湖南大学教案44双水相萃取与应用441概述定义双水相.docx

1、湖南大学教案44双水相萃取与应用441概述定义双水相4.4 双水相萃取与应用4.4.1 概 述（1）定义：双水相系统：因两种水溶性聚合物的水溶液，或一 种水溶性聚合物水溶液与盐溶液混合时的不相容性而形成有明显界面的两相系统。（2）特点：两相均含有大量的水（高达80%以上）， 界面张力小，一般只有0.5-10-4mN/m， 萃取环境和条件温和， 生物相容性好，有时有稳定作用； 分配系数可控：聚合物修饰、相系统组 成、操作条件容易放大，几百倍。（3）发展历史： 1896年荷兰微生物学家Berjerinck发现琼脂水溶液与可溶性淀粉或明胶水溶液混合时形成双水相现象。 1956年瑞典lund大学的Al

2、bertsson教授及其同事开始对双水相系统进行比较系统研究。测定了许多双水相系统的相图，考察了蛋白质、核酸、病毒、细胞及细胞颗粒在双水相中的分配行为，为双水相萃取系统的发展奠定了基础。只局限于实验室内的测定和理论研究。 Kula教授研究小组对双水相的应用、工艺流程、操作参数、工程设备、成本分析等进行了大量研究，在应用上获得成功。1978年首先将双水相萃取技术用于酶的大规模分离纯化，建成了一套工业装置，达到20kg/h的处理能力，分离纯化了几十种酶，也应用于基因工程产品的分离。 双水相萃取可分离多肽、蛋白质、酶、核酸、病毒、细胞、细胞器、细胞组织，以及重金属离子等，近年来，还应用于一些小分子，

3、如抗生素、氨基酸和植物的有效成分等的分离纯化。作为反应系统用于酶反应，生物转化，发酵的产物生产与分离的集成（4）缺点和不足： 双水相系统含较高浓度的水溶性聚合物和盐，会带到产物中，去除需要辅助处理方法。 成本较高。即使水溶性聚合物和盐尽管回收再用。 选择性较低，分离纯化倍数低，一般只适用于粗分离。研究最多的几种典型双水相系统：4.4.2 双水相系统及成相机理两种水溶性聚合物溶液混合，形成单一相还是两相，主要取决于两种因素：系统熵的增加；分子间的作用力。熵的增加与分子数目有关，而与分子大小无关；分子之间的相互作用力可看作分子中各基团相互作用力之和，随分子量的增加而增加。分子量大的聚合物以摩尔计的

4、相互作用能超过混合熵的增加而起主导作用，进而决定聚合物溶液混合发生的现象。当两种聚合物之间互不相容，而排斥，它们的线团结构无法互相渗透，导致一种分子为同种分子所包围，在达到平衡后，形成了互不相容的各自富含单一种聚合物的两相。 Zaslavsky等人认为，聚合物引起水溶液结构变化是促进相分离的主要原因。X-射线衍射数据表明，无水时葡聚糖（DEX）与聚乙烯醇(PVA)混合物(1:1)并不表现不相溶性。在水溶液中，即使在低浓度（3.5%DEX和2.45%PVA）下也会发生相分离。 在水溶液中，聚合物的长链分子通过氢键同周围的水分子发生强烈地相互作用，每一个氧原子结合两个水分子，使溶液中的PEG分子被

5、一层高度有序的水合作用层所包围。葡聚糖虽无与PEG类似的结构，但同样，分子中的羟基通过氢键作用在分子周围形成水分子层。 两种聚合物周围形成不同的互不相容的分子结构造成相分离。这一机理可解释温度、添加无机盐和尿素等对相分离行为的影响。按聚合物对溶剂水性质的影响程度为PEGPVAPVPFicollDEX，而成相所需聚合物浓度为DEX-PVADEX-PEGDEX-PVPDEX-Ficoll。综合考虑聚合物的分子量因素，二者的次序十分一致。 某些水溶性聚合物溶液与某些盐溶液混合，两者浓度达到一定值时，也会分为两相，形成聚合物-盐双水相系统。机理不清楚。一种解释为盐析作用。 无机盐和简单的有机盐均可，其

6、成相相对能力与其盐析能力次序基本一致。阴离子作用比阳离子重要。多原子离子比单原子离子更有效，成相浓度低。大而电荷密度低的单原子阴离子容易与PEG分子中 的氧偶极子发生作用，成相浓度高，无法使用。但它们可以作为中性盐添加组分加入聚合物/聚合物和聚合物/盐系统中，用于改变分配系数。 对于聚合物/盐系统，因盐比葡聚糖便宜得多，使得聚乙二醇(PEG)/盐系统具有工业上应用优势。4.4.3 选择双水相的原则 能够获得高的产物回收和生物活性回收，高的分离纯化倍数； 系统的物理化学性质有利于大规模的应用，有良好的工艺性能，系统黏度低，相分离快，达到相平衡时间短，工艺参数容易控制，工艺条件可调性范围大； 系统

7、经济，成本低，无毒，适合大规模应用。4.4.4 双水相系统相图（1）成相及上、下相组成:相图中TCB联线为一双节点线，双节点线下方为单相区；双节点线上方为两相区。如果系统组成处于该区，如M点时，系统分为两相，而上相和下相的组成分别为通过M点与双节点线相交的T和B点相对应的组成。上相主要含有PEG，下相主要含有葡聚糖或盐。两相平衡时，符合杠杆规则。当用T代表上相体积，B代表下相体积时，则 式中 BM为B点到M点的距离，MT为M点到T点的距离。M点向下移动时，系线长度缩短，两相差别减少，到达C点时，系线长度为0，两相间的差别消失而成为一相。因此，C点成为系统的临界点。相图的双节点线的位置和形状与相

8、系统组成及相系统组分的物理化学性质有关，如聚合物的分子量和分子形状。在PEG/葡聚糖系统，如果PEG分子量不变，增加葡聚糖的分子量，相分离所需的葡聚糖浓度越低；两种聚合物分子量相差越大，双节点线的形状越不对称。 在PEG/盐系统中，PEG分子量越大，双节点线也越陡立。（2）分配系数:一种物质在两相系统中的分配行为可用分配系数来描述，分配系数K为该物质在上相和下相中的浓度之比。此处cT和cB分别为上相和下相中的目的物质浓度。当目的物质主要分配在上相时，分配系数K值大于1，并随在上相中浓度的增加而增加；反之，目的物质主要分配在下相时，分配系数K值会小于1，并随在下相浓度的增加而减小。控制能够影响物

9、质分配系数K的因素，包括环境因素，相系统性质和组成就可以改变物质的分配系数。4.4.5 双水相系统的分类按照物质在双水相系统的分配作用类型，可分为空间排阻分配、电化学分配、构型相关性分配、亲和分配、疏水分配和手性分配等类型。 （1）普通双水相系统:普通双水相萃取是指主要依靠空间位阻分配和界面电位分配的双水相萃取，如利用聚合物/聚合物系统和聚合物/盐系统的萃取，它们发展最早，也是研究最多和应用最多的双水相系统，也是其它分配萃取系统的基础。为了改进萃取效率和分离效果，利用控制相系统的pH或在相系统中加入盐或有机溶剂的方法提高目的物的分配系数。 普通的双水相萃取系统的选择性比较低，只适用于产物回收和

10、初步分离。（2）功能团配基亲和萃取:将对目的酶具有离子交换、疏水作用或适当亲和力的亲和配结合在构成双水相系统的某一水溶性聚合物上，与另一水溶性聚合物构成双水相系统。 根据使用基团的性质，可分为： 离子分配萃取； 疏水萃取； 亲和萃取：免疫配基亲和萃取，染料配基亲和萃取和金属螯合亲和 萃取等。 手性分配萃取：利用对目的酶的专一性结合能力，将其萃取到目的相中，并通过控制其他条件，将杂质分配到另一相中，达到分离目的。1）离子分配萃取：利用共价键将离子交换基团如 -NH2，-COOH，-PO43-， -SO42-结合在成相水溶性聚合物上，构成双水相系统，与酶蛋白分子的相互作用进行分配的双水相萃取，其分

11、配行为在很大程度上与蛋白质的表面电荷性质有关，也受到系统的各种因素，如pH、盐浓度和种类、温度等条件的影响。由于这一类功能团配基与酶的相互作用的选择性并不很高，萃取效率和纯化倍数虽然比一般双水相萃取系统高，但低于其他亲和萃取系统。例如利用PEG-磷酸酯/磷酸盐系统进行-干扰素的提取，分配系数可达到630，杂蛋白几乎完全分配在下相。2）疏水分配萃取:利用共价键将疏水基团，如烷基或芳香基结合在水溶性聚合物上，构成的双水相萃取系统。通过疏水基团与蛋白质表面的疏水区域的相互作用，将蛋白质萃取在富含疏水配基的相中，达到分离的目的。由长链脂肪酸与PEG形成的PEG脂肪酸酯作为功能团配基与PEG混合与其他成

12、相组分构成双水相系统，通过与酶蛋白的疏水作用达到分离目的，由于盐浓度对疏水作用影响很小，疏水分配萃取可以用于高盐浓度的物料的分离。3）金属螯合亲和萃取: 将适当的螯合试剂通过共价键结合在PEG上，与适当的金属离子螯合，再与PEG/聚合物双水相系统构成金属螯合亲和萃取系统。 如卤代烷氧基-PEG与亚氨二乙酸(IDA)在碱性条件下反应，生成IDA-PEG，每一个IDA-PEG分子螯合一个金属离子，如Cu2+，Zn2+，Ni2+或Co2+等，与适当的PEG/聚合物双水相系统构成金属螯合亲和萃取系统。这里螯合的金属离子的配位键未满足，仍然可以和蛋白质分子表面的组氨酸、半胱氨酸和色氨酸的N、O或S形成配

13、位键，将酶蛋白结合在螯合基团上。因此，酶被萃取在PEG相中。萃取的选择性主要取决于螯合基团、金属离子和蛋白质表面的氨基酸残基。这种结合作用不受高盐浓度的影响，可构成PEG盐系统。金属离子蛋白质复合物可在pH4范围解离，将酶释放；也可以加入具有金属螯合作用的物质如EDTA等将酶替换出来。该方法对于那些金属离子容易引起变性的酶和以金属离子为辅酶，或以金属离子为维持高级结构所必须的酶的实用性有一定问题，可能引起酶变性或失活。4）染料亲和萃取:酶作用的底物、产物、抑制剂、辅酶等虽然可作为亲和配基使用，但因与PEG的共价键结合比较困难，结合的配基活性较低，使应用有难度。染料亲和萃取是指以活性染料为亲和配

14、基的双水相萃取系统。因染料的亲疏水性，稳定性，亲和常数大小，来源，价格，以及与水溶性聚合物结合的难易，对酶活性的影响等因素，使得可用作配基的染料不多，在双水相亲和萃取系统中研究和应用最多的是活性染料配基，如Procion和Cibacron系列。由于它们具有适宜的立体结构和亲疏水性，在碱性条件下下容易共价结合在PEG、葡聚糖等水溶性聚合物上，并且与许多酶具有亲和能力而被广泛使用。不同的酶和不同的染料的亲和力有较大差别。一般采用最大萃取能力 (logKmax=logK配基logK无配基)和半饱和染料浓度（C1/2）评价亲和作用，前者反映了染料的亲和容量，后者反映了染料与酶蛋白亲和力的大小，C1/2

15、越小，染料的亲和力越大。表3 为不同染料-PEG对不同酶的最大亲和力。（3）问题与发展:染料亲和萃取是液-液两相平衡的分离过程，与亲和色谱相比，它对处理系统的要求低，单位体积的亲和容量大，可以避免在亲和色谱中经常发生的非特异性吸附问题。因此，染料亲和萃取在酶几蛋白质的分离纯化上具有很好的应用前景;在大规模工业应用仍然还存在一些问题。染料亲和萃取系统主要是PEG+PEG-活性染料/Dex系统，成本高，亲和配基材料PEG-活性染料的回收再利用是降低成本的重要措施，但目前还存在一定缺欠； 需要进一步扩大已发现的染料亲和配基的适应范围和新的具有亲和能力的染料配基，进行系统化研究，进一步完善染料亲和萃取

16、系统和应用，解决实用化的具体问题，推动其早日实现工业化应用。4.4.6 双水相萃取体系的影响因素（1）聚合物的影响:聚合物种类、聚合物平均分子量和相对分子量分布均与聚合物的疏水性有关。 聚合物分子量越大，发生相分离而形成双水相所需的浓度越低； 支链高聚物比直链高聚物易于形成双水相体系； 双水相体系的组成越接近于临界点，可溶性大分子的分配系数越接近于1。 具有代表性的聚合物PEG为聚醚，分子两端有游离的羟基，亲水性的游离羟基比例随分子量增加而降低，疏水性随分子量的增大而增加； 在PEG/Dex 系统中，酶在其中的分配系数K值随PEG分子量增加而变小；但随葡聚糖分子量的增加而增加。其影响随酶的种类

17、不同而有差异。 另外，水溶性聚合物的分子量增加会引起溶液黏度增加，改变界面张力。葡聚糖分子量的影响：在PEG/Dex系统中，Dex的分子量增加酶在系统的分配系统增大，Dex分子量分布也有类似的影响。将单一分子量的Dex改为不同分子量的混合物，即使平均分子量与单一分子量相同，混合分子量系统的K值也略低于单一分子量系统。但混合分子量的Dex 价格要便宜的多，可明显降低成本。（2）盐类的影响： 由于盐的正负离子在两相间的分配系数不同，两相 间形成电势差，从而影响带电生物大分子的分配； 与盐浓度密切相关； 盐种类不同，影响不同，尤其以磷酸盐的作用特殊；（3）系统pH的影响： 影响蛋白质分子中可离解基团

18、的离解度，因而改变蛋白质所带电荷的性质和大小，这与蛋白质的等电点密切相关； 相系统的pH不仅直接影响相系统中的蛋白质，也同样影响系统中盐，即影响它们解离度和离子的电荷性质及数量，以及各种离子的比例，如H2PO4-和HPO42-，HSO4-和SO42-，NH3和NH4+。进而影响界面电位U2-U1，对蛋白质的分配系数产生强烈的影响。通常pH的微小变化就会引起蛋白质分配系数发生23数量级的变化。（4）温度的影响：温度主要影响两相系统的形成，随着温度的降低，分相的临界聚合物浓度减小，所以在临界点附近，温度对酶的分配系数影响较大，而在远离临界点时，影响较小；在相组成一定时，温度的降低会使相图的结点线增

19、长，两相差异增大，可引起分配系数的下降。使用PEG/(NH4)2SO4相系统从细菌中萃取荧光素酶时，温度对分配系数的影响不明显。 通常酶的稳定性会随温度的增高而减低，但在双水相系统中，由于所使用的聚合物含有多羟基，对酶有保护作用，即使在室温下，酶的失活也不明显。因此酶的双水相萃取可以在室温下进行，这可以节省因冷却造成的大量能摹。（5）双水相体系的性质： 黏度：不仅影响相分离速度和流动特性，而且影响物质的传递和颗粒在两相中的分配； 两相密度差：必须借助离心力才能进行有效分离； 表面张力：主要决定于体系的组成和两相间组成的并别，从相图上讲与结线的长度成线性关系； 相间通常会形成电势差，一般加入不同

20、比例的磷酸盐和氯化钠来控制相间电势； 相分离速度一般较慢4.4.7 双水相萃取体系的应用（1）在生物工程领域的应用 双水相萃取技术主要应用于粗酶提取与回收，也可用于对纯度要求不高的酶制剂的生产； 还可用于其他生物质如核酸、生长激素、病毒的分离和纯化； 如果使用具有高度选择性的亲和萃取技术也可以生产一些纯度较高的酶制剂，如试剂用酶。因为对试剂用酶的纯度要求并很不高，只要没有干扰测定的其他酶就可以使用。优点： 可以应用于胞外酶萃取，也可应用于细胞破碎后的胞内酶萃取。通过控制相系统组成和萃取条件，将细胞和细胞破碎物分配在下相或两相中间，而将目的酶分配在上相，通过简单的离心或相分离，直接将细胞或细胞破

21、碎物除去，回收含有目的酶的上相。然后，改变相组成或条件将酶分配在上相或下相，进行多步分配，反复萃取，达到去除核酸、多糖和杂蛋白，实现提取和纯化目的酶蛋白的目的。 组成双水相系统的水溶性高分子聚合物大多数富含羟基，对酶有保护作用，酶在双水相系统中稳定性好，酶的活性收率较高，萃取过程可以在室温下进行，从而节省了大量能耗。 双水相萃取的放大系数很大，由实验室小试确定的相组成和萃取条件，放大几百倍，甚至几千或几万倍，在较大规模上应用也可以获得较好地重复结果，这在其它的分离纯化技术上是很难做到的。从微生物细胞萃取的酶：表略结果： 42个实例结果表明，在使用双水相萃取技术时，应用最多的还是PEG/盐系统。

22、因该系统的成本相对比较低廉，萃取效果也令人满意； 双水相萃系统的分配系数大约在220之间，平均为9；一次萃取的收率可以达到80100%，平均为92%，纯化倍数达到116倍，平均4倍。二步萃取收率达到7091%，平均为80%，四次分配萃取的收率也达到70%；二步萃取的纯化倍数达到233倍，平均为10倍；二步萃取中的每一步平均纯化倍数为5倍，高于一步萃取；二步萃取收率比一步萃取收率要降低十个百分点，但产物纯化倍数提高了2.5倍。（2）在中草药有效成分分离中的应用 采用PEG6000-K2HPO4双水相体系分离中草药中的黄芩苷和黄芩素,具有疏水性,主要分配于富含PEG的上相,分离上相除去PEG即得产

23、品; 乙醇-K2HPO4双水相体系萃取甘草有效成分的收率高达98.3%; 温度诱导双水相萃取技术从药用植物中担取蜕皮甾族化合物;蜕皮激素和羟基蜕皮激素在50%环氧乙烷和50%环氧丙烷的无规共聚物(UCON-HB-5100)-羟丙基淀粉(PES)温度诱导双水相体系中,两种激素进入富含UCON的上相,移出并诱导升温形成富含激素的水相和浓缩的UCON相.（3）在贵金属分离中的应用 溶剂萃取方法分离的缺点：溶剂污染环境、运行成本高和工艺复杂； 用PEG2000-硫酸铵-偶氮胂（）双水相体系可以将Ti()和Zr()分离； 用PEG-硫酸钠双水相体系可以从碱性氰化液中萃取他离金。4.4.8 批式萃取 双水

24、相萃取，可采用批式的一步萃取法或多步萃取法。最简单的是批式一步萃取。根据对目的产物回收的要求和要达到的分离目的，通过设计和实验确定相组成和条件，在一组由混合器和分离器组成的设备上完成。 将配制的PEG和盐的浓溶液与需要处理的物料，如细胞破碎物或发酵液按一定比例和条件混合均匀，经静置后分相或低速离心分相，回收含有目的产物的上相，弃去含细胞或细胞碎片及其它杂质（如核酸、多糖、杂蛋白等）下相。 若细胞和细胞碎片分配在两相之间，静置法分离困难。用低速离心，若量大，用澄清型碟片式离心机进行连续分离。双水相萃取除细胞或细胞碎片比高速离心法除细胞和细胞碎片使用的离心力要小的多，设备也简单的多。因目的产物在富

25、含PEG的上相中，为回收目的产物，除去存在的PEG，加入适量的盐或盐溶液，构成新的双水相系统，控制相系统组成和萃取条件，使目的酶蛋白分配在富含盐的下相。可以回收目的酶和PEG。 若细胞和细胞碎片分配在两相之间，静置法分离困难。用低速离心，若量大，用澄清型碟片式离心机进行连续分离。双水相萃取除细胞或细胞碎片比高速离心法除细胞和细胞碎片使用的离心力要小的多，设备也简单的多。因目的产物在富含PEG的上相中，为回收目的产物，除去存在的PEG，加入适量的盐或盐溶液，构成新的双水相系统，控制相系统组成和萃取条件，使目的酶蛋白分配在富含盐的下相。可以回收目的酶和PEG。 若细胞和细胞碎片分配在两相之间，静置

26、法分离困难。用低速离心，若量大，用澄清型碟片式离心机进行连续分离。双水相萃取除细胞或细胞碎片比高速离心法除细胞和细胞碎片使用的离心力要小的多，设备也简单的多。因目的产物在富含PEG的上相中，为回收目的产物，除去存在的PEG，加入适量的盐或盐溶液，构成新的双水相系统，控制相系统组成和萃取条件，使目的酶蛋白分配在富含盐的下相。可以回收目的酶和PEG。 利用一步萃取除细胞和细胞碎片十分有效，一般多采用PEG/盐系统，而很少使用PEG/Dex相系统，一方面这样的相系统成本太高，另一方面是细胞和细胞破碎物分配在富含葡聚糖的下相比较困难。 批式一步萃取法在实际上主要适用于不含有细胞或细胞破碎物以及其它颗粒

27、的物料的的分离，如从混合酶制剂中分离或回收某种酶，为了提高萃取的纯化倍数，或回收酶及PEG，大多数至少需要两步，或多步才能够获得有一定纯度和含有少量PEG的产物。 利用亲和分配萃取多采用批式法，例如使用Procion olive MX-3G-PEG(Po-PEG)与葡聚糖组成Po-PEG/Dex亲和分配萃取系统，或由Po-PEG与Procion yellow HE-30-葡聚糖(Py-Dex)组成的Po-PEG/Py-Dex亲和分配萃取系统，进行一步或多步分相萃取，分离纯化葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，纯化倍数可达32倍，酶的收率为65%。双水相系统萃取酶的一般流程图4.4.9 连续萃取为获得高纯度

28、、高收率的产物，提高萃取效率和选择性，设计开发了各种批式和连续式的萃取设备。有几种不同形式的萃取柱，它们的差别在于物料的流动和分配方式的不同。如两相同时逆相流动，或一相静止，另一相流动，以便同时达到混合和相分离，连续萃取的目的。 逆相流动多级萃取柱连续萃取的工艺设备的示意图。在直径为2cm，体积为200ml的萃取柱上，以810ml/min的流速供给两相的浓溶液及与细胞破碎物混合物，用于分离纯化甲酸脱氢酶，过氧化氢酶，细胞C，分离能力可达到2501000mg蛋白质/小时，每天可生产624g酶蛋白。该柱的生产能量并非是在优化条件下进行，因此还有提高的可能。当然，这样的萃取柱的扩大还有许多问题，需要

29、进行进一步的研究。 双水相系统萃取，如果最后一步产物分配在富含PEG的上相中，通常是加入盐，形成新的PEG/盐系统，控制条件，使酶转入含盐的下相，分相回收PEG。含酶下相水溶液还含盐和少量PEG，PEG的存在对于某些用处的酶并无妨碍；除盐和少量PEG，可采用超滤方法。因双水相选用的PEG分子量一般不超过6000道尔顿，若酶分子量为几万道尔顿，可选用截留分子量为1万的超滤膜进行除盐和PEG。但因溶液黏度较高，超滤速度低，往往需要先稀释再超滤，以便提高超滤速度。聚合物的去除： 若提取的酶在于富含葡聚糖的下相中，也可以采用超滤方法，因在PEG/Dex双水相系统中使用的葡聚糖分子量高于4万，超滤可将小

30、于3万分子量的酶分离。 双水相系统的最大特点是对蛋白质的容量高，可达到40g蛋白质/L双水相系统，即使达到100g蛋白质/L，其黏度也比较适当。1000kg的细胞破碎物可生产30kg的蛋白质，只需300L的双水相系统，简单的机械混合和沉降，及液-液分离设备，在10min内就可以完成全过程。大规模应用的可能性: 从小试克量规模直接放大到50kg，放大倍数40,000倍，结果基本与小试一致。说明系统的物质扩散平衡很快。与传统的蛋白质分离技术和方法相比，其速度要快的多，设备简单的多，放大规模几乎无限。 PEG对酶有稳定作用，提取过程可在室温下进行，避免了大体积液体的冷却，节省了能耗。 PEG可回收，至少可以反复使用几次，可降低成本。尽管葡聚糖很贵，用粗制品代替，也可以节约成本，在贵重的临床诊断用酶的分离上可以使用。 双水相萃取技术容易于其它传统方法和技术相连接，组成生产高纯度的酶蛋白质的工艺，由于PEG和葡聚糖无毒，能为微生物降解，在医药和食品工业可以使用。