1、大鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF)酶联免疫分析试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用产品编号:CSB-E04570r检测范围:1.56 pg/ml- 100 pg/ml最低检测限:0.39 pg/ml特异性:本试剂盒可同时检测天然或重组的大鼠GM-CSF,且与其他相关蛋白无交叉反应。有效期:6个月预期应用:ELISA法定量测定大鼠血清、血浆、细胞培养上清或其它相关生物液体中GM-CSF含量。说明 l 试剂盒保存:-20(较长时间不用时);2-8(频繁使用时)。l 浓洗涤液低温保存会有盐析出,稀释时可在水浴中加温助溶。 l 中、英文说明书可能会有不一致之处,请以英文说明书为准。l 刚
2、开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质,此为正常现象,不会对实验结果造成任何影响。实验原理用纯化的抗体包被微孔板,制成固相载体,往包被抗GM-CSF抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗GM-CSF抗体、HRP标记的亲和素,经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的GM-CSF呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),计算样品浓度。 试剂盒组成及试剂配制 1. 酶联板(Assay plate ): 一块(96孔)。 2. 标准品(Standard): 2瓶(冻干品)。3. 样品稀释液(Sam
3、ple Diluent): 120ml/瓶。4. 生物素标记抗体稀释液(Biotin-antibody Diluent): 110ml/瓶。5. 辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液(HRP-avidin Diluent): 110ml/瓶。6. 生物素标记抗体(Biotin-antibody): 1120l/瓶(1:100)。7. 辣根过氧化物酶标记亲和素(HRP-avidin): 1120l/瓶(1:100)。8. 底物溶液(TMB Substrate): 110ml/瓶。 9. 浓洗涤液(Wash Buffer): 120ml/瓶,使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。 10. 终止液(Stop So
4、lution): 110ml/瓶(2N H2SO4)。需要而未提供的试剂和器材1. 标准规格酶标仪2. 高速离心机3. 电热恒温培养箱4. 干净的试管和Eppendof管5. 系列可调节移液器及吸头,一次检测样品较多时,最好用多通道移液器6.蒸馏水,容量瓶等标本的采集及保存 1. 血清:全血标本请于室温放置2小时或4过夜后于1000 x g离心20分钟,取上清即可检测,或将标本放于-20或-80保存,但应避免反复冻融。2. 血浆:可用EDTA或肝素作为抗凝剂,标本采集后30分钟内于2 - 8 C 1000 x g离心15分钟,或将标本放于-20或-80保存,但应避免反复冻融。3. 细胞培养物上
5、清或其它生物标本:1000 x g离心20分钟,取上清即可检测,或将标本放于-20或-80保存,但应避免反复冻融。注:标本溶血会影响最后检测结果,因此溶血标本不宜进行此项检测。标本的稀释原则:首先通过文献检索的方式了解待测样本的大致含量,确定适当的稀释倍数。只有稀释至标准曲线的范围内,检测的结果才是准确的。稀释的过程中,应做好详细的记录。最后计算浓度时,稀释了“N”倍,标本的浓度应再乘以“N”。标准品的稀释原则:2瓶,每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml,盖好后静置10分钟以上,然后反复颠倒/搓动以助溶解,其浓度为100 pg/ml,,做系列倍比稀释后,分别稀释100 pg/ml, 50 pg/
6、ml, 25 pg/ml, 12.5 pg/ml, 6.25 pg/ml, 3.12 pg/ml, 1.56 pg/ml,样品稀释液直接作为标准浓度0 pg/ml,临用前15分钟内配制。如配制50 pg/ml标准品:取0.5ml(不要少于0.5ml)100 pg/ml的上述标准品加入含0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中,混匀即可,其余浓度以此类推。生物素标记抗体的稀释原则:临用前以生物素标记抗体稀释液稀释,稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制(每孔100l),实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如10l生物素标记抗体加990l生物素标记抗体稀释液的比例配制,轻轻混匀,在使用
7、前一小时内配制。辣根过氧化物酶标记亲和素的稀释原则:临用前以辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液稀释,稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制(每孔100l),实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如10l辣根过氧化物酶标记亲和素加990l辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液的比例配制,轻轻混匀,在使用前一小时内配制。操作步骤实验开始前,请提前配置好所有试剂,试剂或样品稀释时,均需混匀,混匀时尽量避免起泡。每次检测都应该做标准曲线。如样品浓度过高时,用样品稀释液进行稀释,以使样品符合试剂盒的检测范围。1. 加样:分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100l,余孔分别加标准品或待测样品1
8、00l,注意不要有气泡,加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀,酶标板加上盖或覆膜,37反应120分钟。为保证实验结果有效性,每次实验请使用新的标准品溶液。2. 弃去液体,甩干,不用洗涤。每孔加生物素标记抗体工作液 100l(取1l生物素标记抗体加99l生物素标记抗体稀释液的比例配制,轻轻混匀,在使用前一小时内配制),37,60分钟。3. 温育60分钟后,弃去孔内液体,甩干,洗板3次,每次浸泡1-2分钟,200l/每孔,甩干。 4. 每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液(同生物素标记抗体工作液) 100l,37,60分钟。5. 温育60分钟后,弃去孔内液体,甩干,洗板5次,每
9、次浸泡1-2分钟,200l/每孔,甩干。6. 依序每孔加底物溶液90l,37避光显色(30分钟内,此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度蓝色,后3-4孔梯度不明显,即可终止)。7. 依序每孔加终止溶液50l,终止反应(此时蓝色立转黄色)。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性,底物反应时间到后应尽快加入终止液。8. 用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)。 在加终止液后15分钟以内进行检测。实验备注l 用户在初次使用试剂盒时,应将各种试剂管离心数分钟,以便试剂集中到管底。l 每次实验留一孔作为空白调零孔,该孔不加任何试剂,只是最后加底物溶液及
10、2N H2SO4。测量时先用此孔调OD值至零。 l 为防止样品蒸发,试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内,酶标板加上盖或覆膜。l 未使用完的酶标板或者试剂,请于2-8保存。标准品、生物素标记抗体工作液、辣根过氧化物酶标记亲和素工作液请依据所需的量配置使用。请勿重复使用已稀释过的标准品、生物素标记抗体工作液、或辣根过氧化物酶标记亲和素工作液。l 建议检测样品时均设双孔测定,以保证检测结果的准确性。洗板方法手工洗板方法:吸去(不可触及板壁)或甩掉酶标板内的液体;在实验台上铺垫几层吸水纸,酶标板朝下用力拍几次;将推荐的洗涤缓冲液至少0.3ml注入孔内,浸泡1-2分钟。根据需要,重复此过程数次。自动洗
11、板:如果有自动洗板机,应在熟练使用后再用到正式实验过程中。计算以标准物的浓度为横坐标(对数坐标),OD值为纵坐标(普通坐标),在半对数坐标纸上绘出标准曲线,根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度;再乘以稀释倍数;或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式,将样品的OD值代入方程式,计算出样品浓度,再乘以稀释倍数,即为样品的实际浓度。 注意事项l 底物请避光保存。l 当混合蛋白溶液时应尽量轻缓,避免起泡。l 请每次测定的同时做标准曲线,最好做复孔。l 洗涤过程非常重要,不充分的洗涤易造成假阳性。l 不要用其它生产厂家的试剂替换试剂盒中的试剂。l 一次加样时间最好控制在5分钟内,如标本数量多,推荐使用排枪加样。l 在配制标准品、检测溶液工作液时,请以相应的稀释液配制,不能混淆。l 如标本中待测物质含量过高,请先稀释后再测定,计算时请最后乘以稀释倍数。
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