源性mAb在人体反复使用后出现的人抗鼠抗体（HAMA），很大程度上限制了mAb的临床应用。近年，随着分子生物学的发展，人们可通过抗体工程技术制备人鼠嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。一、多克隆抗体天然抗原分子中常含多种不同抗原特异性的抗原表位，以该抗原物质刺激机体免疫系统，体内多个B细胞克隆被激活，产生的抗体中实际上含有针对多种不同抗原表位的免疫球蛋白，为多克隆抗体（polyclonal antibody，pAb）。获得多克隆抗体