重组天花粉蛋白研究进展.docx

1、重组天花粉蛋白研究进展重组天花粉蛋白研究进展 彭平平，黄利鸣，王艳林【摘要】 目的天然天花粉蛋白(TCS)是一种拥有抗肿瘤、抗病毒的核糖体失活蛋白，但在临床应历时有细胞毒性强和诱导严峻过敏反映等不良反映。利用基因工程技术和化学修饰的方式对天然TCS进行改造和修饰，以期取得高效、低毒和低免疫原性的TCS供临床和研究利用，是当前研究的热点课题，文章综述了该领域的新近研究进展。 【关键词】 天花粉蛋白； 定点突变； 化学修饰； 抗原性传统中草药天花粉，入药已有两千年历史，中医用于中期怀胎引产及宫外孕、葡萄胎、腹腔怀胎等疾病的医治。天花粉蛋白(Trichosanthin，TCS)是天花粉发挥药效的要紧

2、成份，Chow TP等1第一从括楼Trichosanthes kirilowii Maximovich叶片的基因组中分离到全长的TCS基因。序列分析结果显示，该基因没有内含子结构，成熟TCS由247个氨基酸组成，前体蛋白还包括一段信号肽(23个残基)和一段C结尾肽序列(19个残基) 2。最近几年来的临床研究发觉，TCS对呼吸、消化、血液、生殖等多个系统的恶性肿瘤细胞均具有显著的生长抑制并诱导凋亡的作用35，表现出普遍的抗病毒、抗肿瘤效应68。但由于TCS具有很强的免疫原性，可诱导产生破坏性抗体IgG和IgE 9，在临床实验中会也产生一些如过敏反映、神经和肾脏毒性等副作用 10，11，从而限制了

3、临床应用。随着分子克隆技术的进展，很多研究者致力于改变TCS结构，以达到降低免疫原性，提高药效，延长其体内代谢时刻等为目的研究2。本文总结了最近几年来重组TCS及其生物学活性方面的相关研究进展。1 含有定点突变的重组TCSTCS是一种I型核糖体失活蛋白，具有N-糖苷酶活性，它能使28s rRNA第4324位点上的A脱腺嘌呤，由此致使核糖体失活并抑制蛋白质的生物合成。Wong KB等对TCS的酶活性中心处的Glu160和Glu189进行定点突变，并对突变后的重组TCS进行效价分析（体外蛋白合成抑制实验），结果发觉，Glu160和Glu189上的羧基参与催化反映并对中间过渡复合体起到稳固作用。与野

4、生型TCS相较，E160A（Glu-Ala突变）和E160D（Glu-Asp突变）别离使TCS的蛋白合成抑制效应减低15倍和52倍。E160A突变时，Glu189上的羧基能够替代Glu160的羧基发挥作用，但E160D突变时，Asp上的羧基偏离最正确催化位点,而Glu189上的羧基又无法补偿，因尔后者能更大程度地阻碍TCS的活性。为证明活性位点处的羧基在介导酶催化活性中重要性，Wong等对Glu160和Glu189进行E160A/E189A双突变， 结果TCS对蛋白合成的抑制效应下降了1800倍。与天然TCS相较，E160D、E160A突变蛋白的抗增殖、免疫抑制能力也都显著降低，这些结果取得N

5、g TB等实验的进一步证明，并发觉重组TCS对体外培育胚胎细胞的毒性较其他细胞（脾细胞和肿瘤细胞）要高。随后徐琼芳等利用DNA聚合酶链式反映(PCR)技术，将天然天花粉蛋白（nTCS）基因中22位精氨酸(Arg)定点突变成亮氨酸(leu)，突变后的天花粉蛋白R22LTCS其核糖体抑制功能降低了10%。从TCS的晶体结构分析，TCS中Arg22与Ala161和Ala162之间形成两个H键， Arg22突变成Leu22后，上述氢键将消失，由此阻碍临近的酶活性位点（Glu160-Arg163）的构象。姚宏兵那么将TCS基因的两个保守残基14位酪氨酸（Tyr）和22位精氨酸（Arg）同时定点突变成苯丙

6、氨酸（Phe）和亮氨酸(leu), 取得的重组蛋白Y14F/R22LTCS对核糖体活性的抑制能力比天然TCS降低了倍,活性转变不显著,说明TCS的Try14和Arg22对维持其活性部位构象并非是必需的。但由于Y14F/R22L TCS在大肠杆菌中的表达量与天然TCS相较明显下降,因此,Tyr14和Arg22可能与TCS翻译后的折叠有关。Chan SH12等以为，成熟TCS的 C结尾可能与该蛋白的抗原性有关，他们通过系列删除的方式慢慢去掉成熟TCS C结尾的氨基酸残基，结果发觉C结尾系列对维持TCS的正常构象极为重要，为维持TCS的大体生物活性，C结尾能够被删除的氨基酸数最多只能是7个。这种C结

7、尾移除7个氨基酸的突变TCS（C7-TCS）其体内抗原活性降低倍、细胞毒性那么下降10倍。他们对C7-TCS的结构进行分析发觉，与野生型TCS相较，突变致使蛋白螺旋程度降低，色氨酸192（Trp192）暴露和热稳固性下降。这些构象上的改变是不是是其免疫原性下降的分子基础有待进一步深切探讨。近来，王萍等13通过RT-PCR技术扩增无N端信号肽和C端肽序列的TCS基因，成功构建了原核高效表达质粒pET-29b-TCS并取得重组蛋白。他们发觉与TCS前体蛋白相较，重组蛋白的抗原性显著降低。聂慧玲将天花粉蛋白分子上第120123位的氨基酸残基从Lys-Ile-Arg-Glu突变成Ser-Ala-Gly

8、-Gly，结果突变体TCS抑制蛋白质合成的能力(ID50)降低了约4 000倍，而用中期怀胎小鼠的流产实验证明，突变体TCS对胎鼠致死效劳仅约为天然TCS的8%；当对第98和177位的氨基酸作Asp-Gly和Lys-Arg突变后，所得突变体蛋白的生物活性均未见明显改变，上述结果提示120123位氨基酸对TCS发挥生物学活性有重要意义。安群星等14对TCS分子上可能的抗原决定簇位点(Tyr-Phe-Phe81-83、Lys-Arg173-174)进行定点突变,取得突变体TCS（Ala-Cys- Ser81-83，Cys-Gly173-174），并将新的突变体与野生TCS（wTCS）进行各类生物活

9、性及免疫原性分析，发觉突变TCS在DNA酶活性、致核糖体失活活性方面与wTCS没有统计学不同，突变TCS免疫的小鼠其血清内IgE水平显著降低, 说明突变体TCS免疫原性较wTCS低。最近，尤程程等15用RT-PCR技术从头鲜栝楼叶片中扩增TCS cDNA，测序鉴定后克隆入表达载体pET-28a(+)并转化入BL21(DE3)细胞。IPTG诱导表达后,用金属镍螯合层析法纯化取得重组天花粉蛋白（rTCS），rTCS碱基序列与基因库中注册的序列%同源。随后对照分析了rTCS和wTCS对宫颈癌Hela细胞生长的阻碍,结果说明，二者对Hela细胞的抑制均随药物浓度的增加而增强, rTCS的IC50小于w

10、TCS, 说明rTCS的细胞毒性小于wTCS。2 化学修饰的TCS 聚乙二醇（PEG）修饰PEG是一种平安无毒、无活性、溶解性好的大分子聚合物，由氧乙烯单体聚合而成，经常使用于蛋白、多肽类及非肽类药物的化学修饰16。PEG对巯基(半胱氨酸Cys侧链上的基团) 的修饰具有很高特异性,但TCS本身不含Cys残基,为取得PEG修饰的TCS，姜国勇等第一通过定点突变将一个Cys残基引入到TCS中,然后再将 PEG耦联到新引入的 Cys侧链上。先前何贤辉等17通过基因克隆，用半胱氨酸（Cys）残基取代第7位的丝氨酸(Ser)，以此作为TCS碱基序列上唯一一个Cys与PEG耦联，从而取得分子量为38 KD

11、的PEG-TCS复合物。PEG修饰使其蛋白合成抑制活性相关于天然天花粉蛋白降低约6倍，但其引产活性(体内)并无明显改变,与wTCS大体相同。An QX等18将TCS 81-83位Tyr-Phe-Phe突变成Ala-Cys-Ser,取得的突变重组体蛋白再用PEG修饰。随后的研究发觉，PEG修饰后的TCS DNA酶活性与野生天花粉蛋白(wTCS)相同，核糖体失活活性是wTCS的1/9-1/8;PEG修饰TCS免疫小鼠后， 血清IgE和IgG滴度显著低于用wTCS免疫的小鼠,值得注意的是，PEG修饰后的重组TCS在体内平均留存时刻和半衰期显著升高，而血浆清除率极大地降低。而在第173位引入的半胱氨酸

12、残基进行PEG定点修饰，修饰后TCS的活性与野生型TCS(wTCS)活性几乎相当,而免疫原性已显著降低，PEG修饰型TCS虽有活性下降,但其免疫原性、急性毒性和药代动力学性质取得显著提升19。 葡聚糖修饰 陈华伦等20还通过定点突变，用Cys别离替代Arg29和Lys173后，再将葡聚糖耦联到Cys上。与wTCS相较，修饰蛋白TCS（R29C）和TCS（K173C）的核糖体抑制蛋白活性降低50%，平均存留时刻增加27倍。葡聚糖修饰的TCS（K173C）在猪体内引发的过敏反映大大降低。同wTCS相较，葡聚糖修饰的TCS(K173C)对lgG和IgE的反映降低，相反葡聚糖修饰的TCS(R29C)的

13、免疫原活性没有明显改变。这些结果提示Lys173位于或接近抗原决定区域。3 重组天花粉蛋白突变体质量标准成立HAN Chun-mei等21成立了一套对重组天花粉蛋白突变体（MTCS）的质量操纵标准和检测方式。这些检测方式包括用HL-60细胞株/MTT比色法定量测定MTCS体外生物学活性；用C4-HPLC和非还原型SDS-PAGE测定蛋白纯度；用毛细管电泳法测定等电点；用胰酶消化/RP-HPLC测定肽图；用还原型SDS-PAGE测定蛋白分子量等。用这些方式检测实验样品时，MTCS原液和成品对HL-60细胞的反映曲线与参考品的反映曲线一致，都呈现典型的S型曲线而且符合四参数方程式Y=(A-D)/(

14、1+(X/C)B)+D，相关系数大于;蛋白质纯度大于%；等电点为；蛋白原液的肽图与参考品肽图图形一致，分子量为4。上述质量操纵标准和检测方式的成立，对推动基因重组TCS的研究具有超级重要的意义。综上所述，天然天花分蛋白通过定点突变和化学修饰后，突变体的核糖体失活活性，体内外细胞毒性，胚胎毒性，抗原性，血浆清除率都有专门大的改变。该领域的研究功效，为研制低毒、高效和低免疫原性的TCS提供了新的思路和技术手腕，具有重要的临床意义。【参考文献】 1Chow TP， Feldman RA， Lovett M，et al. Isolation and DNA sequence of a gene enc

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