超临界流体色谱法文档格式.docx

1、s）-1扩散系数D/cm2s-1气体常压（15-60）（0.6-2）10-3（1-3）10-40.1-0.4超临界流体Tc,Pc-Tc,4Pc0.2-0.50.4-0.9（3-9）0.70.2液体（有机溶剂，水，15-60）0.6-1.6（0.2-3）10-2（0.2-2）1.1.2超临界流体色谱法及其特点超临界流体具有液体相似的溶解能力，溶解能力比气体大，能溶解固体物质，这种溶解性质被用于分离过程，最先用于萃取技术-超临界流体萃取法（supercritical fluid extraction, SFE）。后来，将超临界流体用作色谱的流动相，建立了超临界流体色谱法。SFC因其超临界流体自身的

2、一些特性，使得SFC的某些应用方法具有超过液相（LC）、气相（GC）两者的有点，有其独到之处，但它并不能取代这两类色谱，而是它们的有力补充。1.SFC与GC的比较a）SFC可以用比GC更低的温度，从而实现对热不稳定化合物进行有效的分离。由于柱温降低，分离选择性改进，可以分离手性化合物。b）由于超临界流体的扩散系数比气体小，因此SFC的谱带展宽比GC的要窄。c）SFC溶剂能力强，许多非挥发性组分在SFC中溶解度较大，可分析非挥发性的高分子、生物大分子等样品。d）选择性较强，SFC可选用压力程序、温度程序，并可选用不同的流动相或者改性剂，因此操作条件的选择范围较GC更广。2.SFC与LC的比较a）

3、分析时间短，由于超临界流体粘度低，可使其流动速率比高效液相色谱（HPLC）快得多，在最小理论塔板高度下，SFC的流动相速率是HPLC的3-5倍左右，因此分离时间缩短。b）总柱效比LC高，毛细管SFC总柱效可高达百万，可分析极其复杂的混合物，而LC的柱效要低得多。当平均线速率为0.6 cm/s时，SFC法的柱效可为HPLC法的4倍左右。c）SFC的检测器应用广。SFC可连结各种类型的GC、LC检测器，如氢离子火焰（FID）、氮磷检测器（NPD）、质谱（MS）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）以及紫外（UV）、荧光（FLD）等检测器。d）流动相消耗量比LC更低，操作更安全。通常，在SFC中由于极性和

4、溶解度的局限，使用单一的超临界流体并不能满足分离要求，需要在超临界流体中加入改性剂。在SFC中，选择性是流动相和固定相两者的函数，在GC中溶质的保留受流动相压力及其性质的影响较小，故选择性基本上是固定相的函数，在LC中可用梯度洗脱，改变流动相的性质，从而影响溶质的保留。在SFC中流动相的极性也可采用梯度技术（加入改性剂）加以调整，达到与LC同样的梯度效果。同时，SFC中的压力程序（通过程序升压实现流体的密度改变达到改善分离的目的）相当GC中程序升温技术。1.1.3超临界流体色谱法的分类超临界流体色谱根据所用的色谱柱不同可分为两种，用填充柱的称为填充柱超临界流体色谱（packed column

5、supercritical fluid chromatography, pcSFC），用毛细管柱的称为毛细管超临界流体色谱（capillary supercritical fluid chromatography），两者各有所长并已建立了相应的方法和理论，相比较而言，毛细管SFC具有更多优点，但目前填充柱SFC应用更广泛些。超临界流体色谱中的填充柱可使用普通HPLC中的色谱柱，目前已有部分商品化专用于SFC的填充色谱柱。根据色谱过程的用途，也可分为两种，分析型SFC和制备型SFC。分析型SFC主要用于常规的分析。制备型SFC常用超临界二氧化碳作为流动相，由于二氧化碳便宜、环保、安全的特点，而得

6、到广泛应用。而且二氧化碳在常温下易除去，样品的后处理过程较制备型HPLC简单，因此制备型SFC应用广泛，特别是在手性制备的领域。1.1.4超临界流体色谱的发展用超临界流体作色谱流动相是由Klesper等人于1962年首先提出的，他们首先报道了用二氯二氟甲烷和一氯二氟甲烷超临界流体作流动相，成功地分离卟啉衍生物，之后发展了填充柱SFC的技术，用以分离聚苯乙烯的齐聚物。随后Sie和Rijnderder等人又进一步研究了SFC的方法，研究了二氧化碳、异丙醇、正戊烷等作流动相的问题，并以此技术分析了多环芳烃、抗氧化剂、燃料和环氧树脂等样品。60年代末，由于Sie和Giddings等人的卓越工作，解释了

7、SFC在各方面的应用潜力，并于是了SFC的前途极其光明。在这个时间，也是HPLC高速发展的时期，而SFC的发展却不如HPLC那么迅速，这主要是在使用超临界流体时遇到了一些实验方面的问题，所以发展较慢。直到80年代初，SFC才开始焕发出新的光辉，得到了日趋完善的发展。1981-1982年惠普公司在皮茨堡会议上发布了SFC色谱仪，在此期间Berger和Gere等人进行了一系列的研究。此后这一技术得到了迅猛的发展，研究论文数急剧增加，其他科学公司也相继推出了超临界流体色谱的商品仪器。SFC在发展之初，着重于毛细管柱的使用，当时的主要研究者来自于GC领域而非HPLC领域。但是，随后SFC的发展遇到瓶颈

8、，毛细管SFC很难满足药物中极性化合物的分析，而且该技术的一些固有的缺点，仪器条件要求比较高，未能普及应用。此后，填充柱色谱逐渐受到研究者的青睐，它使用与HPLC类似的装置，而且在超临界流体中加入改性剂，增加了流体对化合物的溶解能力，大大增加了SFC的应用对象。近些年SFC的应用主要集中在填充柱SFC上。自SFC技术自上个世纪90年代以来每年发表在SCI上的文章数如图 12所示。图 12 90年代以来SFC在SCI上每年发表文章统计1.1.5超临界流体色谱的一般流程SFC的一般流程如所示。超临界状态流体源（二氧化碳）在进入高压泵之前预冷却，高压泵把液态流体经脉冲抑制器注入在恒温箱中的预柱，进行

9、压力和温度的平衡，形成超临界状态流体，进入色谱柱。要保持整个系统的压力，在泄压口处装限流器或备压控制器，这也是SFC仪器与普通HPLC仪器最大的差别之处。1.2基本原理 SFC的流动相主要采用二氧化碳，一氧化氮和氨气等，其中主要使用二氧化碳作为超临界流体。SFC的固定相可采用固体吸附剂（硅胶）或键合到载体（或毛细管壁）上的聚合物，现在研究比较多的是液相色谱的柱填料。分离机理：吸附与脱附，组分在两相间的分配系数不同而被分离。压力效应：SFC的柱压降大（比毛细管色谱大30倍），压力对分离有显著影响（柱前端与柱尾端分配系数相差很大，产生压力效应）。SFC流体的密度受压力影响显著，在临界压力处具有最大

10、的压力，超过该点，影响小，超过临界压力20%，柱压降对密度的影响较小。超临界流体的密度随压力增加而增加，密度增加提高溶剂效率，色谱峰的出峰时间缩短。1.2.1超临界流体色谱法的基本概念SFC中的一些基本概念，如保留时间（tR）、容量因子（k）、选择性（）、柱效（N）和分离度（R）等参数，其定义和公式同普通的LC和GC。本节简述相对变数和超临界流体的溶剂力。相对变数（reduced variable），是指某一参数与其临界变数之比值，也叫折合变数、归一变数或简化变数，主要有相对压力（Pr）、相对体积（Vr）、相对温度（Tr）和相对密度（r），定义式为 式中分别为临界压力、临界体积、临界温度和临界

11、密度。图 13 各种具有液体密度的压缩气体与液体的溶剂力比较分度表（1 cal=4.1868 J）超临界流体的溶剂力目前还没有一个严格定义，但可给出一个合理的分度表，Gidding认为，溶剂力主要由“状态效应”（如密度、分子间距离等）和“化学效应”（极性、酸碱性、氢键亲和力等）组成，可以用Hildbrand溶度参数（）表示式中，a为分子间引力，V为摩尔体积，为溶度参数，cal/cm3 或者 J/cm3各种流体的溶剂力与液体比较的分度表见图 13所示，由图 13可看出，超临界流体状态二氧化碳的溶剂力与异丙醇（45.22 J/cm3）、吡啶（44.80 J/cm3）相当，即相当于极性较强的溶剂，故

12、可溶解并分析大部分非极性、中等极性样品，一氧化氮的溶剂力（44.38 J/cm3）与二氧化碳相似，当分离需要溶剂力更强的流动相时，可选用氨气（55.27 J/cm3），对于那些不能用二氧化碳来分离的碱性胺类物质，氨是很好的流动相，n-C4和n-C5是非极性流动相，分离非极性样品时选用。1.2.2超临界流体色谱法的速率理论 实验发现，描叙流速对柱效影响的Van Deem特人方程和Golay方程仍适用。1.Golay速率理论毛细管SFC的速率理论模型与毛细管GC相同，其总塔板高度也是由分子扩散、流动相传质、固定相传质三相加和而成，经许多学者验证，Golay涂壁开管柱速率理论方程适合用于毛细管SFC

13、，其方程为式中，Dm为溶质在流动相中的扩散系数，cm2/s；Ds为溶质在流动相中的扩散系数，cm2/s；r为柱内径；df为固定相的液膜厚度，cm；u为流动相的线速度，cm/s；k为容量因子。该方程式指出了操作参数对柱效的影响，当Dm、Ds、k确定后，H-u曲线就成为双曲线，Golay方程可简化为式中，B/u为纵向扩散对塔板高度的贡献；Cmu为流动相传质对塔板高度的贡献；Csu为固定相传质对踏板高度的贡献。2.填充柱的速率方程对填充柱SFC，目前尚未给出一个精确的塔板高度方程。一些研究沿用了普通HPLC中的范式方程，有一定的借鉴意义。方程式为式中，A为色谱柱中多路径效应对塔板高度的贡献；B/u为

14、纵向扩散对塔板高度的贡献；Cu为传质阻力对塔板高度的贡献。Knox给出适合填充柱SFC的折合塔板高度方程，方程式为式中，h和v分别为折合塔板高度和折合线速度；A、B和C为特征常数，其特征值A=1-2，B=2，C=0.05-0.5，而h和v的值在实践中常为3和10。1.2.3影响踏板高度的因素结合速率方程可知，影响踏板高度的因素主要有线速度、柱直径、液膜厚度和密度，对填充柱SFC而言还包括色谱柱的粒径和填充的均匀度。1.流动相线速度对塔板高度的影响 由图 14中曲线的最低点处的线速度即为最佳线速度uopt，对应的塔板高度为最小塔板高度Hmin。在Hmin处，色谱柱有最佳的柱效，但最佳线速度却不是

15、很高。对于SFC，塔板高度随线速度的增加而缓慢增加，特别是在流动相密度较低时，增加更加缓慢，曲线趋于平滑。因此，在实际操作中可采用3-5倍的最佳线速度为操作线速度，从而加快了分析速度。图 14 SFC H-u曲线2.柱径对塔板高度的影响Lee等采用直径为0.25 m，SE-54石英交联柱，研究了柱径对柱效的影响，如图 15所示，最佳线速度反比于柱径，塔板高度则与柱径成正比，降低柱径将导致塔板高度降低，有利于提高柱效。另一方面，柱径还影响压差，在毛细管SFC的实践中，限制使用长柱子的因素之一是通过柱子的压力差。压差是柱长的函数，而反比于柱径的平方。图 16表示了柱径和柱长与压差的关系，柱径小于5

16、0 m显示出较大的压差，这就限制了特细色谱柱的应用。而一般常用的柱压差为3%，这表明柱内径大于50 m时可使用较长的色谱柱而无压差大之虑。事实上，控制线速度的是阻力器，而阻力器产生了约80%的压力差。3.固定相液膜厚度对柱效的影响固定相液膜厚度对塔板高度的影响如所示，对不同k值（k=1-5）组分，液膜厚度在0.25-1.0 m范围变化，对H的影响很小，甚至可用更厚的液膜，这取决于所能允许的分离度的损失，最佳流速随液膜厚度的增加而降低，且曲线更加陡峭。在SFC中可采用比GC更厚的液膜，承受更大的样品容量，以补偿检测器灵敏度的不足。4.流动相密度塔板高度和最佳线速度的影响 在SFC中实际上是流动相

17、的密度而不是压力控制着各种色谱柱参数。密度对塔板高度和最佳线速度的影响如图 18所示。从图中发现，当操作条件一定时，随流动相值增加，最佳线速度在减小，而且曲线变陡。但其H值保持不变，说明程序升密度时并不影响柱效。图 15 不同柱径上的H-u曲线图 16 柱径、k值对柱效的影响图 17 液膜厚度对H-u曲线的影响图 18 流动相密度对H-u曲线的影响1.3超临界流体色谱法的操作条件超临界流体色谱法操作条件根据填充柱和毛细管柱的不同，进而选择适合的操作条件，主要有固定相和液膜厚度、流动相及其线速、压力和密度、柱温和检测室温度，还有柱径、柱长、阻力器和检测器的选择。1.3.1超临界流体色谱的色谱柱不

18、论是毛细管柱还是填充柱，SFC对固定相的要求，首先是抗溶剂冲刷，即在大量溶剂冲淡、加压和减降，体积膨胀和收缩后，稳定性好；其次是化学稳定性好，选择性高，即固定相不与组分发生化学反应，且带有一定基团，呈现出良好的选择性；再次是热稳定性好，使用温度范围较宽。同时固定相的选择也要考虑流动相的性质。1.填充柱虽然在80年代初主要是发展了毛细管SFC，但是填充柱SFC也得到一定的发展。而填充柱SFC色谱柱，几乎使用了所有的反相和正相HPLC键合相填料，固定相有非极性、中等极性和极性，使用最多的是硅胶和烷基键合硅胶，正相色谱填料中的二醇基、腈基、2-乙基吡啶等键合硅胶也有不少应用。在SFC中，流动相的密度

19、对保留值有很大的影响，溶质的保留性能要靠流动相的压力来调节。在填充柱SFC中，由于柱压降很大，比毛细管柱要大30倍，因而在填充柱SFC色谱柱的入口处和出口处，其保留值由很大差别，也就是说在柱头由于流动相的密度大、溶解能力大，而在柱尾则溶解能力变小。但是超临界流体密度受压力的影响在临界压力处最大，超过此点以后影响就不是太大，所以在超过临界压力20%的情况下，柱压降对填充柱SFC结果的影响就不那么明显了。在填充柱SFC中，由于色谱柱的相比（）小、固定相和样品接触和作用的几率比较大，所以要针对所分析的样品很好地选择固定相。在用填充柱SFC分析极性和碱性样品时，常会出现不对称峰，这是由于填料的硅胶基质

20、残余硅羟基所引起的离子作用。如果使用封尾填料制成的色谱柱就会在一定程度上解决这一问题。但是由于基团的立体效应，不可能把硅胶表面所有的硅醇基全部反应。将各种齐聚物和单体处理硅胶，并把这些齐聚物和单体聚合固定化到硅胶表面上。这样就大大改善了色谱峰的不对称现象。在超临界流体色谱的填充柱中也有用微和亚微级填充柱的，填充1.7-10 的填料，内径几个毫米。还有用内径为0.25 mm的毛细管柱填充3-10 m填料的毛细管填充柱。2.毛细管色谱柱在毛细管超临界流体色谱中使用的毛细管柱，主要是细内径的毛细管柱，内径为50 um和100 um。SFC的操作温度比GC低，因此SFC可用的固定相较GC多。但由于SF

21、C的流动相是具有溶解能力的液体，所以毛细管柱内的固定相必须进行交联，并且在老化处理中，加长老化时间，以使液膜牢固。所使用的固定相有聚二甲基硅氧烷、苯甲基聚硅氧烷、二苯甲基聚硅氧烷、含乙烯基的聚硅氧烷、正辛基、正壬基聚硅氧烷等，在手性分离中使用了连结手性基团的聚硅氧烷。在毛细管SFC中，液膜厚度主要受样品的挥发性和检测器灵敏度限制。薄液膜毛细管柱可达快速高效，适合分析非挥发性的样品。但样品容量低、检测器灵敏度要求高。厚液膜毛细管柱，样品容量大，柱效损失小，可接各种检测器，对于一般样品的分析，柱效和柱容量能得到兼顾，应用面广。1.3.2超临界流体色谱的流动相和改性剂1.超临界流体的溶解性能 超临界

22、流体色谱的流动相特点，主要是它在不同压力下有不同的溶解各种样品的能力。溶剂的溶解能力常用溶解度常数来描述。溶解度常数的定义为式中，E是分子的摩尔内聚能；v 是分子的摩尔体积。而和化合物临界参数的关系为式中Pc是临界压力；c是和Pc对应的密度；1是化合物在液态形式下的密度。式中的项称化学效应项，它和分子里内部作用力有关，而项称为状态效应项，它和分子的摩尔体积有关。从方程中可以看出溶解度常数随超临界流体密度的增加而增加。研究经验表明，当两组分的之差的绝对值小于2.04MP1/2时，二者的互溶性就好，或者或二组分的约接近，其互溶性就好。对二氧化碳的超临界流体的可用式计算计算误差约为10%。2.流动相

23、的选择原则SFC的流动相为压缩状态下的流体，有较多的气体或液相可供选择，其选择原则为：临界常数越低越好；对样品有合适的溶解度；化学惰性，不与样品等作用；能与检测器匹配，还需安全不易爆炸；价格便宜，方便易得等。3.常用流动相SFC可以使用的超临界流体列于表 12中。由表可见，二氧化碳的临界温度（Tc）和临界压力（Pc）均较低，且是无毒、化学惰性、热稳定性好且便宜，并能用于大多数的检测器，但样品中含有氨或者氨基时，能发生反应因而不能使用。但是二氧化他并不是SFC理想的超临界流体，主要是它的极性太弱，对一些极性化合物溶解能力差。在表 12中的下半部分是极性的超临界流体。氨也可用作流动相，主要用于碱性

24、化合物，氨能与六氟化硫一起使用，但不能与二氧化碳在一起使用。但是氨的溶解能力太强，不适合于硅胶类固定相，甚至连一些仪器的部件也能溶解。在高压下，正戊烷、二乙醚、甲醇和异丙醇等加热至200时，仍保持稳定，也可作流动相。在实际使用中仍然以二氧化碳为最多。有研究者进行过系统的研究认为：下列常用超临界流体的溶解能力，在相同的压力下其次序为乙烷二氧化碳氧化亚氮三氟甲烷在同样情况下，分离能力按下列次序增加三氟甲烷乙烷早起的萃取研究表明，选择SFC流动相的另一个着眼点是和检测器相匹配，如果使用UV检测器，上述超临界流体均可使用。如果考虑到使用FID，流动相要不可燃，只有二氧化碳、六氟化硫和氙可以使用。氙适合

25、于使用红外检测器，因为它是惰性气体，在检测波段处无红外吸收。另外，SFC/MS联用可用氙作流动相。二氧化碳是一种非极性溶剂，低分子量和非极性化合物可以在超临界二氧化碳流体中溶解，当极性和分子量增加时溶解度就下降。表 13是各种物质在超临界二氧化碳流体中的溶解度。表 12 SFC中使用的超临界流体表 13 一些物质在超临界二氧化碳流体中的溶解度表4.改性剂二氧化碳是最常见的流动相，由于它是非极性溶剂，欲增加其在SFC中队极性化合物的溶解和洗脱能力，常常在二氧化碳中加入少量的极性溶剂。这些改性剂包括甲醇、异丙醇、乙腈、二氯甲烷、四氢呋喃、二氧六环、二甲基酰胺、丙烯、碳酸盐、甲酸和水等。最常用的改性

26、剂是甲醇，其次是其他脂肪醇。在戊烷中加入甲醇或者异丙醇作为阻滞剂以减少吸附效应，使之较纯戊烷在相同时间内可洗脱出更多的组分。在非极性流体中加入适量的极性流体，可以得到降低保留值，改进分离的选择性因子，达到改善分离的效果，提高柱效。这种在流动相中加入改性剂的流动相可称为混合流动相。混合流动相目前研究仍较为活跃。混合流动相的近似临界常数可用Kay法计算式中，分别为混合流动相的近似临界温度和临界压力；分别为纯组分的临界温度和临界压力；YA和YB分别为各组分相应的摩尔分数。对于改性剂的作用机理，进行了大量的研究工作。除了溶质的增加溶解度以外，改性剂还可以起到如下的色谱作用：掩盖了固定相上残留的硅醇基活

27、性基团；改善了流动相与固定相的表面张力。对于中等极性的物质，在超临界二氧化碳中加入一定量的极性有机溶剂便可达到理想的分离目的；而对于强极性的化合物仅加入极性改性剂是不够的。为实现对强极性物质的SFC 分离，在改性剂中加入了微量的强极性有机物（称之为添加剂）成功地分离了有机酸和有机碱。流动相中微量强极性添加剂的加入拓宽了SFC的适用范围。5.流动相的流速流动相的流速是影响分离柱效和分析速度的操作参数。流动相流速选择的原则是快速、高效。由前所讨论，尽管SFC的最低塔板高度很低，但最佳线速度却很小，很难达到快速分析的目的。超临界流体的流速可远大于LC的流速，多采用3-5倍LC流速作为流动相的流速。1

28、.3.3超临界流体色谱的温度1.色谱柱温度色谱柱温度对保留值的影响是复杂的，一般要大于或等于超临界流体的临界温度。Chester研究了柱温和保留的关系，导出了以下的公式式中，k为容量因子；为溶质在流动相中的溶解热；为溶质在固定相中的熔解热；为柱子的相比；R为气体常数；T为热力学温度。式中第1项为类似LC溶解作用对保留的贡献，第2、3项为类似GC挥发作用对保留的。理想的情况，lgk对1/T作图应为直线，但这种情况并不总是存在。一些研究表明，当温度区间范围较小的时候线性关系才成立，因为小的温度范围，超临界流体的密度变化较小，溶解度变化不大。Takeuchi等验证了柱温对芳烃、邻苯二甲酸二烷基酯的影响，并说明了可用正或负温度程序进行分离，柱温也常选择为：对于一般样品分析，柱温应先在高压GC区，在100-125；当没有压力或密度程序时，在恒压下SFC区（100）可利用程序升温提高高沸物的扩散系数、粘度而改进分离。2.检测器温度关于检测器的温度大致分为破坏型和非破