支链淀粉合成相关酶基因SS2SBE2等位变异及功能分析题库.docx

1、支链淀粉合成相关酶基因SS2SBE2等位变异及功能分析题库四川农业大学学位论文开题报告论文题目：中国地方小麦淀粉合成相关基因 SS与SBE等位变异及功能分析 报 告 人： 周艳杰 学 号： S20142075 申请学位： 农学硕士 学科专业： 作物遗传育种 所在学院： 小麦研究所 指导教师： 江千涛 研究员 报告时间： 2015/10/10 四川农业大学研究生处制表1 论文选题的理由或意义：小麦籽粒主要由淀粉、蛋白质、脂类等组成，其中淀粉约占籽粒干重的6575，是小麦籽粒的主要贮藏物质。高等植物几乎所有的器官，如种子、茎、叶片、根、果实和花粉等都含有淀粉。淀粉又是植物主要的能量储藏物质，在植物

2、生长发育过程中起着重要作用，同时也为人类提供7080的热量所需。此外，淀粉还是一种重要的工业原料，被广泛应用于酿酒、造纸、粘合剂、纺织及生物降解塑料等行业1。淀粉是以葡萄糖为基本单位构成的多糖，根据其分子结构特征分为直链淀粉(amylose)和支链淀粉(amylopectin)两种糖元多聚体，其中直链淀粉约占总淀粉的20-25，支链淀粉约占75-80，直支比在不同小麦品种中的变异范围为l：3-1：52。研究证明，直链淀粉与支链淀粉的比例(直支比)以及支链淀粉的精细结构显著影响淀粉的理化性质，进而决定面类制品，尤其是面条、馒头等东方食品的外观品质和食用品质3,4。淀粉在高等植物中主要是在叶绿体和

3、淀粉体等质体中合成。淀粉生物合成由以下四种酶调控进行，分别为ADP-焦磷酸化酶（ADP-glucose pyrophosphorylase , AGPase）、淀粉合成酶（starch synthase,SS）、淀粉分支酶（starch branching enzyme,SBE）和淀粉去分支酶（starch debranching enzyme,DBE）。淀粉相关酶不仅影响淀粉的含量而且影响淀粉的结构，淀粉合成酶及淀粉分支酶在支链淀粉生物合成中起到了重要作用。 目前市面上推广的小麦品种的直链淀粉并不理想，直链淀粉含量约占总淀粉的20%左右，并没有达到人们的要求。直链淀粉含量极低，甚至没有的小麦

4、为糯性小麦，含有高水平的直链淀粉和分支长的直链淀粉为抗性淀粉。研究表明含有高直链淀粉的抗性淀粉比常规淀粉对水解作用更具有抵抗力，抗性淀粉对人体发挥了膳食纤维的功能，对肠道疾病具有一定的预防作用5，即含有高直链淀粉或高抗性淀粉的小麦对人的健康状况的改良具有重要作用。所以本实验研究淀粉合成关键酶对淀粉总量及直/支链淀粉比例的影响具有一定意义。地方品种亦称 “地区性品种”。在当地自然或栽培条件下，经长期自然或人为选择形成的品种。对当地自然或栽培环境具有较好的适应性，同时受当地饮食习惯的影响，保留了独特的品质特征。2 国内外关于该课题的研究现状及趋势：籽粒淀粉的生物合成淀粉的合成机理、合成途径、合成过

5、程中的酶及其作用机制比较复杂，目前尚不完全清楚。一般认为，小麦淀粉由胚乳中的双层膜结构的淀粉质体合成，需要以下几种关键酶：ADPG焦磷酸化酶，淀粉合成酶、淀粉分支醉和淀粉脱分支酶。从合成途径看，所有参与淀粉合成的酶都会影响淀粉粒的结构6-10。整个淀粉生物合成途径分为三个主要过程：一是ADP葡萄糖的形成；二是直链淀粉的合成；三是支链淀粉合成以及淀粉粒的形成。淀粉生物合成是在胞质中开始的，以蔗糖为底物，在各种酶的作用下形成6-磷酸葡萄糖（Glc-6-P）或者1-磷酸葡萄糖（Glc-1-P）。Glc-6-P可以直接进入淀粉体，而Glc-1-P在酶作用下合成ADP-葡萄糖11,12。进入淀粉体的AD

6、P-葡萄糖在颗粒结合淀粉合成酶（GBSS）的催化形成直链淀粉，具体合成方式有两种假说，这里不再具体描述。支链淀粉是在淀粉粒表面，通过可溶性淀粉酶（SSS）、淀粉分支酶（SBE）和淀粉去分支酶（DBE）连续循环反应合成的。支链淀粉的合成同样具有几种模型，但其主要都是SSS和SBE催化形成糖原或支链淀粉，DBE进行后续修剪。概括来说就是GBSS影响直连淀粉的合成，SSS、SBE及DBE影响支链淀粉的合成。可溶性淀粉合成酶（SSS）：淀粉合成酶SS有两种不同的类型：存在于质体基质内的可溶性淀粉合酶(soluble starch sythase，SSS)和与淀粉粒结合的淀粉合酶(granule bou

7、nd starch sythase，GBSS)，都以ADPG或UDPG为底物，前者负责支链淀粉的合成，后者负责直链淀粉的合成13。可溶性淀粉合成酶（SSS）的作用是在支链淀粉的合成过程中,通过1-4糖苷键将ADPG中的葡萄糖加到侧链的非还原端,延长侧链。Keeling及Jenner等研究了温度对SSS活性的影响，表明温度升高，酶活性降低，此种现象称为“Knock-down”。其它与淀粉合成有关的酶，如AGPase，UGPase，SuS，GBSS和己糖激酶等，温度升高对其活性无影响，“Knock-down”现象只在SSS中存在。因此，SSS是淀粉合成温度的调节位点14。根据SSS保守序列同源关系

8、的远近可分为5类，其中4类分别为SSI，SSIIa，SSIIb和SS，它们在支链淀粉合成中起着不同的作用。Yamamori等将小麦中SS命名为SGP-1，有3个亚基Sgp-A1，Sgp-B1和Sgp-D1，基因分别位于7AS，7BS和7DS15。Li和Ming等分别从中国春和Fieder的胚乳cDNA文库中获得SSII的三个亚基的cDNA克隆(SSA1:AF155217;ss2a-1:AJ269502;ss2a-2:AJ269503;ss2a-3:AJ269504)16,17。从这些cDNA推测编码的蛋白质的大小在8085kD之间,与Yamamori等通过SDS2PAGE电泳检测得到的分子量在

9、100115kD相差比较大15。Ming等将其中一个cDNA克隆在大肠杆菌中表达后,认为是SSII本身的结构特点导致了所推测蛋白质的分子量与SDS-PAGE电泳检测分子量之间的差别17,排除了Li等推测的翻译后的加工和与淀粉粒结合导致分子变大的可能16。此外，Li等从六倍体小麦的D组供体(TriticumtauschII)获得SSII基因的基因组克隆(登陆号:AY133248),全长约9kb,由8个外显子和7个内含子组成，分析基因上游调控区,发现启动子区和胚乳专化表达的顺式作用元件在-1.0kb内18。T.Shimbata等利用中国春的缺体四体创造出SGP-1各亚基的缺失材料，并用PCR成功开

10、发三对引物用于筛选缺失SGP-1各亚基的变异类型19。Yamamori等鉴定SS的三个亚基,筛选出分别缺失单个亚基的突变系,并通过有性杂交获得缺失SS的六倍体小麦，这些小麦籽粒表现出较高的直链淀粉含量，并且淀粉颗粒的外观形状也发生了改变。通过将SSII缺失的六倍体小麦与糯性小麦杂交,发现同时缺失Waxy蛋白和SSII的小麦,能检测到直链淀粉的存在，推测可能是由于SSII的缺失，使支链淀粉侧链变长，表现出直链淀粉的特性20。Konik-rose等也在对SGP-1全缺失小麦和正常小麦杂交后代的分析中发现，SGP-1各亚基的缺失均能影响小麦籽粒的重量、组分、直链淀粉的含量以及直链淀粉和支链淀粉的分布

11、，而同时缺失的效应最为明显21。因此，筛选鉴定出SGP-1变异类型材料，不仅可以更好地了解SGP-1在淀粉生物合成过程中的作用，也为选育不同淀粉品质类型的小麦新品种提供物质基础。淀粉分支酶淀粉分支酶（SBE）是一类葡萄糖基转移酶，它首先催化-，糖苷键的水解，继而将断链的还原端链接到葡聚糖的C-6位氢氧集团上形成一个-1,6分支点，形成淀粉链的分支。在淀粉合成中，淀粉分支酶(SBE)是唯一引入-1,6糖苷分支键的淀粉合成酶，其性质和活性是影响支链淀粉含量和精细结构的重要因素22,23。根据分子结构、免疫反应特性和底物特异性等方面的不同，SBE分为SBEI和SBEII两种同种型(inform)。免

12、疫杂交证明，SBEII也有SBEIIa和SBEIIb两种同工型，SBEIIa存在于胚乳的可溶性基质中，而SBEIIb结合在淀粉粒上24。前人研究发现，单独抑制SBEI对淀粉结构无影响25,26或者对淀粉结构有很微小的影响27，在玉米和水稻中同时抑制SBEI和SBEIIb的表达比单独抑制SBEIIb的表达直链淀粉含量增加明显。然而在大麦和小麦中，单独抑制SBEI或SBEIIb的表达对淀粉结构无影响，抑制SBEIIa能显著增加直链淀粉含量28,29。Rahman等从A.tauschII的基因组文库中筛选到编码SBEII的克隆(命名为wSBEII2DA1,登陆号AF338431),全长约10kb30

13、。wSBEII2DA1与cDNA克隆比较,由22个外显子和21个内含子组成,外显子的长度从43384bp不等,内含子从831019bp不等31。Francesco Sestili等通过转基因沉默硬粒小麦的SBEIIa基因发现其转基因株系的直链淀粉含量显著增加，且淀粉粒变得畸形不规则相比于野生型淀粉粒明显减小32。在酶活性方面，前人研究发现，在灌浆期，淀粉合成酶的酶活变化都呈单峰曲线，且在小麦灌浆期均有酶活性，活性高峰期基本都在开花期10d后。但因小麦品种不同而有差异，有的峰值在前期，有的却靠后。李建敏的研究表明，小麦中SSII在开花后10d达活性高峰33，曹颖妮的研究结果显示，SSS、AGPP

14、、GBSS和SBE活性峰值基本都出现在花后20-25d34。本实验所用材料为花后20d左右的小麦籽粒，保证其酶活性较高。注：可用A4纸加附页3 研究目标、研究内容和拟解决的关键问题：1：研究目标 通过对小麦SSII和SBEII蛋白缺失突变体材料的筛选，找出SSII和SBEII蛋白缺失功能的变异及机制，并测定淀粉相关参数的测定，找出不同变异类型对蛋白功能的贡献，开发成分子标记，为创制高直链淀粉材料提供依据。2：研究内容 （1） 通过SDS-PAGE筛选SSII和SBEII缺失突变体材料并进行Western验证，并对蛋白缺失材料SSII和SBEII的启动子及编码序列进行扩增，确定变异类型并探讨变异

15、机制； （2）突变体材料总淀粉、直链淀粉、淀粉的糊化特性、老化特性及淀粉粒形态测定，并确定不同变异类型对淀粉指标的贡献水平； （3）对分别缺失SSII和SBEII不用亚基类型的等位变异进行聚合，分析变异类型聚合对淀粉含量、组分的影响。3：拟解决的关键问题 （1）分析900份地方小麦和栽培推广品种中突变类型； （2）对分别缺失SSII和SBEII不同亚基材料的启动子和编码序列的克隆。4 拟采取的研究方法、研究手段、技术路线、实验方案及可行性分析：1：研究方法及手段 (1) SDS-PAGE及Western筛选鉴定出SSII和SBEII缺失突变体材料，相关试剂盒测定其总淀粉及直连淀粉含量，差示扫描

16、仪及扫描电子显微镜测定淀粉的糊化特性及淀粉粒形态观察。 (2) 小麦SSII和SBEII启动子和编码序列克隆，进行突变及非突变材料的序列变异分析并开发分子标记。 (3) 不同突变类型的基因聚合杂交。2：实验方案 (1) 取开花后20d左右的小麦种子，每个品种共取3个单穗，每穗取中部小穗籽粒，经液氮速冻后放入-70超低温冰箱中保；之后进行蛋白提取，采用SDS-PAGE电泳筛选SSII缺失材料，Western Blot进行验证，然后找出突变体对应单株的完熟种子利用Megazyme总淀粉测定试剂盒（K-TSTA 04/2009）及双波长法分别测定其总淀粉与直连淀粉含量；利用差示扫描热量计(DSC 2

17、920; TAInstruments， Delaware， USA)对小麦； (2) 淀粉进行热力学特性测定并用自带处理数据软件进行数据分析；利用扫描电子显微镜（FEI Quanta 450）观察不同小麦淀粉粒形态，用配套软件进行观察以及照相。 (3) 对筛选出的不同亚基缺失型材料进行DNA提取，设计引物扩增相应的SSII，SBEII启动子和编码序列，与具有完全功能的序列进行比较分析，找出导致淀粉理化性质变化的变异及变异机制，并根据序列开发分子标记。 (4) 进行不同突变体类型材料的杂交，进行基因聚合，创制高直链淀粉材料并检测聚合效应。3：可行性分析 目前已四川农业大学小麦研究所已收集超过90

18、0份来自全国各地的地方小麦和栽培推广品种材料，地方小麦由于分布广、历史久远，因此较育成品种具有更高的遗传多样性，对于筛选具有不同类型的SSII和SBEII基因多样性具有明显的优势。此外，淀粉提取、电泳技术已有人报道，在本实验室中也已形成完善体系，此外小麦基因组全基因组shotgun、分染色体的survey序列的测定也为快速获得来自不同亚基因组的SSII和SBEII基因序列提供了参考，同时前人也有一些引物可以作为参照。而测定各生理生化指标也已经有了一套比较完善的标准，实验室缺少的仪器也可以通过借用学校公共平台得到解决。因此该实验的可行性较高。5 本题目的创新之处和可预期的创造性成果：1：本题目的

19、创新之处首先从材料出发，本实验从分布于全国各个地方的900多份地方小麦和栽培推广品种着手，筛选SSII和SBEII缺失突变体，地方品种一般具有一种或者少数几种独特优势，如某种抗病或者耐盐、耐旱性，因此有利于挖掘SSII和SBEII基因新的变异类型；其次淀粉相关酶中，SSII和SBEII相对于Waxy研究相对较少。2：可预期的创新性成果 (1) 从地方品种中成功筛选出SSII和SBEII不同类型的缺失突变体； (2) 获得丰富的SSII及SBEII基因的变异类型； (3) 聚合杂交后产生具有高直链淀粉比重的材料。6 论文工作量、年度研究计划、可能遇到的困难和问题及相应的解决办法：1：论文工作量

20、900多份地方品种和栽培推广品种小麦发育期种子的选取及SDS-PAGE蛋白电泳；突变体总淀粉、直连淀粉、淀粉糊化特性测定及淀粉粒形态观察；小麦SSII和SBEII启动子和编码序列克隆与序列分析及分子标记开发；第二年进行基因聚合杂交，创制高直链淀粉材料。 2：年度研究计划（1） 2014.09-2015.04-材料收集及田间取材；（2） 2015.05-2015.12-对小麦相应材料进行蛋白鉴定及筛选出的突变体的播种；（3） 2015.12-2016.05-小麦SSII和SBEII缺失突变体材料总淀粉、直链淀粉及其他相关性状的测定，SSII和SBEII启动子和基因克隆与序列分析。（4） 2016

21、.06-2016.09-小麦不同类型SSII和SBEII突变体的杂交和种子收获。（7） 2016.10-2017.05-整理数据，完善实验，撰写论文。3：可能遇到的困难和问题及相应的解决办法小麦SSII和SBEII基因较大，克隆相对困难，通过摸索条件及向同学和老师学习来解决。 7 与本题目有关的研究工作积累和已取得的研究工作成绩：已通过SDS-PAGE电泳对300份地方小麦和90份栽培推广品种进行了SSII和SBEII蛋白鉴定并筛选出两种不同类型的SSII缺失突变体，包括4份SSII-D缺失突变体和4份SSII-DB缺失突变体。8 已具备的研究条件，尚缺少的研究条件和拟解决的途径：本实验所使用

22、的材料、仪器、方法以及技术实验室都具备，能基本满足本研究的所有需求。 主要参考文献目录序号作者文章题目（书目）期刊名称（出版单位）、时间1杨荣光，戴忠民，王洪明，等.植物淀粉生物合成的研究进展J.安徽农业科学，2007，35(28):8791-8793.2 Baga M，Glaze S，Mallard C S，Chibbar RA starch branching enzyme gene in wheat produces alternatively spliced transcriptsPlant Mol Biol，1 999，40：1 0 19-1 0303 YAO D N.LI B YZ

23、HU J B，LIANG R Q。LIU GTStudy on main starch properties and predictive indexes of noodle quality in common wheatJSciAgricSin(中国农业科学)，1999,32(6)：84-88(in Chinese)4 MUFORSTER CHUANG R，POWERS J R，et a1Physical association of starch biosynthetic enzymes with starch granules of maize endospermJPlant Physi

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30、e structural organisation of the gene encoding class II starch synthase of wheat and barley and the evolution of the genes encoding starch synthases in p lantsJ . Funct Integr Genomics，2003，3: 76-85.19 Shimbata T，Nakamura T，Vrinten P，et al. Mutations in wheat starch synthase II genes and PCR-based s

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