无菌检查法版中国药典电子版.docx

1、无菌检查法版中国药典电子版无菌检查法-2015版中国药典无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、生物制品、医疗器具、原料、辅料、及其他品种是 否无菌的一种方法。若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污 染。无菌检查应在环境洁净度B级背景下的局部A级洁净度的单向流空气区域内或隔离系统中进 行，其全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检 出。单向流空气区、工作台面及环境应定期按医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的 测试方法的现行国家标准进行洁净度确认。隔离系统应定期按相关的要求进行验证，其内部环境的 洁净度须符合无

2、菌检查的要求。日常检验还需对试验环境进行监控。无菌检查人员必须具备微生物专业知识，并经过无菌技术的培训。培养基硫乙醇酸盐流体培养基主要用于厌氧菌的培养，也可用于需气菌培养；胰酪大豆胨液体培养基适 用于真菌和需气菌的培养。培养基的制备及培养条件培养基可按以下处方制备，亦可使用按该处方生 产的符合规定的脱水培养基。配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。制备好的培养基应保存在 225C、避光的环境，若保存于非密闭容器中，一般在 3周内使用；若保存于密闭容器中，一般可在一 年内使用。1.硫乙醇酸盐流体培养基除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微温溶解，调节 pH为弱碱性，煮沸，滤清，加入葡萄糖和刃天

3、青溶液，摇匀，调节 pH值使灭菌后为7.1 0.2。分装至适宜的容器中，其装量与容器高 度的比例应符合培养结束后培2养基氧化层（粉红色）不超过培养基深度的 1/2。灭菌。在供试品接种前，培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的 1/5，否则，须经100C水浴加热至粉红色消失（不超过20分钟），迅速冷却，只限加热一次，并防止被污染。除另有规定外，硫乙醇酸盐流体培养基 置3035C培养。2.胰酪大豆胨液体培养基氯化钠5.0g磷酸氢二钾2.5g胰酪胨17.0g 大豆木瓜蛋白酶消化物3.0g除葡萄糖外，取上述成分，混合，微温溶解，滤过，调节 pH值使灭菌后在25C的pH值为7.3 0.2 ,加入葡萄糖，

4、分装，灭菌。胰酪大豆胨液体培养基置 2025C培养。3.选择性培养基按上述硫乙醇酸盐流体培养基或胰酪大豆胨液体培养基的处方及制法， 在培养基灭菌或使用前加入适宜的中和剂、灭活剂或表面活性剂，其用量同方法适用性试验。4.0.5%葡萄糖肉汤培养基（用于硫酸链霉素等抗生素的无菌检查）胨10.0g 氯化钠5.0g葡萄糖5.0g 水1000 ml牛肉浸出粉3.0g除葡萄糖外，取上述成分混合，微温溶解，调节 pH为弱碱性，煮沸，加入葡萄糖溶解后，摇匀，滤清，调节pH值使灭菌后在25E的pH值为7.2 0.2，分装，灭菌。5.胰酪大豆胨琼脂培养基胰酪胨15.0g 氯化钠5.0g大豆木瓜蛋白酶水解物5.0g

5、琼脂15.0g纯化水1000ml除琼脂外，取上述成分，混合。微温溶解，调节 pH值使灭菌后在25E的pH值为7.3 0.2，加入琼脂，加热溶化后，摇匀，分装，灭菌。6.沙氏葡萄糖液体培养基动物组织胃蛋白酶水解物和胰酪胨等量混合物 10.0g葡萄糖20.0g 纯化水1000mL除葡萄糖外，取上述成分，混合，微温溶解，调节pH值使灭菌后在25E的pH值为5.6 0.2， 加入葡萄糖，摇匀，分装，灭菌。7.沙氏葡萄糖琼脂培养基动物组织胃蛋白酶水解物和胰酪胨等量混合物 10.0g葡萄糖40.0g纯化水1000mL琼脂15.0g除葡萄糖、琼脂外，取上述成分，混合，微温溶解，调节 pH值使灭菌后在25E的

6、pH值为5.6 0.2，加入琼脂，加热溶化后，再加入葡萄糖，摇匀，分装，灭菌。培养基 的适用性检查无菌检查用的硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基等应符合培养基的 无菌性检查及灵敏度检查的要求。本检查可在供试品的无菌检查前或与供试品的无菌检查同时进行。无菌性检查每批培养基随机取不少于5支(瓶)，置各培养基规定的温度培养 14天，应无菌生长。灵敏度检查菌种 培养基灵敏度检查所用的菌株传代次数不得超过 5代(从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代)，并采用适宜的菌种保存技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) CMCC(B) 2

7、6 003铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) CMCC(B) 10 104枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis ) CMCQB) 63 501 生抱梭菌(Clostridium sporogenes) CMCC(B) 64 941白色念珠菌(Candida albicans) CMCC(F) 98 001黑曲霉(Aspergillus niger) : CMCC(F) 98 003菌液制备 接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽抱杆菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨 液体培养基中或胰酪大豆胨琼脂培养基上，接种生抱梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中， 303

8、5C培养1824小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基或沙氏葡萄糖琼 脂培养基一 上, 2025C培养2448小时，上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于 100CFU(菌落形成单位)的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养 物至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上，2025r培养57天，加入35ml含0.05 % (v/v )聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将抱子洗脱。 然后，采用适宜的方法吸出抱子悬液至无菌试管内，用含 0.05 %(v/v )聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含抱子数小于100CFU的抱子悬液。菌悬液在室温下放置应在2小时内使用，若保存在

9、28C可在24小时内使用。黑曲霉抱子悬液可保 存在28C，在验证过的贮存期内使用。培养基接种 取每管装量为12ml的硫乙醇酸盐流体培养基7支，分别接种小于100CFU的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、生抱梭菌各 2支，另1支不接种作为空白对照，培养3天；取每 管装量为9ml的胰酪大豆胨液体培养基7支,分别接种小于100CFU的枯草芽抱杆菌、白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接种作为空白对照，培养5天。逐日观察结果。结果判定 空白对照管应无菌生长，若加菌的培养基管均生长良好，判该培养基的灵敏度检查 符合规定。稀释液、冲洗液及其制备方法稀释液、冲洗液配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。1.0.1%蛋

10、白胨水溶液 取蛋白胨1.0g，加水1000ml,微温溶解，滤清，调节pH值至7.1 0.2， 分装，灭菌。2.pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液 取磷酸二氢钾3.56g，磷酸氢二钠7.23g，氯化钠4.30g，蛋 白胨1.0g，加水1000ml，微温溶解，滤清，分装，灭菌。3.根据供试品的特性，可选用其他经验证过的适宜的溶液作为稀释液、冲洗液 (如0.9%无菌氯化钠溶液)。如需要，可在上述稀释液或冲洗液的灭菌前或灭菌后加入表面活性剂或中和剂等。方法适用性试验当进行产品无菌检查法时，应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的无菌 检查。若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，应重新进

11、行方法适用性试验。方法适用性试验按“供试品的无菌检查”的规定及下列要求进行操作。对每一试验菌应逐一进 行方法确认。菌种及菌液制备 除大肠埃希菌(Escherichia coli ) CMCC(B)4 4102外，金黄色葡萄球菌、枯草芽抱杆菌、生抱梭菌、白色念珠菌、黑曲霉同培养基灵敏度检查。大肠埃希菌的菌液制备同 金黄色葡萄球菌。薄膜过滤法 取每种培养基规定接种的供试品总量按薄膜过滤法过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入小于100CFU的试验菌，过滤。加硫乙醇酸盐流体培养基或胰酪大豆胨液体培养基至滤 筒内。另取一装有同体积培养基的容器，加入等量试验菌，作为对照。置规定温度培养 35天，各试验菌同

12、法操作。直接接种法取符合直接接种法培养基用量要求的硫乙醇酸盐流体培养基 6管，分别接入小于100CFU的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、生抱梭菌各 2管，取符合直接接种法培养基用量要求的胰酪大豆胨液体培养基6管，分别接入小于100CFU的枯草芽抱杆菌、白色念珠菌、黑曲霉各 2管。其中1管接入每支培养基规定的供试品接种量，另 1管作为对照，置规定的温度培养 35天。结果判断 与对照管比较，如含供试品各容器中的试验菌均生长良好， 则说明供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计，照此检查方法和检查条件进行供试品的无 菌检查。如含供试品的任一容器中的试验菌生长微弱、 缓慢或不生长，

13、则说明供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用，应采用增加冲洗量、增加培养基的用量、使用中和剂或灭活剂、更换滤膜品 种等方法，消除供试品的抑菌作用，并重新进行方法适用性试验。方法适用性试验也可与供试品的无菌检查同时进行。供试品的无菌检查无菌检查法包括薄膜过滤法和直接接种法。 只要供试品性质允许，应采用薄膜过滤法。供试品 无菌检查所采用的检查方法和检验条件应与方法适用性试验确认的方法相同。无菌试验过程中，若需使用表面活性剂、灭活剂、中和剂等试剂，应证明其有效性，且对微生 物无毒性。检验数量 检验数量是指一次试验所用供试品最小包装容器的数量。除另有规定外，出厂产 品按表1规定；上市产品监督检验按表

14、 2规定。表1、表2中最少检验数量不包括阳性对照试验的供 试品用量。检验量 是指供试品每个最小包装接种至每份培养基的最小量（g或ml）。除另有规定外，供 试品检验量按表3规定。若每支（瓶）供试品的装量按规定足够接种两种培养基，则应分别接种硫乙 醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基。采用薄膜过滤法时，只要供试品特性允许，应将所有容 器内的全部内容物过滤。阳性对照 应根据供试品特性选择阳性对照菌： 无抑菌作用及抗革兰阳性菌为主的供试品， 以 金黄色葡萄球菌为对照菌；抗革兰阴性菌为主的供试品以 大肠埃希菌为对照菌；抗厌氧菌的供试品， 以生抱梭菌为对照菌；抗真菌的供试品，以白色念珠菌为对照菌。阳性对

15、照试验的菌液制备同方法适 用性试验，加菌量小于100CFU供试品用量同供试品无菌检查时每份培养基接种的样品量。阳性对照 管培养4872小时应生长良好。阴性对照 供试品无菌检查时，应取相应溶剂和稀释液、冲洗液同法操作，作为阴性对照。 阴性对照不得有菌生长。供试品处理及接种培养基操作时，用适宜的消毒液对供试品容器表面进行彻底消毒， 如果供试品容器内有一定的真空度， 可用适宜的无菌器材（如带有除菌过滤器的针头）向容器内导入无菌空气，再按无菌操作启开容器取 出内容物。除另有规定外，按下列方法进行供试品处理及接种培养基。1.薄膜过滤法薄膜过滤法应采用封闭式薄膜过滤器。无菌检查用的滤膜孔径应不大于 0.45卩m直径约为50mm根据供试品及其溶剂的特性选择滤膜材质。抗生素供试品应选择低吸附的滤器及滤膜。滤器及 滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌。使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。水溶性供试液过滤前应先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。 油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥。为发挥滤膜的最大过滤效率，应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。 供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量一般为 100ml，且总冲洗量不得超过1000ml，以避免滤膜上的微生物受损伤。