耐碳青霉烯类抗菌药物的阴沟肠杆菌耐药机制及耐药传播机制研究.docx

1、耐碳青霉烯类抗菌药物的阴沟肠杆菌耐药机制及耐药传播机制研究耐碳青霉烯类抗菌药物的阴沟肠杆菌耐药机制及耐药传播机制研究 菌 论文作者签名： !芒!皇 指导教师签名： 论文评阅人1：程东庆副教授硕士生导师浙时医缒 评阅人2： l蓦篝蔓翼誓董董爹 评阅人3： 评阅人4： 评阅人5： 答辩委员会主席：张立煌教授博士生导师逝坚盔堂皇堕堂堕 委员1：潘建平教授博士生导师浙江大学城吏堂堕 委员2：夏大静教授博士生导师浙江大学生命科学望!篁堡 委员3：王晓健教授博士生导师浙江大学医学院 委员4：陈建忠副教授浙江大学医学院 委员5： 答辩日期： 2012年2月23日 浙江大学研究生学位论文独创性声明 - 簟 本

2、人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得逝姿盘堂或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作 了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：伊尹谢 签字日期：2矿年2，月日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解逝鎏盘堂 有权保留并向国家有关部门或机构 送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权逝鎏盘鲎可以 将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、 缩印或扫描等

3、复制手段保存、汇编学位论文。 保密的学位论文在解密后适用本授权书 学位论文作者签名： 导师签名： 签字日期：一2-，V年汐月多歹日 签字日期：力口，1，年 2，月矽日 一峰 t 浙江大学硕士学位论文 致谢 致谢 衷心感谢我的导师王青青教授给了我学习深造的机会和学术上精心的指导， 他们深邃的学术造诣、严谨的治学态度、国际化的视野都让我永志不忘，受益终 生。衷心感谢陈学军老师在本研究的选题、实验、结果分析、论文撰写和修改等 过程的关心和指导以及生活上的亲切关怀与照顾。衷心感谢细菌室其他老师对我 的帮助和大力支持。衷心感谢周明明等其他同事，感谢他们无私的帮助和支持， 这将是我人生中非常难忘的一段岁月

4、。 衷心感谢蔡佳昌博士在等电聚焦电泳实验上的指导和帮助。 衷心感谢我的挚友们，在我仿徨、焦虑和失落的时候给我的真诚的建议、开 导和安慰。特别感谢我的父母，含辛茹苦把我抚养成人并供我求学到今。也感谢 我的其他家人对我的默默支持，关心和鼓励。 叶 青 2011年12月于浙大紫金港 本研究受浙江省医药卫生科技计划项目资助 2011KYB045 浙江大学硕士学位论文 中文摘要 耐碳青霉烯类抗菌药物的阴沟肠杆菌 耐药机制及耐药传播机制的研究 浙江大学医学部 免疫学 硕士研究生 叶 青 导 师 王青青教授 中文摘要 目的： 调查儿科临床分离的阴沟肠杆菌对临床常见抗生素的耐药现状，探究耐碳青 霉烯类阴沟肠杆

5、菌的临床分布特征，耐药机制及耐药传播机制，为临床合理用药 和院感防控提供一定的实验依据。 方法： 回顾分析我院2009。2011年问临床感染菌种类，科室分布，标本来源和耐药现 状，特别是对阴沟肠杆菌的临床现状进行详细的了解。并对200909201012期间 我院患儿感染性标本分离的阴沟肠杆菌采用TEK全自动微生物分析仪结合鉴定 卡鉴定，用药敏卡或结合KB法做药敏试验。对分离的耐碳青霉烯类阴沟肠杆菌， 采用cLsI推荐的肉汤稀释法检测最低抑茵浓度，采用改良Hodge试验检测菌株碳 青霉烯酶，采用EDTA协同法检测菌株金属酶，等电聚焦电泳用于检测p内酰胺 酶，用PcR扩增耐药基因，并进行测序分型。

6、质粒接合试验和质粒消除试验用于 评估质粒的移动性。耐药基因的位置用质粒电泳进行大致的区分。 结果： 浙江大学硕士学位论文 中文摘要 菌分离自患儿的痰、尿液、脓液、分泌物、血液、咽拭子等临床标本，其中痰液 1341419 等。阴沟肠杆菌主要分离自痰液 82，82100 。 所有菌株的检出率在监护病区最高，有369株 2600 ，其次是呼吸科285 沟肠杆菌主要分离自新生儿科，占22 22100 ，其次是监护病区和呼吸科都为 20 20100 。总体上，阴沟肠杆菌对亚胺培南、美罗培南、阿米卡星、庆大 霉素、左氧氟沙星仍高度敏感 90 ，对头孢哌酮舒巴坦、哌拉西林他唑巴 坦、头孢吡肟也有较高的敏感性

7、。 其中，一株耐碳青霉烯类抗菌药物的阴沟肠杆菌携带金属酶IMP26，并且此 酶由1类整合子捕获。此菌株还携带超广谱D内酰胺酶TEM。104，它存在于一个 8kb左右的可接合质粒上。 结论： 1 阴沟肠杆菌对头孢类抗菌药物的耐药很严重，这与此类药物在儿科中的 广泛使用引起的产p内酰胺酶株的筛选有关。耐碳青霉烯类抗菌药物的阴沟肠杆 菌也在临床被检测到。 2 金属酶IMP26在新加坡的铜绿假单胞菌中首次被报道，国外其它地区罕 有报道。在国内未曾有报道。在阴沟肠杆菌中检测到IMP26尚属首例。 最主要的IMP酶，因此需加强对其突变株的管理。 4 第一次发现金属酶IMP26存在于整合子中，有非常重要的临

8、床意义。 关键词：金属酶；碳青霉烯酶；阴沟肠杆菌 IlI andTEM?1 04 in mase ExtendedSpectrump-Lacta Plasmid ConjugatiVe Schoolof of medicine，ZhejiangUniVersi劬Institute Immunology 2009 Ye PostgraduateQing Supervisor Pro，jmg Qingqing Abstract Objectives： To tlleaIltibioticsresistallcesta_tusofEc面口c口PaIldto the ireStigate stlJdy

9、 chlracteristicofcliIlical mecbanismaIld distribution，resistance mechamsmof E ordert0contributetotllecon臼-olof Carb印enem-lksistamtc肠口P，in Ilosocomialarld infectionthe ofaIltibiotics reasomlble印plication Methods： A was t0reViews仃aillsofclinical re仃ospectiVearmlysisperfo咖ed infection，吐leir sourceaIldr

10、esis切nce t0le锄tlleclinical dist舶utioll，specimen situation，especially si触tionofE tIle of200920 c肠口阳P，duringyears 11Ec如口阳Pwasidentifiedtlle by GNIcardsonVitek teSts alIto-microbi0109yaIlalysissystemAntibiotiessensitivit r were GNSc砌s pe墒rIIled using E was czD伽e were Then此C衲印enemResistant studied缸cherl

11、yMICs 浙江大学硕士学位论文 英文摘要 detemined丽th staJldard ofceUextracts、aSusedfor proceduresIsoelectricfocusing detectionof fortlle and plact锄aSesPCRassays谢mprirnersSpecific 6肠，似巧gene meconservedofclass to segments aIld carriedout l硫e伊onssequence锄alyses、ere ? andt0 idemi矽nlegene m印the metallop1act锄aseencoding of

12、the wasassessed谢t11 locationofthe gene coIljugationexperimentsToidenti匆the aIld wereca圩ied 6肠陋乒，gene，co巧ugationexperimentsplaSmidelectrophoresisout， PCR by amplified Results： 1 419strains timeof20099-2001 bacterium、ere Durh玛tlle 2，1 of伊am-negatiVe nomtllewardofour are469st】?aillSEcDZf mem，tllere sep

13、删ted hospitalAmong forthe acco吼tingfirSt 3305 ，465 the 00 E for t11e second s仃ains mefifm place，l c肠口翻P 704 accoumingplaceAll bacteria、ere fromthe 伊anl-negatiVe s印erated patientssp砷哪，urine，blood，pus， secretionandthroat these1008 swabs，of 露 。二贯 Spun删；134s仃ains 944，1341419 c锄1e舶mpus，etcEc肠绷Pmailllys印e

14、rated from splmlII】 82，82100 IntensiVecaremlitllas戗1e rcleVallcera：tiowim369 hi曲est s吮inS 26oo ；me secondisme of 285 of d印a咖1entrespiration谢thstrains 2008脚；DiVision llas208 haS160strains su唱er ，depanment Neonatologystr。ainS 1466 ；general Ec如口c口P Divisionof 1128 ，etcAnd mailllys印erated舶m Neonatology

15、for uIlitaIld of 22 22l care d印arnnent taken accounting 00 ，IntensiVe respirationup 。 sensmeratesof 20 20100 ，respectiVely111e t0 leVonoxacin a11dleVonoxaCinE咖口c伽remained geIltaI】1ycin hi曲 90 t0 wercalso EczD口c口P cefepime CefoperazonesulbaCtam，pipemcilliIlsulbact锄arld V 浙江大学硕士学位论文 英文摘要 SenSltlVe A E

16、c，0口c口Pwasfound c打bapenem-resistam to IMP一26 carry metallop1ac锄2Lse f incl硒sl andTEM-104 in o integron extended-spec饥吼p?laCt锄aSeco巧ugatiVe plaSmid Conclusions： of 1 Thet ，pe I加P-26 iIl Metallop-lact锄ase、vaS firStly哪 o他dSing印ore， c删edas仃ainof israrein andhaSnotbeen by Jp峪P“如，挖D刀伽口P，z倡f聆Ds口It foreign

17、i11our is虹lefirstthetodetect reponed co硼t巧h EczD口P IMP26 c鲫叮ing Me协llop-lactaIllaSe me is mutants疵nofIMP一4IMP-4 2 IMP一26 is Metallo-陆c伽nase ve巧 iIl shouldto domestic，therefore、Ve t11e ofle popular strengthenmanagemem mutations ismefirsttimet0findIMP-26 haS 3 It c印turedbyintegron，砌chmay ve巧 cliIlical

18、 importantsigIliflcallce c肠口c口P Keywords：metallop-lactamases；c抽apenemaSes；E Vl 浙江大学硕士学位论文 缩略词表 缩略词表 缩写 英文全称 中文全称 InStitute CLSI CliIlicaland 临床实验室标准化研究所 Laborato巧Stalldard MIC Millimal 最低抑菌浓度 Inllibito巧Concen臼_ation S Susceptible 敏感 I IntenIlediate 中介 R RIesistant 耐药 ChainReaction 聚合酶链反应 PCR Polmera

19、se nucleoside 三磷酸脱氧核苷 dNTPDeoxy triphosphate IMP Imipenem 亚胺培南 粤 MEMMeropenem 美罗培南 EsBLsExtended 超广谱p-内酰胺酶 SpectrI蛐pLact锄ases MBLsMatato。DLact锄ases 金属p-内酰胺酶 PBS saline 磷酸盐缓冲液 Phosphatebuffered medi眦 菌种保存液 LB Luria-BalaIli NDM1New 1 新德里金属-p一内酰胺酶l MetallopLaCtamase TSA Agar 胰蛋白胨大豆琼脂 T哪tic嬲esoy chainre

20、action 聚合酶链反应 PCR Pol砌erase Isoelectric 等电点 pI point AmpCcephalosporinases AmpC酶 EsBLs be切，lact锄ases 超广谱p-内酰胺酶 Extendedspectnlm BaSe 碱基对 bp pair M mo儿 摩尔每升 minute RIevolutions 每分钟转数 rpm per VII 目 次 致谢I 中文摘要II 英文摘要 缩略词表vII 目次 1引言1 2材料与方法3 21主要仪器3 22主要试剂4 23方法6 3结果16 31 阴沟肠杆菌等革兰阴性杆菌的临床分布和耐药性调查16 32耐碳青

21、霉烯类阴沟肠杆菌耐药性和分子机制19 4讨论29 5结论和展望37 参考文献38 综述l47 综述256 附录92 作者简历及在学期间所取得的科研成果93 浙江大学硕士学位论文 引言 耐碳青霉烯类抗菌药物的阴沟肠杆菌 o 耐药机制及耐药传播机制的研究 浙江大学医学部 免疫学 硕士研究生 叶 青 导 师 王青青教授 1 引言 金属p内酰胺酶的产生是引起革兰阴性菌的多重耐药的重要因素，并且这种 因素所起的的作用变得越来越重要。这源于它们作用底物的广泛，强效的碳青霉 烯酶活性以及对几乎所用酶抑制剂的耐受，以上种种特性使得它们能水解几乎所 有现在已知的p一内酰胺酶。自从上世纪90年代起，已经有一些DN

22、A移动元件编 码的金属D内酰胺酶在一些重要的革兰阴性菌中出现。 例如肠杆菌科，铜绿假单 胞菌，鲍曼不动杆菌 。它们中的一些酶，例如VIM1和NDM1引起的碳青霉烯 类抗菌药物耐药的肺炎克雷伯杆菌和肠杆菌在全球的播散，引起如今的人类危机。 尽管我们已经了解了这些金属酶的分子生物学和基因实质，但是，我依旧缺乏完 整的流行病学资料和足够的临床经验。致使我们在如何处理这些产金属p内酰胺 酶的细菌引起的感染方面存在许多困惑和争议。金属p内酰胺酶的广泛传播，对 临床抗感染治疗以及感染防控提出了巨大的挑战。 阴沟肠杆菌 Eemerobacter cloacae 广泛存在于水、土壤等外界环境和肠道中， 是一种

23、条件致病茵。随着头抱菌素的广泛使用，阴沟肠杆菌已成为引起医院感染 的重要病原菌，其引起的细菌感染性疾病，常累及多个器官系统，包括皮肤软组 织感染、泌尿道感染、呼吸道感染以及败血症等。由于阴沟肠杆菌能产生超广谱p 1 浙江大学硕士学位论文 引言 严重，仅对碳青霉烯类抗生素仍维持较高的敏感性【1捌。碳青霉烯类抗菌药物在临 口 床上被广泛的用于治疗高产AmpC酶或超广谱p内酰胺酶的肠杆菌科细菌引起的 严重感染【31。然而，在过去的几年中，产碳青霉烯酶的肠杆菌科细菌不断被发现， 这引起了临床工作者的强烈担忧【45】。 碳青霉烯类抗生素对极大多数由质粒或染色体介导的D内酰胺酶都有较高的 稳定性，与青霉素

24、结合蛋白 PBPs 亲和力强，导致细菌细胞的延长和溶解，能 有效渗透细菌外膜进入周质间隙，并且存在抗生素后效应，是目前对革兰氏阴性 菌抗菌谱最广，抗菌活性最强，具有快速杀菌作用的一类抗生素。目前肠杆菌科 细菌对碳青霉烯类抗生素耐药的机制主要有三种：一、碳青霉烯酶的产生；二、 平p内酰胺酶的持续产生，主要见于阴沟肠杆菌、产气肠杆菌6，刀；三、药物作用 靶位的改变，主要是青霉素结合蛋白PBPs的改变【81。其中最重要是碳青霉烯酶的 和vIM 是肠杆菌科细菌中报道的最常见的两类碳青霉烯酶【9111。在肠杆菌科细 菌中己报道的碳青霉烯酶大多由染色体介导，如阴沟肠杆菌中的NMCA，IMI1和 粘质沙雷菌

25、s13【12。15】，只有少数位于质粒上，如阴沟肠杆菌中的IMI2【161， 肺炎克雷伯菌中KPC1，KPC2，KPC3【17。201。 本文调查了我院儿科临床分离的阴沟肠杆菌对临床常见抗生素的耐药现状， 并研究了耐碳青霉烯类阴沟肠杆菌的临床分布特征和耐药机制。发现了一株携带 究。 2 浙江大学硕士学位论文 材料与方法 2材料与方法 - Q 21主要仪器 VITEK60全自动微生物分析仪法国生物梅里埃公司 恒温摇床华达利HZ8811K 江苏大仓市科技器材厂 多点接种器3GNl20L型 S加a公司 电热恒温培养箱DKS24型 上海精宏实验设备有限公司 DK8B电热恒温水浴箱 上海精宏实验设备有限

26、公司 江苏省太仓市科教器材厂 华利达空气恒温振荡器 Hz8811K 一70低温冰箱 美国mmo公司 茸 一20低温冰箱 美国西门子公司 28冷藏柜 青岛海尔电器有限公司 冷冻离心机 美国111enn0公司 离心机 德国Eppendorf 低温超速离心机 德国BeckmaIl 超纯水系统 德国Sanorius公司 璺、 Kodak凝胶图像分析系统 美国Life Technologies公司 超净工作台 北京东联哈尔滨仪器制造有限公司 生物安全柜 美国The胁。公司 C02培养箱 美国Thenno公司 激光共聚焦显微镜 德国蔡司 ZEISS 公司 倒置显微镜 麦克奥迪Motic公司 紫外分光光度仪

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