BD破膜剂试剂手册中文.docx

1、BD破膜剂试剂手册中文破膜剂 试剂手册BD Cytofix / Cytoperm 固定/渗透试剂盒手册（目录号554714）BD Cytofix / Cytoperm Plus固定/渗透试剂盒（BD GolgiStop含有莫能菌素的蛋白质转运抑制剂）（目录号554715）BD Cytofix / Cytoperm Plus固定/渗透试剂盒（含布雷菲德菌素A的BDGolgiPlug蛋白质转运抑制剂）（目录号555028）Ficoll是Amersham Biosciences AB的注册商标。 Hypaque是Amersham Health AS的注册商标。 BD流式细胞仪是1流激光产品。 仅供研

2、究使用。 不用于诊断或治疗程序。 2016年Becton，Dickinson和公司。 版权所有。 本出版物的任何部分不得以电子，机械，磁性，光学，化学，手册或其他方式以任何形式或通过任何方式复制，传播，转录，存储在检索系统中或翻译成任何语言或计算机语言， 未经BD Biosciences事先书面许可。 购买不包括或携带任何权利转售或转让本产品作为独立产品或另一产品的组成部分。 未经Becton，Dickinson和Company明确书面许可，严禁使用本产品以外的许可使用。2016BD，BD徽标和所有其他商标均为Becton，Dickinson和Company的产权。BD Cytofix / C

3、ytoperm固定/渗透试剂盒BD Cytofix / Cytoperm Plus固定/渗透试剂盒（BD GolgiStop蛋白质转运抑制剂）BD Cytofix / Cytoperm Plus固定/渗透试剂盒（BD GolgiPlug蛋白质运输抑制剂）警告和注意事项1. 一般程序 A.刺激细胞1.使用BD GolgiStop的程序 蛋白质转运抑制剂（含有莫能菌素）2。 使用BD GolgiPlug 蛋白质转运抑制剂的程序（含布雷菲德菌素A）B.方案：细胞表面抗原和细胞内细胞因子的多色染色1收集细胞2.阻止Fc受体3.细胞表面抗原染色4.固定和渗透细胞5.备选固定和渗透方案6细胞内细胞因子染色

4、C.流式细胞分析。D. 染色控制1. 阳性染色控制2. 阴性染色控制 a. 同种型对照b.配体阻断控制。c. 未标记的抗体阻断控制。解决方案样品数据备选方案全血活化和细胞内染色。预期结果解决方案参考文献 BD Biosciences提供三个试剂盒，以简化细胞的固定和透化，用于细胞质内细胞因子的免疫荧光染色。 BD Cytofix / Cytoperm 固定/渗透试剂盒提供固定/透化溶液和渗透/洗涤溶液。 BD Cytofix / Cytoperm Plus Fixation / Permeabilization Kit（含有BD GolgiStop蛋白质转运抑制剂）提供了这两种溶液加上含有莫能

5、菌素的蛋白质转运抑制剂，用于处理新鲜移植或培养的细胞，以促进胞质内细胞因子的积累。 BD Cytofix / Cytoperm Plus固定/渗透试剂盒（含有BD GolgiPlug蛋白质转运抑制剂）提供了两种溶液，另外还有一种含有布非司定A的蛋白质转运抑制剂。这些试剂盒提供足够的两种染色200个细胞样品的溶液。BD Cytofix / Cytoperm 固定/渗透试剂盒（目录号554714）该试剂盒能够使细胞固定和透化，其是用荧光染料共轭荧光标记的抗细胞因子抗体染色细胞内细胞因子所必需的。 该试剂盒提供两种试剂，固定/渗透溶液和BD Perm / Wash 缓冲液。 细胞固定和透化后，用BD

6、 Perm / Wash 缓冲液洗涤细胞并稀释抗细胞因子抗体进行染色。注意：用BD Perm / Wash 缓冲液稀释抗细胞因子抗体很重要，而不是用标准染色缓冲液，以保持细胞内染色的细胞处于透化状态。试剂盒成分： 固定/渗透溶液（125mL） BD Perm / Wash 缓冲液，10X浓缩物含有胎牛血清（FBS）*和皂角苷（使用前在蒸馏水中稀释1:10）（100mL）注1：虽然固定/渗透溶液和BD Perm / Wash 缓冲液含有防止污染的成分，建议使用无菌移液器除去溶液，使用后立即关闭瓶子。注2：BD Perm / Wash 缓冲液作为包含FBS *的10 *储备溶液。 该产品的颜色可能

7、因批次而异，并且可能含有可见的沉淀物。 颜色变化和/或沉淀物不影响产品性能。 BD Cytofix / Cytoperm Plus固定/渗透试剂盒（BD GolgiStop蛋白质转运抑制剂）（目录号554715）除了固定/渗透溶液和BD Perm / Wash BD Cytofix / Cytoperm中包含的缓冲液固定/渗透试剂盒，BD Cytofix / Cytoperm Plus固定/渗透试剂盒提供含有莫能菌素的BD GolgiStop蛋白转运抑制剂。BD GolgiStop离体添加到体外或体内刺激的细胞阻断其细胞内转运过程。这导致大多数细胞因子蛋白在高尔基复合体中的积累，从而增强细胞因

8、子染色信号（见图2-4）。BD GolgiStop试剂，至少能处理1升细胞密度高达210 6个细胞/ mL的培养细胞。试剂盒成分：固定/渗透溶液（125 mL）BD Perm / Wash缓冲液，10 X浓缩液含有FBS *和皂角苷（使用前在蒸馏水中稀释1:10）（100mL）BD GolgiStop蛋白转运抑制剂含有莫能菌素（也作为单独组分出售;目录号554724）（0.7mL）注意：BD Perm / Wash缓冲液是包含FBS的10 X储备溶液。该产品的颜色可能因批次而异，并且可能含有可见的沉淀物。颜色变化和/或沉淀物不影响产品性能。 *所有血清蛋白的来源均来自美国农业部检查的位于美国的

9、屠宰场BD Cytofix / Cytoperm Plus固定/渗透试剂盒（BD GolgiPlug蛋白质转运抑制剂）（目录号555028）除了固定/渗透溶液和BD Perm / Wash BD Cytofix / Cytoperm中包含的缓冲液固定/渗透试剂盒，该试剂盒提供了另一种蛋白质转运抑制剂BD GolgiPlug，含有brefeldin A.参见图2-4。BD GolgiPlug试剂，至少能处理1升细胞密度高达210 6个细胞/ mL的培养细胞。试剂盒成分：固定/渗透溶液（125 mL）1.BD Perm / Wash缓冲液，10 X浓缩物含有FBS *和皂苷（稀释1:10在蒸馏水中

10、使用前）（100mL）2. BD GolgiPlug蛋白质运输抑制剂含有布雷菲德菌素A（也作为单独成分出售;目录号555029）（1mL）注意：BD Perm / Wash缓冲液是含FBS *的10 *储备溶液。该产品的颜色可能因批次而异，并且可能含有可见的沉淀物。颜色变化和/或沉淀物不影响产品性能。 警告和注意事项1.危险BD Cytofix / CytopermTM缓冲液（固定和渗透溶液;组分51-2090KZ）含有4.2甲醛（w / w）。危险说明吸入有害。造成皮肤刺激。造成严重的眼睛损伤。可能导致皮肤过敏反应。怀疑造成遗传缺陷。可能导致癌症。接触途径：吸入。可能引起呼吸道刺激。防范说明

11、穿防护服/眼睛防护。戴防护手套。不要吸入雾/蒸气/喷雾。如进入眼睛：用水小心冲洗数分钟。去除隐形眼镜，如果存在并且容易做到。继续冲洗皮肤刺激或皮疹发生：求医/咨询。2.Danger BD GolgiStopTM蛋白质转运抑制剂（组分51-2092KZ）含有99.61乙醇（w / w）和0.26莫能菌素，mononatriumsalz（w / w）。危险性说明高度易燃的液体和蒸气。造成严重眼刺激。防范说明：远离热源/火花/明火/热表面。禁止抽烟。戴防护手套/防护眼睛。穿防护服。如果在皮肤（或头发）上：立即脱掉所有受污染的衣服。用水淋浴冲洗皮肤。如进入眼睛：用水小心冲洗数分钟。去除隐形眼镜，如果存

12、在并且容易做到。继续冲洗按照地方/地区/国家/国际规定处置内装物/容器。 一般程序A.细胞刺激已经报道了用于刺激产生细胞因子的细胞的各种体外方法.1-6多克隆激活剂可用于诱导和表征细胞因子产生细胞。这些包括以下内容：佛波酯和钙离子载体或离子霉素，植物血凝素，葡萄球菌肠毒素B和针对TCR / CD3复合物亚单位的单克隆抗体（有或没有针对共刺激受体如CD28的抗体）。注意：据报道，单独使用PMA的细胞活化导致小鼠T细胞表面的CD4的表达瞬时丧失。据报道，用PMA和钙离子载体一起活化细胞引起CD4表达的更大和持续的降低，（Cell activation with PMA and calcium io

13、nophore together has been reported to cause a greater and more sustained decrease in CD4 expression）以及小鼠胸腺细胞和小鼠和人外周T淋巴细胞中CD8表达的降低.1.使用BD GolgiStop蛋白质运输抑制剂（含有莫能菌素）的程序。每6 mL细胞加入4ulBD BD GolgiStop并彻底混匀。建议BD GolgiStop不要在细胞培养中保持超过12小时。注意：建议进行动力学研究测定每个实验系统的最佳孵育时间。2.使用BD GolgiPlug蛋白质转运抑制剂（含布雷菲德菌素A）的程序BD Go

14、lgiPlug含有在4下为固体的DMSO。使用前请务必在室温下解冻。每1 mL细胞培养物加入1uL BD GolgiPlug，并彻底混匀。建议BD GolgiPlug不要在细胞培养中保持超过12小时。注意：建议进行动力学研究以测定每个实验系统的最佳孵育时间。B. 方案：细胞表面抗原和细胞内细胞因子的多色染色1. 收细胞活细胞群体可以从体内刺激的组织或用蛋白质转运抑制剂处理的体外刺激培养物制备。细胞应该从含有BD GolgiStop或BD GolgiPlug的培养基中脱出来，然后重新悬浮在染色培养基中，计数并转移到塑料管或微孔板中进行免疫荧光染色。在染色和存储过程中细胞应避光保护。2. 嵌合Fc

15、受体阻断Fc受体的试剂可用于减少非特异性免疫荧光染色a. 在小鼠系统中，对于FcII/ III受体（BD Fc Block？;目录号553142）特异的纯化的2.4G2抗体可用于阻断由Fc受体介导的荧光染料共轭荧光标记的抗体的非特异性染色。用Fc Block阻断小鼠Fc受体，在100l染色缓冲液中用1gBD Fc Block / 106细胞预培养细胞悬液，在4下15分钟。然后可以将细胞洗涤并用特异于感兴趣的细胞表面抗原的荧光染料共轭荧光标记的抗体染色，该抗体应该在染色缓冲液中适当稀释。b. 可以将来自相同物种的10正常人血清或过量的不相关纯化Ig的细胞和用同型作为免疫荧光染色的抗体来预先阻断人细胞上的Fc受体。3.细胞表面抗原染色a.在50L染色缓冲液中用适量的针对细胞表面抗原如CD3，CD4，CD8，CD14或CD19（30分钟，4）特异性的荧光染料共轭荧光标记的的单克隆抗体。 注意：此时可以进行不同细胞表面抗原的多色染色，适当调节补偿最亮荧光信号。识别细胞表面标记的一些抗体可能不结合固定/变性抗原.因此，建议染色细胞表面抗原时细胞是活的，未固定的细胞进行固定/透化和染色细胞内细胞因子。改变细胞在染色细胞表面抗原之前固定的程序需要经验地鉴定合适的抗体克隆。 b.用染色缓冲液（例如，250L/微孔板洗涤，