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1、中南大学生物科学与技术学院分子生物学研究中南大学生物科学与技术学院分子生物学研究中心教 案授课科目: 医学分子生物学授课内容: 疾病产生的分子基础授课对象：临床医学七年制、八年制授课时数：4 学时授课教师：授课地点：湘雅医学院新教学区授课时间：授课教材：医学分子生物学（21世纪高等院校教材），胡维新主编，北京：科学出版社，2007年2月，第一版；医学分子生物学（卫生部8年制规划教材），冯作化主编，北京： 人民卫生出版社，2005，第一版第十一章 疾病产生的分子基础一、目的求：掌握：基因突变的概念、类型及特点。熟悉：基因突变的发生机制；疾病相关基因的研究策略。了解：基因突变与疾病发生；血红蛋白病

2、等常见单基因病的发病分子机制。二、讲授重点： 基因突变的类型及特点。三、讲授难点： 基因突变的分子机制。四、教学方法：多媒体教学、板书五、教 具：多媒体课件、多媒体设备、电子光标笔、粉笔、黑板、教材六、讲授内容： 第一节 基因结构改变引起疾病一、基因结构改变: 在基因的特定DNA序列中，其碱基组成及排列顺序可因机体内外因素的作用发生改变，导致DNA一级结构发生改变，改变基因结构，形成基因突变（mutation）。如果基因突变使蛋白质发生了质的改变，即理化性质、生物化学性质、免疫学性质及生物学功能的改变，或使蛋白质量的改变超过了生理范围，就会导致疾病的发生。基因突变的多种类型：点突变是单个碱基的

3、改变；可分为转换（transition）和颠换（transversion）两种。转换指同类型碱基之间的取代，即一种嘧啶碱基被另一种嘧啶碱基取代或一种嘌呤碱基被另一种嘌呤碱基取代形成的点突变。颠换指不同类型碱基之间的取代，即一种嘧啶碱基被一种嘌呤碱基取代或一种嘌呤碱基被一种嘧啶碱基取代形成的点突变。缺失（deletion）是一个或多个核苷酸的丢失；插入（insertion）是一个或多个核苷酸的增加；倒位是一段核苷酸序列方向倒转：基因内部的DNA序列可发生重组，使一段DNA序列的方向反置，如由原来的53方向排列整段倒置为35方向排列，或一段DNA序列在基因内部位置迁移，使基因结构发生改变，形成的突

4、变称为倒位。 基因突变还分为配子突变与体细胞突变；动态突变指串联重复拷贝数随世代的传递而改变。二、基因突变的遗传效应不同的基因突变引起不同的遗传效应。(1)碱基置换突变(substitution mutation) a. 同义突变 (consense mutation or silent mutation) b. 错义突变 (missense mutation) c. 无义突变 (nonsense mutation) d. 终止密码子突变或延长突变 (terminator codon mutation or elongation mutation) e. 起始密码子突变(initiation

5、codon mutation) f. 非编码序列点突变(point mutation in noncoding sequence)例如：无义突变是突变后产生缩短的多肽键使它所编码的蛋白质发生改变；错义突变：由于一对或几对碱基对的改变而使决定某一氨基酸的密码子变为决定另一种氨基酸的密码子的基因突变叫错义突变。这种基因突变有可能使它所编码的蛋白质部分或完全失活，例如人血红蛋白链的基因如果将决定第6位氨基酸（谷氨酸）的密码子由CTT变为CAT，就会使它合成出的链多肽的第6位氨基酸由谷氨酸变为缬氨酸，从而引起镰刀形细胞贫血病。(2) 缺失或插入突变(deletion or insertion muta

6、tion) a. 密码子缺失或插入(codon deletion or codon insertion) b. 移码突变(frame-shift mutation) c. 整基因或大片段缺失 (deletion of a whole gene or a large segment) (3) 融合突变(fusion mutation) 细胞减数分裂时同源染色体不等交换而致基因间错位配对， 产生两种含不同等位基因的染色体。 (4) 基因突变影响 hnRNA 的剪接基因突变发生在 hnRNA 的一级结构上特定的剪接位点上，导致 hnRNA 的剪接错误，产生异常的 mRNA，最终产生异常的蛋白表达产物

7、，改变生物性状。三、结构基因改变导致蛋白质变化引起疾病： 血红蛋白病的类型、特点与结构基因的变化关系、珠蛋白(globin)基因的时、空特异性表达。血红蛋白结构：1. 血红蛋白是由4条肽链（两个和两个链）组成的。每条肽链都类似于肌红蛋白的肽链，都结合一个血红素。2. 血红蛋白的脱氧（T）和氧合（R）构象在氧的亲和性方面有很大区别。由于结构上的相互作用是与它的三级和四级结构有关，所以血红蛋白在结合氧的过程中显示出别构效应和协同性。3. 人类珠蛋白基因有典型的真核基因结构特点。珠蛋白基因包括已鉴定的8个功能基因、3个假基因及一个新发现的基因。它们在染色体上成簇排列。珠蛋白基因的表达在时空上受到遗传

8、因素的精确调控。 血红蛋白分子一级结构上的轻微差别就可能导致功能上的很大不同，正常成年人血红蛋白中的链的第六位的谷氨酸残基被缬氨酸取代就会导致镰刀形细胞贫血病的异常血红蛋白HbS 的生成。(1) 人-珠蛋白基因簇及珠蛋白基因结构(2) 人-珠蛋白基因簇及珠蛋白基因结构 (按图例讲解) 血红蛋白病类型： 异常血红蛋白: 珠蛋白结构(质)变异，导致贫血。 地中海贫血: 珠蛋白合成(量)减少，又称珠蛋白合成障碍性贫血。 镰状红细胞贫血症是一种常染色体退化遗传病。引起镰状红细胞贫血症的原因就是珠蛋白基因的第6位密码子点突变，即编码血红蛋白链上一个决定谷氨酸的密码子GAG变成了GTG，使得链上的谷氨酸变

9、成了缬氨酸，引起血红蛋白的结构和功能发生了根本的改变（图11-1）。与正常血红蛋白相比，该病患者的红细胞由正常的圆盘形变成了镰刀形。血红蛋白基因上单个核苷酸的替换（AT），恰好使该基因片段丢失了可被限制性内切酶Mst II酶切开的一个位点CCTNAGG序列（N代表四个碱基中的任意一个）。由于基因突变改变了限制性酶切的结果，可用Southern印迹杂交分析方法和限制性片段长度多态性(简称RFLP)分析方法，对镰状红细胞贫血症胎儿进行产前诊断，或对发病家族成员的基因型进行分析。图11-1 镰状红细胞贫血症珠蛋白基因突变方框内突变的核苷酸另常见单基因病如囊性纤维化病(cystic fibrosis,

10、 CF)举例。囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTCR)的基因突变所致，产生缺陷型蛋白，致使使氯离子的转运障碍，黏液在呼吸道黏膜内淤滞，黏膜形成囊性增生，造成呼吸道堵塞；因反复感染，导致患者呼吸衰竭而死亡。发病频率(0.4 )，常染色体隐性遗传；致病基因CFTR；典型症状：进行性肺损伤及其他。Gene therapy of CF：将重组CFTCR基因cDNA-病毒载体，用涂布鼻腔、或喷雾吸入气管及肺部等方法，转入患者呼吸道上皮细胞中，获得正常CFTCR基因的表达，纠正Cl转运缺陷，减少黏液分泌。病理生理变化过程：（如图）四、调控序列变异导致基因表达水平变化基因调控序列也称顺式作用元件，是基因的重

11、要组成部分，虽然其遗传信息不会被表达传递到蛋白质的肽链中去，基因调控序列的突变也不会改变蛋白质的一级结构，但调控序列的突变会改变基因的表达强度，引起蛋白质生物合成量的改变。这种量的改变超过一定的范围，同样会导致蛋白质功能的紊乱，引起相应的疾病。珠蛋白基因转录起始位点上游30（-30）处有TATA盒、-90及-105处有CACACCC序列，它们都是珠蛋白基因的转录调控序列，如TATA盒调控正常的转录起始及其效率。这些调控序列如果发生基因突变，就会使珠蛋白基因的转录效率降低，珠蛋白合成减少，引起-地贫。不仅是调控序列变异能影响基因的表达，使相应蛋白质的合成减少，一些内含子的变异也会影响蛋白质的合成

12、，使体内相应蛋白质含量减少或缺失。第二节 细胞间异常信号导致基因表达异常正常的细胞间信号，能保证基因表达的正常时间特异性、空间特异性以及正常的表达水平。相反，错误的细胞间信号，会破坏基因表达的时间特异性和空间特异性，使胚胎后细胞合成胚胎型蛋白质、或使一种细胞合成另一种细胞特有的蛋白质，还会使基因表达水平过高或过低，这些都会导致疾病的发生。细胞间信号异常导致基因表达异常从而引起疾病：人体各细胞间通过激素、神经递质、旁分泌信号等保持细胞间的联系，调节彼此的代谢。基因表达也受到细胞间信号的调控。例如AFP接受异常的细胞增殖信号成为肝癌发生的重要因素。甲胎蛋白（AFP）是一种具有胚胎时间表达特异性的蛋

13、白质，胚胎发育过程中，AFP的增强子始终处于激活状态,而沉寂子处于抑制状态,因此增强子的信号可以顺利到达启动子启动AFP基因，AFP基因大量表达。AFP具有免疫抑制作用,可以保护胎儿免受母体的免疫攻击。胎儿出生后,沉寂子活化,阻碍了增强子的启动效应,使AFP表达受到抑制。但在异常细胞增殖信号的作用下，c-myc、c-fos和c-jun等癌基因表达异常增加，其表达产物与AFP基因顺式作用元件相结合，激活AFP基因的表达，重新大量合成AFP。大量合成的AFP通过细胞膜上AFP受体介导,影响淋巴细胞或肝癌细胞的肿瘤坏死因子（TNF）家族及其受体的表达,导致肝癌细胞逃避机体免疫监视,同时又能促进癌基因

14、表达,引起肝癌细胞大量生长。可见，由于肝细胞接受了异常的细胞增殖信号，破坏了AFP表达的时间特异性，使AFP在胚胎后肝脏异常表达，在肝癌的发生发展中起着十分重要的作用。再如粉尘刺激的细胞间信号异常导致基因表达异常引起矽肺发生：粉尘刺激 肺支气管上皮、肺泡巨噬细胞 分泌TGF-1成纤维细胞 促细胞分裂和ECM 蛋白基因表达 ECM 增加矽肺发生 可见，矽肺发生的重要分子机制是成纤维细胞获得了异常的细胞间信号，使多种ECM蛋白质基因的表达增强，相应的蛋白质合成和分泌增加，造成ECM在肺组织病理性蓄积，最终形成矽肺。第三节 细胞内因素导致基因表达异常引起的疾病1 基因的表达不仅受基因本身结构和细胞间

15、信号的影响，也受一些细胞内因素的影响，这些影响达到一定的强度或超过一定的范围，或破坏基因表达的时间特异性和空间特异性，或使基因表达水平过高或过低，均可导致疾病的发生。细胞内因素导致基因表达异常引起疾病： 异常的细胞内信号导致基因表达异常引起疾病 高血糖 DAG 激活PKC 激活 ACE Ang 异常的DNA甲基化导致基因表达异常引起疾病DNA甲基化导致基因表达变化是肿瘤形成的重要原因。肿瘤细胞与正常细胞比较，DNA 甲基化模式显著不同。不同的DNA甲基化模式，会产生不同的基因表达谱。基因表达谱失去平衡，就会导致疾病发生，如原癌基因过度扩增、表达异常增强，或/和抑癌基因的“沉寂”，相应表达产物减

16、少甚至消失，都会使细胞增殖平衡受到破坏而引起恶性肿瘤的发生。 hCG5 转录起始区低甲基化非滋养层细胞hCG 受体结合 激活胞内cAMP信号传导途径 调节肿瘤细胞的其他“生长因子、细胞因子”的产生，Tumor 病原生物基因的体内表达导致疾病的三种方式第四节 翻译后加工运输障碍引起疾病在机体细胞内，通过mRNA指导的蛋白质生物合成将基因DNA序列中所含的遗传信息表达于蛋白质中，并通过蛋白质的生物功能体现机体的生命活动。但是，即使没有任何突变、所含遗传信息完全正确，刚刚合成的、未成熟的蛋白质没有生物活性，不能正确地完成其生物学功能。要使新合成的蛋白质具有完整的生物学活性，还需对其进行翻译后加工，其

17、方式包括：除去信号肽、基团修饰、蛋白质的折叠、亚基聚合、运输至发挥功能的靶部位等。其中任何一个环节的障碍，都会使蛋白质功能紊乱，导致疾病的发生。酪氨酸酶是黑色素细胞中催化黑色素生成的限速酶,在黑色素的生成过程中起着关键的作用。酪氨酸酶肽链合成后，需先在内质网进行折叠，再从内质网运输至高尔基体进行糖基化加工,然后由运转囊泡将其转运至黑色素体发挥作用。多种蛋白质（包括酶蛋白）参与了酪氨酸酶的这一成熟及转运过程。所以，不仅酪氨酸酶本身的基因变异会使酪氨酸酶功能紊乱，参与酪氨酸酶成熟和转运的蛋白质基因变异，也可以导致酪氨酸酶不能成熟或不能运输至靶部位，使酪氨酸酶功能紊乱，黑色素合成障碍，导致一些色素病

18、的发生。I型泛发性白化病就是一种色素病,主要表现为眼、毛发、皮肤的色素缺失,易发生皮肤及眼部的肿瘤,由先天性酪氨酸酶基因缺陷引起。变异的酪氨酸酶蛋白在内质网的折叠障碍是I型泛发性白化病的一种重要的分子机制。在酪氨酸酶的成熟及转运过程中，一种被称为P蛋白的蛋白质起着重要的作用。P蛋白是一种含12跨膜结构域的膜蛋白，参与酪氨酸酶蛋白从高尔基体到黑色素体的运输。P蛋白基因突变，会使P蛋白的功能障碍，酪氨酸酶不能正确地转运至黑色素体，导致酪氨酸酶功能紊乱，黑色素合成障碍，引起型泛发性白化病。第五节 蛋白质降解异常引起疾病基因表达及蛋白质合成是影响体内蛋白质含量的重要因素，但不是唯一的因素。蛋白质的降解

19、也是调节体内蛋白质含量的一个重要因素，事实上，是蛋白质的合成及降解之间的相对速度大小或量的多少决定体内蛋白质含量。某蛋白质合成大于降解、则该蛋白在体内的含量增加，反之亦然。一、 哺乳动物体内蛋白质降解有两条基本途径：1 一是溶酶体，主要降解细胞吞入的胞外蛋白质。2 另一条是泛素-蛋白酶体途径（ubiquitin proteasome pathway；UPP），主要降解细胞内泛素化的蛋白质，是细胞质和细胞核内依赖于ATP、非溶酶体途径的蛋白质降解通路,能高效并高度选择性进行细胞内蛋白质降解,尤其降解半衰期短的功能蛋白、癌基因产物和变性、变构蛋白等,应急状态下也降解细胞内结构蛋白。二、 泛素-蛋白

20、酶体途径由泛素(ubiquitin，Ub)、特异性泛素激活酶(ubiquitin- activating enzyme，E1)、泛素结合酶( ubiquitin-conjugating enzyme，E2)、泛素连接酶( ubiquitin ligase，E3) 、蛋白酶体(proteasome) 组成，泛素-蛋白酶体途径是在这些酶的顺序作用下的底物蛋白泛素化过程及泛素化蛋白最后被降解为小肽。三、 在某些有害的环境，如氧化应激、内质网应激和老化过程中，蛋白质会受到损害而发生折叠错误；即使新合成的蛋白质，在翻译后修饰加工过程中，会发生异常裂解。1 泛素-蛋白酶体系统受损，蛋白质从细胞内降解清除，

21、就会使其在细胞内积聚，造成细胞功能障碍、甚至死亡，引起相应的疾病。2 如果该系统功能异常增强，就会使一些正常功能或结构蛋白被降解、导致蛋白质的功能紊乱或细胞结构破坏，引起疾病。一些蛋白质，特别是调节蛋白质，它们在完成功能后，需及时被降解清除，以适应机体代谢或其它功能调节的需要。这些调节蛋白的降解清除，也主要靠泛素-蛋白酶体系统来完成。如果该系统的功能异常，不能及时地降解清除这些调节蛋白，就会使这些调节蛋白持续地发挥作用，失去调节意义，导致机体功能紊乱，引起疾病。举例1：泛素-蛋白酶体系统在维持正常载脂蛋白含量中起着重要的作用，该系统功能障碍，会导致载脂蛋白含量异常。Apo B100内源性甘油三

22、酯及胆固醇代谢中起着重要的作用，并直接参与了血浆LDL 的清除，对维持正常的血浆LDL及LDL-胆固醇（LDL-C）水平具有十分重要的意义。用培养的仓鼠原代肝细胞建立肝脂质代谢模型，发现大约40%新合成的apo B被泛素化并降解；在人的脂蛋白代谢模型中，脂质核心再循环受到限制，原因是部分apo B 通过泛素-蛋白酶体系统被迅速降解。给予蛋白酶体抑制剂ALLN或MG132, apo B的多聚泛素化及降解都受到剂量依赖性抑制，提示蛋白酶体抑制剂可能抑制泛素化的apo B被降解。血浆apo E水平与动脉粥样硬化的敏感性相关,巨噬细胞源性的apo E可清除动脉壁的胆固醇而发挥抗动脉粥样硬化作用。在RA

23、W264.7单核巨噬细胞及HepG2细胞转入泛素使其过表达，结果发现apo E 明显泛素化并降解, 而蛋白酶体抑制剂乳胱素可使apo E降解速率减慢，导致apo E聚集。举例2：阿尔茨海默病（AD）是一种以进行性痴呆为主要临床表现的大脑变性疾病。其病理特征包括老年斑、神经原纤维缠结、海马锥体细胞中颗粒空泡变性及血管壁淀粉样蛋白沉积。研究发现, AD患者脑组织蛋白酶体活性的下降,尤其是在海马、海马旁回、颞上回、颞中回及顶下小叶,且蛋白酶体活性下降与其表达下降不一致,因此认为AD患者脑细胞蛋白酶体活性可能受到抑制。淀粉样蛋白(amyloid protein，) 是细胞外淀粉样斑的主要成分,并存在于

24、神经元内的神经原纤维缠结内,研究发现，可选择性地抑制20S 蛋白酶体糜蛋白酶样活性,且在病理状态下可通过抑制26S蛋白酶体活性来影响泛素依赖性蛋白的降解。可见，泛素-蛋白酶体系统的功能紊乱在AD的发生发展中起着重要的作用。第六节 病原生物基因引起的疾病人体疾病可以由外源性基因，也就是病原生物的感染引起。由于不同的外源性基因各有特点，相应病原生物的生活特性也各不相同，不同的病原生物基因引起人类疾病的机理也各有特点。1 外源性基因通过病原生物的感染进入体内，在人体的特定组织器官表达，病原生物得以生成、繁殖，引起机械或生物学损伤。2 病原生物基因在人体内大量表达，病原生物大量繁殖，与人体争夺营养物质

25、，造成人体营养物质缺乏，引起疾病。3 病原生物基因在人体表达，可产生生物毒素作用于人体细胞，使细胞的一些生理功能或代谢异常，引起疾病。4 病原生物的基因还可以整合到人体基因组中，改变一些基因的结构，或改变机体原有基因表达产物的结构和功能、或改变机体原有基因的表达水平、或引起新的异常蛋白的表达，引起疾病的发生。第七节 疾病分子机制的研究策略针对如此复杂的疾病发生分子机制，对不同的疾病就要采取不同的研究策略。一、通过结构分析确定基因变异在疾病发生中的作用基因结构改变即基因突变是人类疾病发生的重要原因之一。对于由基因结构改变引起的疾病，弄清其发病机制的基本策略是突变基因的结构分析，并通过对突变基因的

26、结构分析找到致病突变。主要方法有：核糖核酸酶切分析、杂合双链分析、化学切割错配、酶促切割错配等。（讲解课件上的图例）1.核糖核酸酶切分析 基本原理: 在一定条件下，异源双链核酸分子RNA：RNA或RNA：DNA中错配碱基可被核糖核酸酶RNase识别并切割，通过凝胶电泳分析酶切片段的大小，即可确定错配的位置。 Watterson et al., J Clin Microbiol (1998) Mutation scanning ； Cleave with RNase 1 and T1 (not RNase A)；Inner promoter primers SP6 and T7； Gel det

27、ection; could include isotope incorporation 缺点： 当RNA探针上错配的碱基为嘌呤时，核糖核酸酶切割效率低甚至不切割； 分析DNA的一条链，突变检出率为 30%；同时分析DNA的两条链，突变检出率为 70%； 需要制备特异性的RNA探针2.杂合双链分析法（heteroduplex analgsis, HA）直接在非变性凝胶上分离杂交的突变型-野生型DNA双链。由于突变型和野生型DNA形成的异源杂合双链DNA在其错配处会形成单链环形突起，在非变性凝胶中电泳时，会产生与相应同源双链DNA不同的迁移率。化学切割错配法（Chemical cleavage o

28、f mismatch, CCM）基本原理：将待测含DNA片段与相应的野生型DNA片段或RNA片段混合变性杂交，在异源杂合的双链核酸分子中，错配的C能被羟胺和哌啶切割，错配的T能被四氧化锇切割，经变性凝胶电泳可确定是否存在突变。 特点： 突变检出率高； 如使用荧光检测系统，灵敏度较高； 可检测长度达 2Kb的核酸片段； 步骤多、费时、有毒； 碳化二亚胺检测法3.酶促切割错配 (enzyme mismatch cleavage ) polymorphisms can be identified by EMC in DNADNA heteroduplexes. T4 Endo nuclease VI

29、I Enzymes cleave adjacent to the mismatch and products are resolved via gel or capillary electrophoresis. the cleavage enzymes often nick complementary regions of DNA as well. ( increases background noise, lowers specificity, reduces the pooling capacity of the assay) 二、基因表达水平分析基因表达分析的主要方法包括Northern

30、印迹杂交法、消减杂交技术、差异显示法、定量RT-PCR、基因表达芯片、基因表达系列分析技术等，在这里主要讨论差异显示法、消减杂交技术和基因表达系列分析技术。1. 差异显示技术(mRNA differential display reverse transcription chain reaction, DDRT-PCR) 指在不同的生长时期、在个体的发育与分化的不同阶段、在生物体对疾病的反应以及不同的环境下调控基因的表达是不同的，这就是基因的差别表达（differential expression）。原理：利用两组特殊的引物对差别表达的基因进行扩增。3端引物：利用mRNA的poly A尾巴设计

31、。根据mRNA结构分析知道，poly A尾巴之前的两个碱基只有12种可能的排列组合：根据这12种排列组合，设计12种不同的引物，这样就将所有mRNA分成了12组。这些引物由1112个T及两个其它的碱基组成，用通式5-T11MN或5-T12MN表示，M为A、G、C的任一种，N为A、G、C、T的任一种。这种引物称锚定引物。5端引物：5端为10个碱基（10-mer）组成的随机引物。每一个随机引物都可能与总mRNA中的某一些分子发生杂交，杂交位点也可能在mRNA的不同位点上。用一种3锚定引物和一种5随机引物进行扩增，可获得50100条100500bp的DNA扩增带。为了要寻找更多的DNA差异带，应使用全部的12种锚定引物以及尽可能多的5随机引物。2. 抑制性差减杂交 (suppressive subtractive hybridization, SSH)基本原理：SSH是差减杂交与PCR结合的快速分离差异基因的方法。运用杂交动力学原理，丰度高的单链DNA退火时产生同源杂交的速度快于丰度低的单链DNA，使不同丰度的单链DNA得到均衡；抑制PCR利用链内退火优于链间退火的优点，使非目的基因片段两端反向重复序列在退火时产生类似发卡的互补结构, 无法作为模板与引物配对，选择性地抑制了非目的基因片段的扩增，从而使目的基因得到富集、分离。方法：提取实验组和对照组